荧光定量PCR技术及应用 毕业论文.docx

毕 业 论 文题 目 荧光定量pcr技术及应用 专 业 生物技术系 班 级 10级 姓 名 学 号 . 实习单位 . 指导教师 . 二一二年五月十五号目录摘要1关键词.1一、荧光定量pcr原理.111定量pcr的数学原理.12定量pcr的化学原理.1.3定量pcr的光学原理.二、绝对定量与相对定量.62.1 标准曲线法的绝对定量法.2.2双标准曲线法的相对定量法.2.3比较ct法的相对定量法.三、定量pcr实验流程7四、检测仪器7 4、1 stepone plus及viia7. 4、2 stepone plus及viia7比较.五、几种定量方法的比较.8六、荧光定量的应用 9七、常见问题分析.97、1扩增曲线弯曲.7、2直线扩增曲线.八、参考文献 .10摘要 实时荧光定量pcr技术是在普通pcr定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量pcr技术的基本原理、主要类型和定量方法,了解其应用及探讨实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。关键词：荧光定量pcr；原理；主要类型；定量方法；应用；优化real-time fluorescent quantitative pcr technique is the development of nucleic acid quantitative technique based on ordinary pcr qualitative technique, has been widely used in different fields of study. this paper discusses the basic principles, fluorescence quantitative pcr technology and main types of quantitative methods, to understand the effect of its application and the control method, the experimental conditions of factors and optimization of experimental results.keywords：fluorescence quantitative pcr; principle; main types; quantitative method; application; optimization荧光定量pcr是( real-time fluorescence quantitative pcr，rtfq pcr) 是1996 年由美国applied biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度1。目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用。一、荧光定量pcr原理实时pcr 就是在pcr 扩增过程中，通过荧光信号，对pcr 进程进行实时检测。一般来讲，定量pcr 仪包括：实时荧光定量pcr 仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和led；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光ccd 摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时pcr 扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和ct 值。 1.1定量pcr的数学原理 也就是说为什么ct 值跟初始模板的量成正比？首先来看一个real-timeqpcr 中的重要参数（具体的后面会讲到）ct 值（ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第3-15 个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的是10 倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。ct 值就是荧光值达到阈值时候的pcr循环次数。所以是一个没有单位的参数。 那么为什么说ct值跟初始模板的量程正比呢？我们来看pcr的扩增方程：从线性方程上看，斜率（slope）为-1/lg(1+e)，所以e=10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率（-3.3），就可以算出扩增效率（0.99）。一般来讲pcr扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于100%，是由于pcr 反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。1.2 定量pcr的化学原理荧光定量pcr所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以sybr green为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括taqman、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。 （1）sybr green sybr green是一种能够与双链dna小沟结合的染料。在游离状态下,sybr green发出微弱的荧光,但是一旦与双链dna结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链dna量成正比,可以根据荧光信号检测出pcr体系中的双链dna的数量7。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。sybr green的缺点在于它能够和所有的双链dna相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化pcr的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。（2）分子信标分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针,环部与靶dna序列互补,为1535 bp;茎部是由互相配对的碱基组成,但与靶dna无序列同源=性,约8 bp。在探针的5端和3端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。当溶液中的模板与分子信标结合配对时,分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开,当荧光基团被激发时,就发出荧光信号。与探针互补的靶分子数量越多,荧光信号也就越强,从而实现了对目的基因的定量检测。分子信标的方法优点是特异性强,荧光背景低。其缺点是设计困难,杂交探针不能完全与模板结合,稳定性较差,价格高2。 （3）taqman探针 taqman探针技术是有美国perkin elmer(pe)公司研制的一种实时pcr定量技术,在pcr扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个3045 bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5端标记荧光发射基团,3端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时,3端淬灭基团抑制了5端发射基团的荧光发射。但在pcr扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,taq dna聚合酶的53外切酶活性将探针5端连接的荧光发射基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和pcr 产物数量是相对应关系,且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量3。taqman探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。但是需要设计特异性的探针,因此成本较高4。 1.3 定量pcr仪构造二、绝对定量与相对定量实时荧光定量pcr技术是dna定量技术的一次飞跃。运用该技术,可以对dna、rna样品进行定量和定性分析。定量方法包括绝对定量和相对定量。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度;后者可以对不同方式处理的2个样本中的基因表达水平进行比较。 2.1 标准曲线法的绝对定量法 用一系列已知浓度的标准品,作为模板进行pcr反应,以标准品浓度的对数值为横坐标,以测得的ct值为纵坐标,绘制标准曲线,在相同条件下检测未知样品的ct值,从而根据标准曲线计算出未知样品的浓度(拷贝数)。制作1个好的标准曲线对定量结果至关重要,在制作标准曲线时,应至少选择5个稀释度的标准品,涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围,最好与目的基因有较高的同源性;绝对定量标准品通常可以是纯化的质粒dsdna,体外转录的rna,或者是体外合成的ssdna、标准品的量可根据260 nm的吸光度值并用dna或rna的分子量转换成其拷贝数来确定。2.2 双标准曲线法的相对定量法 在某些不需要对基因进行绝对定量、只需要确定基因相对表达差异的情况下,如某基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了,用相对定量的方法就可以得到结果。双标准曲线法是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因,并用目的基因和管家基因的标准品分别作出标准曲线,处理与未处理样品同时扩增目的基因和管家基因,获得ct值,然后从各自的标准曲线上求出初始模板量,经管家基因均一化处理后,求出目的基因的相对含量。定量的表达是相对于某个参照物的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容易制备,对所用的标准品不需要知道绝对拷贝数,只要知道其相对稀释度即可。通常选用的管家基因有gapdh、-actin、2-微球蛋白和rrna。此方法在扩增效率较低、目标基因与管家基因扩增效率有差异时适用,且需要很精确的结果计算。2.3 比较ct法的相对定量法 如果反应条件控制较好,扩增效率较高,目的基因和管家基因的扩增效率基本一致,这时就不需要作标准曲线,而是通过与管家基因ct值之间的相差来计算目的基因的表达差异。比较ct法运用了数学公式来计算相对量,前提是假设每个循环增加1倍的产物量,根据数学推导得出: 目的基因的量=2-ct 在该公式中,ct=(ct目的基因-ct管家基因)实验组-(ct目的基因-ct管家基因)对照组。因此,2-c t表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量,而不必制作标准曲线5。三、定量pcr实验流程实验操作：1.稀释标准品2.稀释样品3.配制反应预混液4.加样5.设置反应程序6.运行实验7.分析数据四、检测仪器。 4、1 stepone plus及viia7.stepone plus viia74、2 stepone plus及viia7比较五、几种定量方法的比较六、荧光定量pcr应用pcr除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。pcr本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常 (gene mutation, deletion, and rearrangement)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估； 对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取 (dna sequencing) 及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。 也可以做dna指纹 (fingerprints) 比对帮助亲子关系的鉴定。pcr更可以用于器官移植组织兼容性hla的分析。另外在演化上的分析，经由pcr的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质 (interleukines) 及各种生长因子 (growth factors) 基因的表现都可用pcr来进行质与量的分析。七、常见问题分析7、1扩增曲线弯曲.原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。 解决方案：对于能检测出ct的样品，读出数据；浓度太高的样品，需稀释后另做实验。7、2直线扩增曲线部分探针降解后，部分reporter从探针上脱落，导致：基线抬高；扩增与荧光信号的增加不一致。八、参考文献1 mikael k a,jose m a,martin b,et al.the real-time polymerase chain reactionj.molecular aspects of medicine,2006(27):95-125.2 朱捷,杨成君,王军.荧光定量pcr技术及其在科研中的应用j.生物技术通报,2009(2):73-76. 3 higgis j a,ezzell j,hinnebusch bj et al. nuclease pcr assay to detect yersinia pesitsj.j clin microbiol,1998(36):2284-2288. 4 yin j l,shackel n a,zekry a et al. real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction(rt-pcr)for measurement of cytokine and growth factor mrna expression with fluorescent probes or sybr green i j.i