病毒感染的实验室诊断

病毒感染的实验室诊断 1 病毒感染 实验室确诊的意义 n 2003年 SARS爆发 n 2008年手足口病的流行 n 群体性发热 n 临床工作中病原的确定 及时准确的实验室确诊非常重要 2 3 Dengue 登革热 麻疹可疑病例的临床诊断 发热 38OC，出现斑丘疹和至少伴 有以下一种症状：咳嗽，鼻炎或结 膜炎（ WHO） Echoviruses Echo病毒 Measles 麻疹 Parvovirus B19 微小病毒 B19 HHV-6 Rubella 风疹 Others 其它 4 内容 n 病毒感染的实验室诊断方法简介 n 检测的结果分析 n EBV感染的血清学诊断 5 病毒感染的诊断方法简介 6 病毒感染的诊断类型及方法 类型 方法 所需标本 临床意义 抗体检测（ IgG/IgM) ELISA, IF, EIA 血清， CSF 是否感染和感染 的大概时期 抗原检测 （蛋白质） ELISA, IF,EIA 咽拭子，粪便 , 血细胞图片， 活动性感染 病毒核酸（ DNA/RNA） PCR 体液和咽拭子 感染 病毒分离 细胞培养 体液，咽拭子及 组织 金标准，产毒性 感染 7 细胞免疫 体液免疫 核酸检测 /病毒分离 抗原检测 抗体检测 潜伏期 症状期 恢复期 临床表现 康复 或死 亡 病毒感染的临床过程与诊断 8 ELISA的原理 n 病毒抗原 /抗体包被在固相载体表面 n 加入待检血清， 抗原抗 -体复合物 n 洗涤，加入酶标记抗人免疫球蛋白，与抗原抗 体复合物特异性结合 n 洗涤，加入底物显色，测 OD值 9 10 ELISA结果的判定 n 目测法：一般加底物后，肉眼下出现颜色的为阳 性，无色为阴性 n 临界值法：以标本 OD值阴性对照平均 OD值加 2-3个标准差作为阳性结果的阈值 n S/N值法：以 S/N值 2.1为阳性， S/N值 2.1而 1.5为可疑， S/N值 1.5为阴性 11 免疫荧光法 n 间接法和直接法 n 间接法 1）固定 2）冲洗 3）与第一抗体结合 4）与第二抗体及免疫荧光抗体结合 5）冲洗 6）封片、观察 12 DEAFF test for CMV (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital) 13 PCR 一、 PCR基本原理 PCR是一种快速和简便的 DNA体外扩增技 术。在模板 DNA，引物和 4种脱氧核糖核苷三 磷酸存在的条件下，利用耐热 DNA聚合酶进行 聚合反应，经变性、退火及延伸三步骤多次循 环，对特定 DNA模板进行扩增。 PCR技术的特 异性取决于 引物和模板 DNA结合的特异性。 14 PCR的要求 n 目的基因的序列 n 设定引物 n PCR实验要求的原料：引物、酶、 dNTP 、 Mg+、模板及缓冲液 15 PCR一次循环包括三个基本步骤： 1.变性 (denaturation)：加热至 9096C， DNA 双链模板变成单链 2.退火 (annealling): 缓慢降温至 30-65 C ，引物 与单链 DNA模板互补结合 3.延伸 (extention): 升温至 7074C, DNA链延伸 （需 TaqDNA聚合酶， dNTP， Mg2+） 循环 30次，特异 DNA产量达 230拷贝 (约 109) PCR基本步骤 16 PCR扩增靶 DNA示意图 双链靶 DNA 变性 退火 延伸 5 3 53 5 5 3 3 17 第二次循环 18 n次循环 靶 DNA， (2n-2n)个拷贝 第三次循环 靶 DNA 靶 DNA 19 PCR反应步骤 预变性 退火 延伸变性 20 PCR animation 21 常规 PCR产物确认 22 荧光定量 PCR 23 荧光定量 PCR的标准曲线 24 病毒分离 n 标本接种于敏感细胞 n 观察细胞病变 n 病毒的鉴定： PCR， IF等 25 Cytopathic Effect Cytopathic effect of enterovirus 71 and HSV in cell culture: note the ballooning of cells. (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town) 26 检测结果的分析 27 一、血清中特异性 IgG和 IgM的意义 n 单份血清特异性 IgG阳性，只能说明过去有过 病毒感染，而不能确定最近感染。只有在发病 初期检测不到抗体或滴度低，而恢复期抗体 4 倍以上升高才有诊断意义。 n 测定单份血清中的特异性 IgM抗体，有助于疾 病的早期快速诊断，但临床诊断中要结合 病程 、临床表现和病毒类型 综合考虑。 28 Typical Serological Profile After Acute Infection Note that during reinfection, IgM may be absent or present at a low level transiently 29 检测 IgM应注意的问题 n 持续的 IgM反应：如风疹、 CMV等早期妊娠感 染或先天性感染的儿童，特异性 IgM可能持续 达 1年或更长时间 n IgM型抗体阴性： 1）病程：风疹、出疹后第 1天， 45%能查到 IgM；麻疹、出疹后 3天内， 70%左右能查到 IgM 2）病人的免疫功能：免疫抑制病人 30 3）局部感染 4）隐性感染的再激活和再次感染（ EBV、 CMV 等人疱疹病毒）：产生的特异性的 IgM少，应 查双份血清的特异性 IgG 多种病原体 IgM抗体同时阳性 1、 IgM持续时间 2、交叉反应：肠道病毒、黄病毒 31 二、 PCR检测结果的分析 n PCR检测阳性：并不一定说明是病原或 活动性感染，要结合临床、标本来源等 综合分析 可能是正常携带病毒或潜伏感染，如 肠道病毒，正常人粪便中可以检测到， 但脑脊液中检测阳性则有临床意义 32 n CMV尿荧光定量 PCR阳性不能用于判断 疗效和指导治疗，但血清中定量 PCR与 病情严重程度相关 n PCR检测阴性：要结合临床病程分析 呼吸道病毒感染、肠道病毒感染一般 7 10天后可能检测不到病毒核酸 33 三、病毒分离结果 n 敏感性较低 n 结合 临床病程、症状体征和标本来源 综 合判定： 1、阳性结果，是否与临床相符（ SARS 与衣原体） 2、阴性结果，是否病程已过急性期 34 儿童手足口病患者病原检测 35 原发性 EBV感染的诊断 36 常用名 正式命名 所属亚科 生物学特性 单纯疱疹 V-1型 人疱疹 V1型 在感染 N节中潜伏 单纯疱疹 V-2型 人疱疹 V2型 在感染 N节中潜伏 水痘 -带状疱疹 人疱疹 V3型 在感染 N节中潜伏 EBV 人疱疹 V4型 在淋巴细胞中潜伏 CMV 人疱疹 V5型 在淋巴细胞及分泌腺 体中潜伏 人疱疹 V6型 人疱疹 V6型 同上 人疱疹 V7型 人疱疹 V7型 同上 人疱疹 V8型 人疱疹 V8型 同 EBV 人类疱疹病毒人类疱疹病毒 37 Burkitts lymphoma in Kenya Epstein-Barr virus (EBV) 1964, discovered from Burkitts lymphoma tissue by Epstein, Achong, and Barr 1968, the etiologic agent for infectious mononucleosis 1970, nasopharyngeal carcinoma 1980, non-Hodgkins lymphoma 38 EBV 相关疾病 n 传染性单核细胞增多症（ Infectious mononucleosis， IM） n 慢性活动性 EB病毒感染（ Chronic active EBV infection， CAEBV） n EB病毒相关性嗜血细胞综合征（ EBV- associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS) 39 n 伴性淋巴增殖综合征 （ X-linked lymphoproliferative syndrom ） n 鼻咽癌（ Nasopharyngeal carcinoma） n Burkitts 淋巴瘤（ Burkitts lymphoma） n 何奇金淋巴瘤（ Hodgkins lymphoma） 40 B CD21 gp350 MHC-II EBV Asymptomati c infection Symptomatic infection（ IM) Primary EBV Infection Latent infection EBV-related other diseases 41 EBV-IM的临床表现 n 发热： 约 1周，严重者 2周或更久，幼儿可不 明显 n 淋巴结肿大：任何淋巴结，颈部最易受累 n 咽炎： 50有渗出物 ， 25上腭有瘀点 n 脾肿大：病程 2 3周， 50出现 n 肝炎：肿大 10 15，而 GPT升高 80 n 皮疹：红斑、斑丘疹或麻疹样疹， 50可有眼 睑浮肿 42 EBV-IM的临床表现 n 其它： 1.间质性肺炎 2.CNS: 脑炎、格林巴利综合征等 3.心肌炎 4.血液系统：溶血性贫血、再障、粒细胞减少 5.肾炎 6.关节炎 7.胰腺炎 43 EBV抗体四项 n VCA-IgG n VCA-IgM n EA-IgG n NA-IgG n VCA-IgG亲合力 44 衣壳抗原（ CA） IgM n 一般情况下：一周左右升高，持续存在 4 8周 ，类风湿因子和 IgG抗体可致结果假阳性 n 临床要注意以下情况： 1、有的病人抗 EB病毒 CA-IgM产生延迟 2、少部分病人感染 EBV后， CA-IgM持续阴 性 3、也有的病人 CA-IgM持续几个月阳性 45 抗体亲合力检测 n 机体在受到病原体入侵时首先产生低亲合力抗 体，随感染的继续和进展，抗体亲合力升高。 因此，低亲合力抗体的检出提示原发性急性感 染。 n 原发 EBV感染， 100的病人在第一个月内可检 测到抗 EB病毒 CA-IgG低亲合力抗体 46 EBNA (IgG) EBV-CA (IgG) 没用尿素处理 EBV-CA (IgG) 用尿素处理 EBV-CA (IgM) EBV-EA (IgG) Patient 1 Patient 2 新近感染 既往感染 亲合力检测 早期 晚期 47 病程 周 月 抗体滴度 早期阶段 晚期阶段 症状 原发性 EBV感染的体液免疫 48 晚期早期 复发 CA (IgG) + EBNA (IgG) + CA (IgA, IgM)+ EA (IgG)+ 病程 周 月 抗体滴度 EBV感染的再激活 恢复期 49 5% 的 EBV新近感染 抗 CA抗（ IgM）阴性 在罕见的病例中抗 CA抗体 (IgM)会持续阳性 20-30% 的 EBV新近感染 抗 EA抗体（ IgG）阴性 抗 EBNA抗体 (IgG)阴性 体液免疫的特殊情况 50 抗体反应类型 例数（） VCA-IgG VCA-IgM EA-IgG NA-IgG VCA-IgG亲和力 低 150（ 68.2） 低 36（ 16.4） 低 7（ 3.2） 低 2（ 0.9） 低 8（ 3.6） 低 1（ 0.5） 高 10（ 4.5） 高 6（ 2.7） 220例 IM病人血清中 EBV抗体四项结果 51 EBNA-1抗体 IgG 阳性 CA抗体 IgG阳性和 EA抗体 IgG 阳性和 /或 CA抗体 IgM阳性或 CA抗体 IgA 强阳性 复发 只是高亲合力的 CA IgG抗体 既往感染 EBV抗体四项结果分析 1 52 EBNA-1抗体 IgG 阴性 CA抗体 IgG和 IgM 阴性 CA抗体 IgG阳性 未感染 EBV Ca抗体 IgM阳性和低亲合力 CA IgG抗 体， EA抗体 IgG可能阳性 或 EBNA-1抗体 IgM和 p27抗体 IgM 阳性 原发感染 CA抗体 IgM为阴性和高亲合力的 CA IgG抗体 EA抗体 IgG 阳性 EA抗体 IgG 阴性 EBNA-1抗体丢失 的复发 EBNA-1抗体丢失 的既往感染 CA抗体 IgG p22 阳性 EBNA-1抗体丢失 的既往感染 EBV抗体四项结果分析 2 53 1 4 2 5 3 1 说明：图 1为 VCA-IgG，阳性；图 2为 VCA-IgG，提示为低亲和力； 图 3 为 VCA-IgM，阴性；图 4为 EA-IgG，阴性；图 5为 NA-IgG，阴性 病程 4天 外周血 EBV抗体结果 54 病程 8天 外周血 EBV抗体结果 说明：图 1为 VCA-IgG，阳性；图 2为 VCA-IgG，提示为低亲和力； 图 3 为 VCA-IgM，阳性；图 4为 EA-IgG，可疑阳性性；图 5为 NA-IgG，阴性 1 2 3 4 5 55 说明： 上二图中，从左到右，前 4条曲线为标准品； 第 5条曲线为病程 8天， CT值