印迹

高灵敏、高选择荧光传感器的制备及其对硝基芳烃的超痕量检测 特点： 目标物固定，制备荧光传感器。 痕量硝基芳烃爆炸物的检测对于预防恐怖犯罪、维护国土安全和保 护人民生命财产等具有重要意义。基于荧光猝灭的荧光传感器具有 检测方法简单、灵敏度高等优点而备受人们重视。 然而，该类传感器，特别是荧光共轭聚合物薄膜传感器，检测硝基 芳烃蒸气时尚存在一些缺点，硝基芳烃分子在薄膜中扩散困难以及 链与链之间 - 堆积导致的荧光自猝灭等。 另外，任一种缺电子的硝基芳烃都会使富电子的荧光传感器发生荧 光猝灭，致使荧光传感器不能对某一特定硝基芳烃进行选择性分子 识别。 基于以上研究背景，本论文通过 Suzuki 偶联反应、表面分子印迹 技术和一步微波法，设计、制备了多种对硝基芳烃爆炸物，特别是 对某一特定硝基芳烃具有高灵敏度和选择性的荧光传感器。 研究内容主要包括以下几个方面： （1）以纤维素纳米微纤薄膜为载体，通过采用基于 Suzuki 偶联反 应的“grafting to”技术，在纤维素纳米微纤薄膜表面的特定活性位 点（C-6 羧基）上化学键合 荧光共轭聚合物 ，制备了一种新型荧光 传感薄膜。研究表明，该薄膜传感器对硝基芳烃蒸气具有很高的响 应灵敏度，暴露于 2,4-二硝基甲苯（DNT）蒸气中 600s，其荧光猝 灭效率比使用相同共轭聚合物制备的旋涂薄膜的大 3 倍。这是由于 载体的特定反应位点，使共轭聚合物链与链之间形成大量利于 DNT 分子向其内部扩散的孔穴或通道。通过修正的 Stern-Volmer 方程可 知，其“易于扩散孔穴分数”fa 高达 0.97。另外，该荧光薄膜具有良 好的荧光猝灭可逆性和稳定性。 （2）设计并预合成了电子离域性能弱的新型共轭聚合物，与传统共 轭聚合物比较，可以有效降低激子沿离域主链传输引起的非选择性 荧光猝灭。通过表面分子印迹两种技术，分别以 2,4,6-三硝基甲苯 （TNT）和 DNT 为模板分子，制备了 TNT-印迹传感薄膜和 DNT-印 迹传感薄膜。研究结果发现，TNT-表面印迹薄膜在 TNT 蒸气中的 气相 Stern-Volmer 猝灭常数（KSV）远远高于 DNT 和苦味酸 （PA ）蒸气的。同时，DNT-表面印迹薄膜暴露在 DNT 蒸气 （3.710-2s-1）中的 KSV 分别为 TNT 蒸气（ 1.410-3s-1） 、PA 蒸气（1.210-3s-1）中的 26 和 31 倍。常数 KSV 的巨大差异表明， TNT-表面印迹薄膜与 DNT-表面印迹薄膜薄膜对各自的模板硝基芳 烃具有优异的分子识别选择性，其原因在于表面分子印迹的本性。 （3）以柠檬酸和尿素为原料，通过一步微波法制备了水溶性氨基碳 点并用于硝基芳烃水溶液的纳米传感材料。对其传感性能的研究发 现，TNT、 DNT、苯酚、乙醇、丙酮、甲苯和苯甲酸钠对氨基碳点 的荧光强度影响很小，而苦味酸水溶液对氨基碳点具有很高的荧光 猝灭响应。氨基碳点实现对苦味酸水溶液的高灵敏度、高选择性的 检测，其检测限达到了 1M。传感机理研究发现，氨基碳点与苦味 酸之间存在强的静电相互作用，使苦味酸富集到氨基碳点表面，从 而提高了苦味酸对氨基碳点的荧光猝灭效率。 几种基于化学反应的荧光传感器的设计及其在生物标志物检测中的 应用 1. 基于分子内电荷转移(Intramolecular charge transfer，ICT)：设计 1,8-萘酰亚胺为荧光团的比率型 MAO-A 荧光探针 Mito-NG 2. 基于 ICT、FRET 原理，设计萘酰亚胺和罗丹明能量传递平台； 3. 双光子荧光传感器: 生物标志物(Biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚 细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。生物标志物 覆盖一个很广泛的生化实体,例如核酸、蛋白质、酶、糖类、活性分 子以及体内发现的肿瘤细胞。生物标志物常常被用于对疾病的诊断， 以及对药物疗效、毒性等性质的评估。因此，建立准确、灵敏、简 便、特异性的疾病标志物的检测方法将对疾病诊断和治疗起到重要 的作用。 在众多检测技术中，荧光检测法因其具有操作简单、灵敏度高、选 择性好、实时快速分析、时空分辨率高等优点,而被广泛应用于生物 检测分析、光学成像等领域。其中,基于化学反应的小分子荧光传感 器对标志物的识别和特异性诊断已成为研究热点。因此,在本研究中, 我们设计并合成出三例新颖的小分子荧光传感器,分别实现了对 A 型 单胺氧化酶(MAO-A)、硫化氢/一氧化氮以及 -谷氨酰转肽酶(GGT) 等标志物的快速、灵敏、选择性的荧光检测和/或细胞(或活体)成像。 首先，基于分子内电荷转移(Intramolecular charge transfer，ICT) 原理，我们设计并制备了以 1,8-萘酰亚胺为荧光团的比率型 MAO-A 荧光探针 Mito-NG。MAO-A 催化水解断裂探针分子的丙胺基醚键， 使得 1,8-萘酰亚胺 4 号位的取代基由烷氧基变为酚羟基，导致酶促 反应前后探针的荧光光谱性能发生显著的改变。该比率型 MAO-A 荧光传感器具有良好的水溶性、较好的选择性和较低的检测下限 （LOD=0.15g/mL） ；同时，该检测体系还可以在较宽的 pH 值范围 内对 MAO-A 进行检测。 其次，利用萘酰亚胺和罗丹明能量传递平台，基于 ICT、FRET 原理， 我们设计合成了首个能同时识别 H2S 和 NO 的单分子逻辑门荧光探 针 Naph-RhB。该探针与 H2S，NO 和 H2S/NO 响应后具有三组不同 的荧光输出信号模式：“1-0-0”,“0-0-1”和“0-1-1” 。 另外，通过激光共聚焦荧光成像，该探针成功应用于同时识别活细 胞中的 H2S 和 NO。 我们还制备了一种对生物体系中 GGT 具有灵敏和高选择性识别的双 光子荧光传感器 DCM-GA。GGT 催化断裂探针分子的 -谷氨酰酰 胺键，使得双光子激发下的 DCM 分子的荧光得以恢复。该传感器 不仅可以测定来自病人和健康人血清中 GGT 水平，而且还能够对细 胞内源性的 GGT 进行成像。更重要的是，该传感器能够检测和追踪 由药物诱导肝损伤引起斑马鱼中内源性 GGT 水平升高情况。 CdTe 量子点分子印迹复合荧光传感器 的制备及其选择性识别与荧光 检测性能研究 量子点(quantum dots,QDs)是一类准零维纳米晶粒, 因其具有独特的 光电性能，引起了科学界的广泛关注。尤其是在分析检测领域,量子 点作为化学传感器广泛用于检测各种目标物,所建立的荧光分析法已 成为令人满意的分析检测技术。 然而量子点用于荧光检测往往面临着共存物质干扰的难题,尤其对于 结构和性能类似的同类物质检测,其选择性并不明显, 因此量子点荧光 检测的特异选择性还有待于进一步提高,更为牢固与高选择性的构建 方法亟待开发。 分子印迹技术作为一种成熟的技术广泛应用于合成具有特异性识别 位点的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)。所 制备的分子印迹聚合物具有广泛的适用性、良好的可塑性、稳定性 和高选择性等优点,其内部的识别位点能够有选择性地与模板分子结 合,从而实现选择性识别。因此,将分子印迹技术与量子点相结合,制 备得到的复合材料将具备量子点优越的光学性能和分子印迹聚合物 的高选择性,并且能够解决量子点荧光分析法选择性差的问题。迄今 为止,有关量子点分子印迹荧光传感器的制备方法与检测技术都相对 单一,因此,完善高性能量子点分子印迹荧光传感器的制备方法和建立 新型检测方法的研究显得尤为重要。 本论文采用水相 CdTe 量子点为荧光载体,将分子印迹技术分别与溶 胶凝胶聚合技术、反相微乳聚合技术、沉淀聚合技术、溶胀技术和 表面接枝共聚技术耦合制备了硅基量子点分子印迹荧光传感器、聚 合物基量子点分子印迹荧光传感器和双发射量子点比率型分子印迹 荧光传感器;采用透射电子显微镜(TEM) 、傅立叶变换红外吸收光谱 仪(FT-IR)、分子荧光分光光度计和扫描电子显微镜(SEM) 等多种测 试手段研究了量子点分子印迹荧光传感器的形貌、结构、组成和光 学性能;结合荧光识别实验,研究了六种量子点分子印迹荧光传感器对 目标物分子的光学检测行为,详细探讨了选择性识别能力与识别机制。 本论文主要研究结果如下: 1.硅基量子点分子印迹荧光传感器的制备及选择性识别与荧光检测 性能研究 (1)以巯基乙酸(TGA)修饰的 CdTe 量子点为荧光载体, 阿司匹林为模 板分子,3- 氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为功能单体 ,正硅酸乙酯 (TEOS)为交联剂,采用溶胶凝胶印迹聚合技术制备了硅基量子点分 子印迹荧光传感器(CdTeSiO2MIPs),并研究了不同参数对形貌 的影响。利用 tem、ft-ir 和分子荧光分光光度计对 cdtesio2mips 的形貌、组成和光学性能进行了表征。利用分子 荧光分光光度计对其光学稳定性、ph 值影响和反应时间等方面进行 了研究,并确定了最佳检测条件。荧光检测实验表明, cdtesio2mips 对阿司匹林具有较好的识别效果, 荧光强度随着阿 司匹林浓度的增加而降低,且二者成线性关系, 线性范围为 2.0- 50mol/l,检出限低至 0.25mol/l。选择性识别实验表明 , cdtesio2mips 对阿司匹林具有选择性识别能力, 对其他药物则没 有。随后阐述了选择性识别机理:由于聚合层中存在特异性识别位点, 它能够有选择性地绑定模板分子,并最终导致量子点发生荧光猝灭。 此外,cdtesio2mips 还成功应用于人体体液中阿司匹林含量的检 测。 (2)以硫代苹果酸(msa)修饰的 cdte 量子点为荧光载体,aptes 为功能 单体,teos 为交联剂 ,三氟氯氰菊酯(lc)为模板分子, 利用反相微乳法成 功制备了量子点分子印迹荧光传感器(cdtesio2mips)。利用 tem、 sem、 ft-ir 和分子荧光分光光度计等表征手段研究了 cdtesio2mips 的形貌特征、结构组成和光学性能。荧光检测实 验证明了 lc 能够使 cdtesio2mip 荧光强度发生猝灭,并且在 5.0- 60mol/l的浓度范围内存在线性关系。选择性识别实验说明了 cdtesio2mip 对 lc 有明显的选择性识别能力。最终所建立的分 析方法成功应用于实际水体中 lc 浓度的检测。 2.基于可聚合表面活性剂修饰的量子点分子印迹荧光传感器的制备 及其选择性识别与荧光检测性能研究 (1)利用了十八烷基二甲基苄基苯乙烯氯化铵(ovdac)作为表面活性 剂,将水相 cdte 量子点成功修饰 ,使其保持良好的荧光性能, 并将其转 移到有机溶剂中。然后以 ovdac 修饰的 cdte 量子点为荧光载体, 丙 烯酰胺(am)为功能单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)为交联剂,lc 为模板分子,利用沉淀聚合法制备了量子点分子印迹荧光传感器 (mips-ovdac/qds)。通过 tem、ft-ir 和分子荧光分光光度计研究了 mips-ovdac/qds 的形貌特征、组成和光学性能。研究发现不同参数 会影响分子印迹荧光传感器的形貌。在最佳的检测实验条件下,通过 荧光检测实验证明了 mips-ovdac/qds 对 lc 的检测能力, 建立了用于 lc 浓度检测的新方法,得到该方法的线性范围为 0.1-16mol/l,相关系 数为 0.9989,印迹因子为 5.99。选择性对比实验表明,mips- ovdac/qds 对 lc 具有明显的特异选择性识别能力。此外,mips- ovdac/qds 成功应用于实际水样中 lc 的检测。 (2)以 ovdac 修饰的 cdte 量子点为荧光材料,随后将其与联苯菊酯 bi(模板分子)和聚苯乙烯 (ps)微球分散于氯仿中,然后通过超声分散转 移到水中,最后通过一步溶胀封装技术,制备得到量子点分子印迹荧光 传感器(mips-ovdac/qds)。利用 tem 和分子荧光分光光度计研究了 mips-ovdac/qds 的形貌特征和光学性能。同时 ,利用紫外和红外等手 段研究了 bi、量子点和 ps 微球三者之间的作用关系, 研究发现范德 华力和疏水作用力为主要作用方式。荧光检测实验结果表明,mips- ovdac/qds 与 bi 结合后,荧光强度在 25min 内明显减弱,并且在 0.5- 40mol/l浓度范围内呈现良好的线性关系 ,检测限低至 0.08mol/l且 印迹因子高达 4.11。选择性识别实验证明了其优异的选择性识别能 力,并且所建立的分析方法成功地应用于蜂蜜样品中 bi 浓度的分析测 定。研究发现与其他分子印迹荧光传感器相比,mips-ovdac/qds 具有 明显的不同之处:首先,采用 ps 微球作为聚合物基质并且提前制备出 来;其次,相互作用不是常见的氢键和共价键作用,而是范德华力和疏 水作用力;第三,水相量子点通过使用阳离子表面活性剂成功地应用于 溶胀过程。 3.双发射量子点比率型分子印迹荧光传感器的制备及其选择性识别 与可视化检测性能研究 (1)首先利用反相微乳法将红色荧光量子点(r-qds)包埋入硅球中,并 修饰乙烯基,随后以其为载体,ovdac 修饰的绿色荧光量子点(g-qds) 为辅助单体,四环素(tc)为模板分子,am 为功能单体 ,egdma 为交联剂, 乙腈为溶剂,利用沉淀聚合法制备了双发射量子点比率型分子印迹荧 光传感器(mips-g/r-qds)。利用分子荧光分光光度计、tem 和 ft-ir 等 表征手段研究了 mips-g/r-qds 的形貌、组成和光学性能。荧光识别 与可视化检测实验证明了该比率型分子印迹荧光传感器对于 tc 的检 测不仅具有高选择性,而且还具有高灵敏度,得到的线性检测范围为 10-160mol/l,检测限为 0.35mol/l。探讨了选择性识别与可视化检 测机理,即当测试溶液中加入 tc 时,硅球内部的 r-qds 保持稳定作为参 考背景,聚合层中的 g-qds 为信号响应单元,印迹聚合层中的印迹位点 选择性结合 tc,并引起 g-qds 荧光强度发生猝灭,从而导致测试溶液发 生从绿色到红色的颜色变化。 (2)以乙烯基修饰的 r-qdssio2 为载体,ovdac 修饰的 g-qds 为辅助 单体,4- 乙烯基苯硼酸(vpba)为功能单体,n,n-亚甲基双丙烯酰胺 (mbaam)为交联剂,利用表面接枝共聚法水相制备了葡萄糖印迹的双 发射量子点比率型分子印迹荧光传感器(MIPs-g/r-QDs)。采用 TEM、 FT-IR 和分子荧光分光光度计等测试手段研究了 MIPs-g/r- QDs 形貌特征、组成和荧光性能。荧光识别与可视化检测实验证明 了在最佳检测条件下,MIPs-g/r-QDs 对葡萄糖的检测能力。得到的线 性检测范围为 0.05-1.6 mmol/L,检测限低至 1.75mol/L,并且有着明 显的视觉检测效果。选择性识别与可视化检测实验结果表明该比率 型分子印迹荧光传感器对葡萄糖具有特异选择性识别能力和可视化 检测能力,揭示了其识别机理,即利用功能单体 VPBA 通过硼酸基团 和顺式邻二羟基化合物的化学作用选择性结合葡萄糖分子,并导致 g- QDs 荧光强度降低,从而使得测试溶液发生持续性颜色变化。此外, 制备的比率型分子印迹荧光传感器成功应用于人体血清中葡萄糖的 分析测定。 总之,本论文成功将量子点荧光材料与分子印迹聚合物相结合制备了 六种量子点分子印迹荧光传感器。不仅研究了几种制备方法所得产 物的形貌,而且还巧妙解决了水相量子点参与自由基聚合会发生猝灭 的难题，并以不同的作用方式（氢键作用、范德华力与疏水作用力 和共价键作用）实现了选择性识别与可视化检测。所制备的复合型 荧光传感器兼具量子点荧光传感器的高灵敏性和分子印迹聚合物的 高选择性。二者的有效结合为功能材料制备、荧光检测和环境分析 等领域提供了一个全新的概念和极具吸引力的想法,同时还丰富了复 合荧光传感器的制备体系和分子印迹聚合物的应用范围。 水溶性化学传感器体系的制备及其在荧光检测中的应用 很多阴阳离子和生物分子在环境和生物领域起着非常重要的作用,设 计合适的荧光化学传感器实现对这些物质的检测是当今研究的热点。 由于不需要加入有机溶剂助溶,水溶性荧光传感器体系可以排除溶剂 因素对检测结果的干扰,并且大大降低检测体系的生物毒性, 因此具有 较好的应用前景。 本研究分别用中性亲水聚合物、两性离子化合物和聚电解质三种改 性基团制备了水溶性荧光传感器体系,并成功实现了对一些重要的离 子和生物分子的定量检测。 首先,应用中性亲水聚合物聚乙二醇(PEG)制备了荧光增强型化学传 感器,在纯水介质中检测氟离子。PEG 赋予了检测体系良好的水溶性 和生物相容性；叔丁基二苯基硅烷基团通过共价键连接到荧光素基 团上，有效地淬灭了化学传感器的荧光。当探针溶液中加入氟离子 时,由于氟离子特异性打断 Si-O 化学键使荧光素基团的分子结构得 以恢复,在可见光激发下荧光强度显著增强。探针对氟离子具有很快 的响应速度,并且相对其它阴离子对氟离子有很高的选择性。探针对 氟离子的检测下限为 19 ppb。探针体系可以准确地检测实际样品, 如 自来水、尿液和血清中的氟离子含量。按照美国药典和 ISO10993-5 的标准,此探针属于 I 级毒性标准。探针可以用于追踪 He La 和 L929 细胞内在的氟离子含量变化。 其次,我们设计合成了水溶性、低毒、高灵敏度的硫离子荧光传感器。 强吸电子基团 2,4-二硝基苯磺酸酯连接到荧光素上，使荧光素的荧 光淬灭，硫离子的加入可以特异性地切断 2,4-二硝基苯磺酸酯键， 使体系的荧光明显增强。探针可以透过细胞膜，检测和成像活细胞 内的硫离子，也可以检测实际样品中硫离子的含量。 再次,由于两性离子化合物甜菜碱具有水溶性好、生物毒性低等优点, 我们以磺酸根甜菜碱为亲水基团合成了一种快速响应的荧光增强型 硫离子探针。探针由螯合剂和铜离子两部分组成,螯合剂选用具有三 脚架分子结构的三乙基四胺作为骨架,连接一分子的荧光素和两分子 的磺酸根甜菜碱。由于铜离子对荧光素有很强的淬灭作用,螯合剂- Cu(II)络合物构成的探针体系表现出很低的荧光强度。同时由于硫离 子与铜离子具有更高的结合常数,可以生成稳定的化合物 Cu S,因此 当硫离子加入探针溶液时,络合物中的铜离子会被夺出, 使铜离子对荧 光素的淬灭效果减弱,荧光强度明显增强。甜菜碱的引入和可以紧密 络合铜离子的三脚架型螯合剂结构的选用,使探针体系表现出良好的 水溶性和极低的细胞毒性,并且探针可以透过细胞膜成像活细胞内的 硫离子。相对于其他阴离子,探针体系对硫离子有很高的选择性。探 针对硫离子的检测下限为 1.1?M,并且可以用于检测实际样品,如自来 水中硫离子的含量。 最后,根据阳离子聚电解质与带有负电荷的小分子化合物之间的静电 相互作用原理,我们设计合成了首个检测碱性磷酸酶的荧光比率型探 针体系。检测体系由两种组分构成:甜菜碱改性的聚乙烯亚胺和带有 负电荷的芘衍生物(Py-P)。芘衍生物中含有可对碱性磷酸酶响应的 脂肪族磷酸基团。当溶液中不存在碱性磷酸酶时,检测体系由于 Py- P 静电吸附并聚集在阳离子聚电解质周围,表现出激基缔合物的荧光; 当溶液中加入碱性磷酸酶时,Py-P 的磷酸基团由于酶解反应被脱去, 破坏了静电相互作用,使体系表现出芘的单体荧光。检测体系在纯水 介质中对碱性磷酸酶的检测下限为 0.1 U/L。此探针体系还可以用于 检测生物样品,如人血清中的碱性磷酸酶含量。这种设计探针的思路 可以为设计其他生物分子的荧光比率型检测体系提供新的有效的方 法。 荧光传感器体系的构建及其在几种重要生命物质检测中的应用 某些生命物质在生物体中起着重要作用,其含量的变化对生命活动具 有重大的影响;因此,对这类物质的检测、监控和实时成像,在生理学 和病理学研究中极具意义。 在本文中,针对几种代表性的生命物质,选择合适的机理,设计并制备 了四种荧光传感器,实现了对硫离子(S2-)、-谷酰胺转肽酶(GGT)及 碱性磷酸酶(ALP) 的便利、灵敏检测和细胞(或活体)成像。 首先,针对硫离子,我们制备了利用配体分子改性的碳点(CD-S)作为 探针前驱体,与铜离子(Cu2+)形成络合物并淬灭 CD-S 的荧光,作为检 测 S2-的荧光增强型探针。由于 S2-与 Cu2+之间有很高的结合能力, 会夺取探针中的铜离子而生成稳定的 CuS(Ksp=3.6310-36);由此脱 除了 Cu2+的碳点的荧光得以恢复,该探针对硫离子的检测下限达 0.78M。该 CD-S/Cu2+探针具有良好的水溶性、生物相容性、选 择性和灵敏度,可以成功用于自来水中硫离子浓度的检测和活细胞中 硫离子的检测、成像。 其次,我们设计并合成了检测 -谷酰胺转肽酶(GGT)的荧光探针 Glu- TPE;作为四苯乙烯衍生物,探针 Glu-TPE 具有 聚集诱导发光(AIE) 效 应;分子中的两个 -谷酰胺基团使得探针 Glu-TPE 具有良好的水溶 性与生物相容性;由于 GGT 催化探针 Glu-TPE 分子中 -谷酰胺基团 的水解,疏水性的酶解产物聚集诱发 AIE 效应而发出蓝色荧光 ,从而 实现对 GGT 的增强型荧光检测。基于 GGT 酶促反应的专一性和高 效性,探针 Glu-TPE 具有良好的选择性和灵敏性; 能够用于对人血清 样品中 GGT 含量的检测和 A2780 细胞中內源性 GGT 的检测、成 像。针对 GGT 的检测,我们还制备了另一种基于分子内电荷转移 (ICT)机理的荧光探针 PEG-NA-Glu;当探针分子 PEG-NA-Glu 中 - 谷酰胺基团被 GGT 催化水解后,在这种 ICT 发光机理的荧光团中, 电 子供体的电子云密度发生变化,进而导致荧光发射波长的变化, 由此实 现了对 GGT 的比率型荧光检测。探针 PEG-NA-Glu 具有高灵敏度 和生物相容性,其检测下限为 0.76 U/L,可用于尿液和血清中检测 GGT 含量,且比 ELISA Kit 方法操作简便很多; 并成功地实现了对活 细胞内的 GGT 的双色荧光成像。 再者,针对碱性磷酸酶(ALP)，我们利用萘二甲酰亚胺衍生物的 ICT 荧光机理，设计并制备了探针 AO-NA-P;ALP 催化探针分子 AO-NA- P 的脱磷酸反应,使得探针中萘环 4 号位上的供电子基团发生变化, 其 结果增强了荧光分子的“推-拉” 电子效应, 荧光发射波长红移; 基于此原 理成功实现了对 ALP 的比率型荧光检测。由于 ALP 催化水解反应 具有专一性和高效性,探针 AO-NA-P 具备高灵敏性和选择性,探针对 ALP 的检测下限达 0.38 U/L;另外,探针分子 AO-NA-P 具有极好的水 溶性和生物相溶性;可用于人血清样品、活细胞、活体中的 ALP 检 测。我们首次实现了活体(斑马鱼)内 ALP 的比率型荧光成像, 对斑马 鱼内药物引致器官损伤而引发的 ALP 含量升高进行了成像和检测。 相关结果可为研究器官损伤而引发的生命物质变化提供了有益的参 考。 基于量子点的荧光生物与化学传感器及其食品安全快速检测应用 食品安全是全球公共性卫生安全问题,直接关系民生。近年来, 食品安 全恶性事件频发,食品安全问题逐渐成为社会焦点。在全球范围内, 由 食品安全引起的问题和疾病,不仅造成严重的经济损失, 而且极大地危 害了人们的生活健康水平,因此研究食品安全快速、准确的检测方法, 以预防和控制危害事件的发生,具有重要的现实意义和社会价值。 生物与化学传感器,是一个活跃的科学研究和工程技术领域, 它共享生 物学、化学、免疫学、物理学、电子学、材料学、信息学、以及微 机电系统(MEMS) 等学科,处在生命科学和信息科学的交叉区域。生 物与化学传感器具有高选择性、高准确性、分析快捷、操作简单等 优点,是一种先进的检测技术与方法。作为常用的光学检测手段之一, 荧光检测灵敏、快速、便捷,检测仪器设备成熟, 已被广泛应用于各类 检测方法和仪器设备的科研开发中。 纳米材料发展于 20 世纪 80 年代,具有独特的物理化学特性与广阔的 应用前景,因而享有广泛美誉。纳米技术与材料应用于生物传感器的 研发,将带来新的发展契机,创造更为广阔的应用空间。 量子点(Quantum Dots, QDs)是一种新兴的纳米发光材料, 常作为荧 光标记物被广泛用于生物传感和细胞成像；同时它又是一种半导体 的纳米晶粒,由于其具有独特的性质,比如尺寸可调、光学信号强、荧 光量子产率高、光学性质稳定等,近年来在生物传感领域备受青睐。 本论文将纳米技术与光学检测传感技术相结合,开发新型的生物化 学传感器,综合运用各学科不断进步的技术优势以提升其性能, 并应用 于食品安全快速检测领域。 本文主要研究内容、结果和结论如下： (1)用于快速检测食用油掺假的功能化水溶性量子点荧光淬灭传感器 针对劣质食用油掺假问题，特开展利用纳米生化传感检测的方法,对 其进行快速鉴别。选用量子点作为纳米荧光探针,当加入被测物一“地 沟油”勾兑的劣质食用油时,被测物中某些成分如重金属离子、有机小 分子、碳碳共轭双键(C=C) 、吸电子基团、自由基等(淬灭剂) 可以淬 灭量子点的荧光。不同掺杂比例的劣质食用油中含有不同浓度的淬 灭剂,从而引起不同程度的荧光淬灭,宏观上表现出不同的荧光强度, 由此建立淬灭率与劣质食用油中“地沟油”掺杂比例之间的定量关系。 模拟人工勾兑方法,将毛“地沟油”以 0.4、2 、6 、10% 的比例掺入某 合格食用植物油中,配制成不同掺杂比例的劣质食用油, 然后用量子点 荧光淬灭法鉴别劣质食用油。结果发现劣质食用油对量子点荧光的 淬灭率随着其掺杂浓度的增加而增大。将不同劣质食用油对量子点 荧光的淬灭率与掺杂比例作图,可以发现两者之间呈现较好的线性关 系(y=5.96x+14.99；R2=0.94)。因此,该基于功能化水溶性量子点荧 光淬灭传感器可在 2 min 内对掺假 0.4%及以上的劣质食用油进行快 速鉴别,具有很大的现场应用前景。 (2) 用于快速检测禽流感病毒的基于 DNA 智能响应水凝胶的荧光适 配体传感器建立了一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒 H5N1 的荧光适配体传感器。选择对禽流感病毒 H5N1 具有高亲和 力的 DNA 核酸适配体作为生物识别元件 ,通过对其 5末端修饰丙烯 酰胺基(Acrydite), 对其 3末端修饰修饰荧光淬灭基团 Iowa Black(?) RQ,进行功能化修饰；针对性设计可与核酸适配体序列互补的单链 DNA1 和单链 DNA2,并在单链 DNA1 的 5末端修饰丙烯酰胺基, 在单 链 DNA2 的 5末端修饰荧光量子点；丙烯酰胺基修饰的 DNA 链在 引发剂的催化下能够聚合形成含有多条 DNA 支链的聚丙烯酰胺链； 核酸适配体与单链 DNA1 之间的碱基互补配对发挥了交联剂的作用, 使两种聚合物链相互连接,从而形成水凝胶；当不存在目标病毒时, 由 于 DNA 链之间的杂交作用 ,凝胶处于收缩状态, 量子点由于距离淬灭 剂很近其荧光被淬灭；而当存在目标病毒时,适配体与目标病毒的结 合导致 DNA 链之间的杂交被分解 ,使得凝胶溶胀, 造成量子点与淬灭 剂之间的距离增大,从而量子点荧光被恢复。结果表明该荧光适配体 传感器的检测时间小于 30min,最低检测限为 0.2 HAU,线性范围为 2-2.3 to 26 HAU/20L-1。因此,所研究的简便、廉价、高特异性的 适配体传感器在现场快速检测禽流感病毒 H5N1 中具有较大的应用 前景。 (3)用于同时检测四种食源性致病菌的结合免疫纳米磁分离的荧光生 物传感器及便携式荧光生化快速检测仪的现场应用在食源性致病菌 的检测中,同时检测多元细菌具有很大的需求和发展潜力。 本课题结合免疫纳米磁分离技术作为样品分离和富集手段,利用纳米 荧光量子点作为荧光信号报告分子,研究了一种快速、专一的可同时 分离和定量检测大肠杆菌 O157：H7、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门 氏菌和金黄色葡萄球菌等四种食源性致病菌的荧光适配体传感器。 本文采用可查文献中粒径最小(25 nm)的纳米磁珠, 其分别交联四种 特异性抗体后可在 45 min 内从复杂食品基质中同时捕获四种目标细 菌,并在磁场作用下实现同时分离。将四种不同的链霉亲合素修饰的 量子点分别交联上生物素化的特异性核酸适配体,用于对目标细菌的 荧光标记。通过便携式荧光光谱仪读取荧光信号,从不同的荧光发射 波长可以定性地判断不同的目标细菌,而从荧光强度则可定量反应多 种目标细菌的浓度,从而实现同时检测。扫描电子显微镜和荧光共聚 焦显微镜用于表征免疫磁珠捕获到的细菌和“磁珠- 细菌-量子点” 的 “三明治” 结构。通过有限元分析,模拟了磁场的特性,并建立了免疫磁 珠捕获细菌进行磁分离的数学模型。结果表明,对大肠杆菌 0157：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的磁 分离效率分别达到 90.4%、87.5%、92.0%和 92.0%,在纯培养物中 的方法检测限分别达到 80、100 、47 和 160 CFU/mL,在牛肉样品中 的方法检测限为 320、350、110 和 750 CFU/mL。 本文研究的适配体荧光传感器能够在 2.5 h 内对 10至 104 CFU/mL 的四种食源性致病菌进行同时分离富集和定量检测,展示了该技术在 致病微生物多元检测现场应用中的极大潜力。另外,针对沙门氏菌、 大肠杆菌、李斯特菌等常见食源性致病菌,选取具有高度特异性和灵 敏度的抗体制备生物传感材料,结合免疫纳米磁分离技术, 利用所研究 的可同时快速分离和检测多元食源性致病菌的荧光生物传感方法,对 食品中常见的致病菌进行检测,验证了合作单位研制的病原菌检测用 便携式荧光生物传感检测仪器的可行性。纳米磁珠分别交联三种特 异性抗体后可同时捕获目标细菌,在磁场作用下实现同时分离。将分 离物分别标记上三种偶联有抗体的荧光量子点,即可进行荧光信号的 读取,从而实现了对多种目标细菌的同时快速检测。采用该仪器检测, 总检测时间(定义为取样前期处理一直到测定结果读出的时间总和) 少于 60 min。应用此技术,可实现肉品、蔬菜、水产品等食品在物流 与销售过程中的现场、在线监测和快速预警,将有效避免致病菌感染 等危险食品安全事件的发生,有效提高食品安全水平。 新型荧光碳基纳米点、贵金属簇的制备、表征及其传感应用研究 荧光碳基纳米材料和贵金属合金纳米簇（NCs）作为两种新型的荧 光纳米材料,具备与半导体量子点相似的光致发光性能, 且同时兼有化 学稳定性和优良的化学生物兼容性,因此,它们是潜在可以取代半导体 量子点的最佳选择。然而,对于广大的科研工作者而言, 它们的制备与 应用还具有一定的挑战性,主要表现在以下两个方面：（1 ）所合成 组份单一的荧光碳基纳米材料或者贵金属 NCs 的荧光量子产率 （QY）一般都比较低,这将不利于荧光传感器的构建。 （2 ）由于荧 光碳基纳米材料表面基团的不确定性和缺乏多样性,其应用范围仍然 受到一定的限制。因此,如何充分利用荧光碳基纳米材料和贵金属合 金 NCs 优良的光学性质 ,将其应用到更广泛的领域还需要做进一步 研究。 本文主要从氧掺杂荧光碳基纳米带和贵金属合金 NCs 的制备出发, 研究其独特的物理化学及光学性质,最终将其应用于环境及生物小分 子的分析检测中。 本论文的内容主要包括四个部分,概括如下： 1、基于牛血清白蛋白（BSA）包裹的核-壳 AuAg NCs（按参考 文献制备）荧光淬灭效应定量分析检测环境中的硫(S 2-)离子。这主 要是因为 S2-离子可以与 AuAg NCs 表面上的银离子或原子发生 共价键合作用而形成 Ag-S 共价键,最终在其表面形成了 Ag2S 沉淀 而使其荧光淬灭。依此,我们构建了一种免标记的、简单的、快速的、 高灵敏检测环境中 S2-离子的新方法。在优化实验条件下,核-壳 AuAg NCs 的荧光淬灭效率与 S2-离子浓度在 0-700M范围内呈 现良好的线性关系。同时,我们也可以根据不同浓度的 S2-离子对核- 壳 AuAg NCs 荧光强度的淬灭程度不同, 成功实现对环境中 S2-离 子的半定量分析检测。 2、基于核-壳 AuAg NCs 的荧光淬灭特性构建简单的、无标记的、 快速的荧光传感器定量检测生物硫醇。该传感器是建立在巯基基团 （-SH）能与 AuAg NCs 表面的银离子或原子之间发生较强的特 异性结合反应,最终会使 AuAg NCs 的荧光强度发生改变的基础上,当 往 AuAg NCs 溶液中加入一定浓度含巯基的氨基酸 后, 由于巯基与 AuAg NCs 之间可以通过强烈的 Ag-S 键而形成没有荧光的金属螯 合物,最终导致 AuAg NCs 的荧光发生淬灭。故此，我们可以构建 一种无标记的、简单的、快速的检测巯基氨基酸的新方法。在优化 实验条件下,我们根据逐渐加入半胱氨酸（Cys）能使 AuAg NCs 荧光强度逐渐淬灭的现象,得到检测 Cys 在 0.02-80.0M范围内与 AuAgNCs 的相对荧光淬灭强度（Fo-F）/Fo）呈现良好的线 性关系,且最低检测限（LOD）达到了 5.87nM（3a） 。在相同的实验 条件下,我们对谷胱甘肽（GSH）也进行了定量分析检测实验,结果 显示 GSH 在 2.0-70.0M范围内与 AuAg NCs 的（Fo-F）/Fo 呈 现良好的线性关系,最终检测 GSH 的 LOD 达到了 1.01 M （3） 。 另外,通过实验结果验证,该荧光传感器对巯基氨基酸具有很好的选择 性。与此同时,我们也成功实现了在实际样品中分析检测巯基氨基酸, 这充分说明此荧光传感器可以在一定程度上应用于生物体系中巯基 化合物的分析检测。 3、在碱性条件下,以 BSA 为模板分子和还原剂按 10：1 的金镍摩尔 配比通过一步水热法成功合成了镍掺杂金镍合金 NCs（Au-Ni NCs） 。 通过水热法制备的 Au-Ni NCs 不仅能够发射出强烈的红色荧光 ,且在 340 nm 波长激发下,在 405 nm 和 640 nm 处能够呈现两种荧光发射 波长。同时,实验过程中我们发现在有镉(Cd 2+)离子存在下,Au-Ni NCs 的荧光强度将会得到很大程度的增强 ,相反地,在有汞(Hg 2+)离子 存在的条件下,Au-NiNCs 的荧光强度将会得到较大程度的淬灭。基 于此现象,我们设计了一种简单的、快速的、高选择的荧光检测环境 中的 Cd2+离子和 Hg2+离子新方法。在优化分析实验中,Cd 2+离子和 Hg2+离子分别在 0-200.0 M和 0-24.0M浓度范围内,将会得到 Au- Ni NCs 的荧光强度随 Cd2+离子和 Hg2+离子浓度变化而逐渐增强或 淬灭的动力学反应过程,且 Cd2+离子和 Hg2+离子的 LOD 大约都是 1.8 nM,这一实验结果充分说明这种荧光分析方法可以同时实现对 Cd2+离子和 Hg2+离子的高灵敏分析检测。与此同时,我们也证明了此 荧光传感器在环境检测分析中对 Cd2+离子和 Hg2+离子具有很高的选 择性。 4、以尿酸为碳氮氧源,通过一步简单的水热法成功制备了 QY 高达 25.61%（硫酸奎宁为参比）水溶性良好的新型荧光氧掺杂,氮富集 的碳基纳米带（ONPCRs） 。通过这种方法合成的 ONPCRs 是一种 具有类似稻叶状形貌长度约为 80-160 nm 的带状聚合物。有趣的是, ONPCRs 在 Hg2+离子或 Ag+离子存在下,将会发生强烈的荧光淬灭 效应。这可能是因为 Hg2+离子和 Ag+离子能够分别和荧光 ONPCRs 探针表面或边缘上 O 原子和 N 原子进行特异性结合通过 Hg2+-O 或 Ag+-N 化合键而最终形成没有荧光的金属复合物。基于 此,我们应用荧光 ONPCRs 作为荧光探针成功构建了高选择、高灵 敏直接检测 Hg2+离子和 Ag+离子的荧光传感器。该方法能够允许我 们直接检测水体中低浓度的 Hg2+离子和 Ag+离子, 实验结果显示,该 离子传感器具有响应迅速、重现性好、线性范围宽、检测限低及选 择性高等优势；对 Hg2+离子的检测线性范围为 2.0 nM-60.0 M, LOD 为 0.68nnM；对 Ag+离子的检测线性范围为 5.0nM-80.0 M, LOD 为 1.73 nM。另外,Hg 2+离子或 Ag+离子如果分别通过加入乙二 胺（EDTA）或氨水（NH4OH）将其中的一种干扰离子掩蔽, 我们就 可以成功的检测其中一种重金属离子或循环使用荧光 ONPCRs 检测 Hg2+离子或 Ag+离子。因此,这种容易合成的荧光 ONPCR 将会在生 物和环境监测分析中有巨大的潜在应用价值。总而言之,本论文新制 备了荧光 ONPCR 和 Au-Ni NCs,并基于此纳米材料的荧光信号改变 将其应用于环境中重金属离子的分析检测；同时还拓展了核-壳 AuAg NCs 在环境和生物分析检测领域中的应用。 新型金属石墨纳米囊的合成及其生化传感性能研究 生物传感器是由生物、数学、医学、物理、化学、计算机科学和材 料科学等多种学科交叉渗透而成长起来的一门新兴学科。近年来各 种新型分子生物学技术不断涌现,并在科学研究和实际应用中得到不 断的发展和完善,使生物分子检测的灵敏度和特异性都得到很大的提 高。然而随着环境的污染和各种疾病的频发,人们不但需要一些灵敏 度高、特异性好及成本低的传感器,更需要一些集诊断、成像和治疗 于一体的多功能传感体系。目前人们生物一般利用一些纳米材料将 多种功能融合在一起,构建多功能的纳米生物传感器。近年来纳米材 料掀起了全世界的研究热潮,特别是石墨纳米材料和金属纳米材料。 石墨纳米材料具有优良的拉曼散射性能、双光子性能、近红外外光 (NIR)热转换性能、机械性能、生物相容性、量子尺寸效应、抗渗透 性能、导热性以及大的比表面积和易于表面功能化等优点,在生化传 感领域得到了迅速的发展和广泛的应用。金属纳米材料也具有许多 优越的性质,例如,磁性金属纳米材料具有出色的磁性富集和核磁共振 成像性能,贵金属纳米材料具有优越的等离子体共振性能、表面增强 拉曼散射(SERS)性能、催化性能和量子尺寸效应等性质。因此,构 建具有金属和石墨纳米材料双重特性的多功能复合材料,能够有效地 拓展纳米材料在生化传感领域的应用范围,然而金属石墨复合纳米材 料的发展遇到了一些问题,例如尺寸控制、高质量石墨的制备、材料 的稳定性和均一性、制备步骤的简化等。基于以上研究背景,综合其 它文献报道,本文主要采用简单的化学气相沉积法(CVD)制备了多种 磁性和贵金属石墨纳米囊,并将其用于生物检测、防伪、生物成像、 癌症诊断和治疗等方面,主要内容如下: (1)在第 2 章中 ,基于磁性石墨纳米囊 (MGN)的磁性富集作用及其对单 双链 DNA 的不同吸附力 ,设计了一种富集放大检测 DNA 的生物传感 体系。MGN 是由磁性的 Co 核和石墨壳构成 ,具有磁性颗粒和石墨的 双重性能。捕获链可以通过 -作用吸附在 MGN 表面上,同时 5端 的荧光基团靠近石墨壳,发生荧光猝灭。当加入目标链后, 捕获链的 5 端与其杂交,而 3端仍然吸附在 MGN 表面上,在外加磁场的作用下该 杂交链被富集。加入释放链以后,三条 DNA 链形成了完全互补的双 链杂交结构,从 MGN 表面脱落下来,同时捕获链的荧光恢复。该方法 有效解决了以往其他 DNA 放大方法的不足。该传感器具有较好的灵 敏度和选择性,检测下限低至 50 p M。 (2)在第 3 章中 ,我们以磁性石墨纳米囊 (MGN)为模板, 将其用于丁二 炔的自组装和光聚合,构建了一个用于 p H 传感和多模式防伪的自组 装体系(MGNPDAs) 。MGNPDAs 既具有 PDA 颜色和荧光变化 属性,又具有石墨独特的拉曼散射、近红外吸收、磁性和超导特性。 基于荧光和核磁共振 T2 弛豫特性,可以将其用于 p H 传感。此外, MGNPDA 具有可逆的颜色变化、优越的拉曼散射和荧光发射性能、 敏感的近红外热响应、独特的磁性,因此 MGNPDA 具有出色的多 模式防伪性能。 (3)在第 4 章中 ,基于石墨优越的化学稳定性和抗渗透功能, 将其作为 保护性的外壳,构建了一种超稳定的银石墨纳米囊(Ag Cugraphite,ACG)。与金相比,银的光学吸收截面更大 ,地壳储存量 更丰富,而且价格便宜 50 多倍,理应是等离子体共振应用中的最佳材 料,但是银很不稳定,很容易被腐蚀。因此,构建一种超稳定的银纳米 体系具有重要意义。研究发现 ACG 颗粒在双氧水、硫氢化钠以及 硝酸溶液中都具有很好的稳定性。此外,ACG 具有较强的 SERS 效 应,在 SERS 检测中表现出了较高的灵敏度、重现性和稳定性。(4) 在第 5 章中 ,基于炔基分子在细胞沉默区具有较强的拉曼信号,以及银 石墨纳米囊具有显著的 SERS 效应和拉曼散射性能,我们制备了炔基 修饰的银石墨纳米囊,并将其用于活细胞的拉曼成像。银石墨纳米囊 在细胞标记、快速拉曼成像方面取得了良好的效果。此外,炔基修饰 的银石墨纳米囊的复合体系,展现了出色的细胞沉默区拉曼成像和共 定位成像性能。 (5)在第 6 章中 ,基于石墨与金纳米颗粒的光学性质和协同作用, 构建 了一种用于多模式细胞成像和光热增强化疗的金石墨纳米囊体系。 通过 CVD 法合成的金石墨纳米囊 (GIAN)具有多种功能。首先,GIAN 是一种出色的 SERS 基底, 因为它不但可以猝灭荧光, 还可以避免分 析物的光碳化和光漂白现象。其次,GIAN 可以用于细胞的多模式成 像。再次,GIAN 可以运载抗癌药物阿霉素用于癌症化疗。最后, GIAN 具有近红外光热效应,将其与化疗药物阿霉素结合后 ,阿霉素分 子可以通过近红外光激发实现可控释放,大大减少了化疗的副作用。 因此,GIAN 在生物医学领域具有较好的应用前景。 基于纳米材料的光学传感器快速检测热加工食品中的丙烯酰胺 丙烯酰胺(acrylamide, AA)是一种具有神经毒性、潜在致癌性和致畸 性的小分子化合物,被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)列为“2A” 类物质(即人类可能致癌物) 。 2002 年,瑞典科学家发现富含淀粉的食物经热加工后会产生大量的 AA。自此 ,对 AA 的研究引起了毒理学、食品安全、分析化学等多领 域科研人员的兴趣。检测 AA 的标准方法虽然具有灵敏度高、准确 性好、重复性好等优点,但是同样也存在着检测周期长、仪器设备维 护成本高、需专业人员操作等不足,无法满足快速、便携、实时在线 检测 AA 的需求。 光学化学生物传感器具有灵敏度高、选择性好、成本低廉、操作 简单、易实现自动化和小型化等优点,已被广泛应用于分析检测、医 疗诊断、活体成像等多个领域。对于具有毒性