溶出度试验质量标准的制订

溶出度试验质量标准的制订溶出度试验质量标准的制订 本文详尽阐述了如何科学,客观地拟定质量标准中溶出度试验各参数,并廓清了拟定出发 点和控制要素,为如何使该试验法的拟定体现出制剂的内在品质提供了佐证与参考。 溶出度试验作为“评价固体制剂内在品质的灵魂与核心” ，随着人们对该项技术的不断 研究与深入，对其认识与理解亦在不断发展与变化着。现今，该试验不仅具有为建立体内 外相关性而设立的宗旨，且已成为证明药物体内释放特性的一种简单、廉价而不失严谨的 实验室检测方法。 “在多种 pH 值溶出介质中溶出曲线（本文的“溶出度曲线”包含释放曲线，以下同） 的测定以及比对”更是成为“剖析”固体制剂内在品质一种重要手段，成为固体制剂内在 品质呈现于外在的一种“表象” 、 “映射”与“载体” ，成为在仿制药“殊途同归”的研发进 程中提高生物等效性（BE）试验成功率所历经的必由之路，甚至成为该品种在其工艺与处 方完全成熟、持续进行多批大规模生产后，所拥有的特定特征“指纹图谱” 。总之， “多条 溶出曲线的测定”可在与固体制剂品质相关的所有环节上均发挥出举足轻重的作用。 本文将就个人工作经验与感悟，详尽阐述仿制药如何制订溶出度试验质量标准。无论 是药品注册管理办法中的三类新药（已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的药品） 还是六类新药（已有国家药品标准的原料药或者制剂） ，两者唯一区别就是有无“可参照的 质量标准” ，但均请按照以下思路进行。 既有质量标准的可参照性既有质量标准的可参照性 关于六类仿制药，实验者肯定会查询到相关参考文献，如各国药典、国家药监局标准、 进口质量标准、 日本橙皮书 、美国 FDA 公布的溶出曲线数据库、日本仿制药技术申报资 料概要等，由于这些标准本身具有局限性、历史性和利益性，因此绝不建议实验者对原研 品不经剖析就直接撷取，即便是国外药典或进口质量标准，制订者也不应盲目迷信。这正 是国家药品审评中心自2008年起就反复提出“仿产品不是仿标准”宗旨的核心要素之一 （对于口服固体制剂，还有一要素为“有关物质” ） 。 购买原研品购买原研品 六类仿制药，均可购买到进口品或原研厂在国内合资企业产品。三类新药（其实也是 仿制药） ，研发者必须想尽办法购买来原研品，可通过私人关系带入，或通过“世界药房” 网站、 “白求恩药房”网站等中介获取，还可向国家药监局注册司申请“一次性进口”批件 （少量、仅用于研发）等多种方式。绝不应以购买不来为借口， “天马行空、闭门造车”地 进行处方开发与制剂工艺研究；且购买时应尽可能获取不同时间段的多个批号样品（如出 厂不久的和临近效期的） 。 将购买来的原研品作为0个月计，放入冰箱内冷藏。对于研发者，强烈建议与仿制品同 时进行6个月稳定性考核，每一时间点样品取出后均放入冰箱冷藏，直至6个月结束。首先 测定最终时间点的多条溶出曲线（当然还有有关物质） ，观测与0个月相比的变化情形，再 酌情考虑是否需测定其他时间点样品，从而根据原研品溶出曲线波动情况对自身仿制品的 研发和品质做出正确判断与准确评估。 多条溶出曲线剖析原研品多条溶出曲线剖析原研品 在进行溶出曲线测定前，一定要先进行以下三项工作。 “pH 值值-溶解度溶解度”曲线的测定曲线的测定 取过量原料药（可为预经微粉化处理） ，置8支具塞试管中，分别加 pH1.0、8.0 溶出介质适量，置37水浴振荡过夜，形成过饱和溶液，取出后滤过，取续滤液经 HPLC 法测得溶解度，绘制曲线。对于难溶性药物，对照品溶液可酌情采用纯甲醇或纯乙腈配制。 该曲线的绘制可提供众多信息：如与 X 轴平行，说明各 pH 值溶解度几近一致，由此 可预测多条溶出曲线应重合；如曲线上有陡峭变化、甚至是有数量级差异，则可揭示多条 溶出曲线形状必会有所差异（即高低错落） ，最低的那条曲线一定是溶解度最低的 pH 值介 质，这为制剂研发方向提供了针对性与佐证素材。 当出现主成分在某 pH 值介质中极不稳定、溶解后即迅速分解，无法测定的情况，则 该介质溶解度可不测定，其溶出曲线亦可免做。 pKa 值的查询与测定值的查询与测定 pKa 值也十分重要，可通过查询或测定获得。测定法可参照以下三篇文献。若该值未 涵盖于四条标准溶出曲线 pH 值范围，则研发时第56条溶出曲线就应测定该 pKa 值所对 映的 pH 值介质或以上“pH 值-溶解度曲线”上急剧变化的 pH 值，这些 pH 值溶出曲线的 测定对于仿制制剂研发和曲线比对均具有十分重要的意义。 主成分在各溶出介质中的稳定性主成分在各溶出介质中的稳定性 为获得准确试验数据，该验证必不可少。建议取原料药粉末配制的溶液即可，无需取 样品溶出液。 采用溶出曲线采用溶出曲线“剖析剖析”原研品原研品 请参见张启明、谢沐风撰写的采用多条溶出曲线评价口服固体制剂的内在质量一 文。 质量标准中各参数的制订质量标准中各参数的制订 在进行了以上对原研品和仿制品多 pH 值溶出介质中溶出曲线的测定后，才能科学客 观、合理全面地制订质量标准。具体阐述如下： 溶出介质的选择溶出介质的选择 速释制剂：首先应满足在该介质中最终溶出量达85%以上，然后可按下列情况分别选 取。 根据该药物在体内吸收主要消化道部位的生理 pH 值（适用于一般情况） ； 能在一定 程度上反映体内外相关性的 pH 值（适用于创新药） ； 最能体现不同来源制剂间彼此差异最能体现不同来源制剂间彼此差异 的的 pH 值（适用于标准转正值（适用于标准转正/药典起草、尤适合于我国大量仿制药存在情形）药典起草、尤适合于我国大量仿制药存在情形） ； 最能反映生 产工艺变化、偏差的 pH 值（适用于企业内控标准，用于批间样品品质均一性的评价） ； 溶出曲线中最低的 pH 值（适用于企业内控标准，用于应对国家市场检查与监督） ； 溶出 数据精密度更佳的 pH 值（某些样品在首选介质中精密度不佳时、更换为精密度更为理想 的介质） 。 当多条溶出曲线重合时（各时间点溶出量相差不超过10.0%） ， 日本橙皮书倾向首 选“水” 。其出发点为：虽然水的 pH 值和表面张力会因来源不同而改变，且在试验过程中 也可能会因药物影响或者溶解入二氧化碳使溶出行为发生变化，但考虑到上述可能性较小， 且可通过事先验证予以探明，故秉承环保、提高试验效率等出发点，质量标准中首选水。 而美国药典鉴于以上问题的存在，倾向采用带有 pH 值的介质。笔者更倾向日本作法，因 水的 pH 值范围5.07.0已被上述多条溶出曲线的 pH 值所涵盖。当多条溶出曲线不重合， 则可根据上述各针对性酌情拟定。 肠溶制剂肠溶制剂：注意应该规定酸中介质（pH 1.01.2）和碱中介质（pH 6.87.2）释放量 的测定。酸中释放量的测定现今愈发倾向通过测得准确数据予以表达、而非肉眼观察外观 形状进行控制（日本橙皮书皆采用此法） ，通常规定2 h 不得过10%。为防止药物在年轻人 体内发生过量释放，甚至在该阶段可故意采用高转速（如100转） ，以进一步探明药物的内 在优良品质。 如主成分溶出后在酸性介质中不稳定旋即降解，即便立即测定也无法准确评估时，建 议测定溶出杯中剩余固体颗粒所含主成分量，随后用测得百分含量减去剩余百分含量，再 除以测得百分含量，即为酸中释放百分量。 现今，随着市场上销售的肠溶衣辅料已皆可在 pH1.03.0范围内包裹住药片，使主成 分释放量合格，而经研究表明：人体内胃环境，随年龄增长胃酸分泌逐渐减少（胃内 pH 值范围1.27.6） ，如此再在 pH 1.01.2范围内测定已显得毫无意义，故现今开始逐步测定故现今开始逐步测定 pH4.5介质介质，规定依然是不得过10%溶出量。英国药典自英国药典自2008年始，年始， “奥美拉唑肠溶胶囊奥美拉唑肠溶胶囊 /片片”的制订原则便是以此为依据，这样的测定更有针对性和实用性，值得我们学习和借的制订原则便是以此为依据，这样的测定更有针对性和实用性，值得我们学习和借 鉴。鉴。 碱中释放量同速释制剂：需要注意的是，肠溶衣对紫外测定时常有干扰，故强烈建议肠溶衣对紫外测定时常有干扰，故强烈建议 采用紫外采用紫外-两点相减法或两点相减法或 HPLC 法法，否则极易出现溶出量均值高于含量否则极易出现溶出量均值高于含量3.0%以上的情况以上的情况。 缓控释制剂缓控释制剂 首先应满足在该介质中最终溶出量达80%以上。当体外多条释放曲线重合时（酸中仅 测定2h 即可） ，建议首选水（pH5.07.0）作介质，既经济又方便。绝不建议采用酸性介 质，因任何人体内的十二指肠至小肠消化道器官是不存在该值的；也不建议参照人体内消 化器官的标准值（pH1.01.2、4.04.5、6.8）采用不同时段、不同溶出介质（不断调试） 的费时费力方式、且此方式实验误差较大。当体外多条释放曲线不重合时，建议选择最终 溶出量达80%以上的、最慢的那个 pH 值介质。 介质中胃蛋白酶和胰蛋白酶的加入介质中胃蛋白酶和胰蛋白酶的加入 一般情况下，不建议在溶出介质中添加这些酶。但如某些药物必须饭后服用、且生物 等效性试验需在“进食”状态下进行时，则在仿制药研发中必须进行“溶出介质中分别添 加胃蛋白酶和胰蛋白酶的比对研究” ，此时质量标准中亦应加入。另外，当硬胶囊剂使用囊 壳为明胶胶囊时，为避免产生交联现象影响溶出，也可加入，但需进行验证。 取样时间点与限度的制订取样时间点与限度的制订 普通制剂普通制剂 以第一次出现溶出量均在85%以上的两个时间点，且该两点溶出量差在5%以内时 （即出现“平台期” ） ，取前一时间点作为质量标准中取样时间点，并将该点溶出量减去15%作 为溶出限度。这就将“之前我们通常认为的溶出度取样时间点常选择溶出曲线拐点处后 推1020 min ”的原则予以明确化和具体化， “拐点处后的1020 min”即为溶出饱和 “平台期” 。由此便可推断出：溶出限度一般仅有70%、75%、80%、85%四个数值。如 设立第一时间点为20 min，由于其不为刻钟的整数倍，一般提高至15min，但限度可仅减 去10%。 当出现采用50转、溶出曲线缓慢上升、至60min 后才出现平台期（研究时需测定到 360min）时，会出现取样时间点过于滞后的情形，这不利于产品的日常检验。此时为提高 试验效率，可适当放宽参数（如加大转速）或采用溶出更快的介质，使60min 前出现平台 期，即不建议拟定60min 后的取样时间点。但前提是，这些调整“不应弱化针对不同来源 制剂间内在品质的区分力（如采用增加转速方式） ”或“无法建立体内外相关性介质（更换 的介质也必须具有体内外相关性的特质） ” 。 缓缓/控释制剂控释制剂 应至少设定3个时间点（服用方式一天2次）或4个时间点（服用方式一天1次）：第一 点为避免“突释” ，应设定为试验12h 后或溶出量相当于标示量10%30%时间点；第二 点是为考察药品溶出特性，该限度应设定在溶出量约50%时间点；最后一点是为确保药物 溶出量超过80%时间点。如拟定4点，第2、3、4时间点的溶出量应分别约为40%、60%和 80%溶出量。 任何一点的拟定范围均勿超过标示含量的20%，且各点溶出限度交叉范围建议勿超过 5%，除非体内特征可显示出相应的可接受性和波动性。对于零级释放产品，因其释放曲线 为“一条直线” ，故还应增加每小时释放量的规定（即斜率规定） ， “硝苯地平控释片进口质 量标准（拜耳出品） ”中就有6%8%/h 的严格规定。 治疗窗狭窄药物治疗窗狭窄药物 为防止“突释” ，愈发倾向采用两点法测定。一可采用“5或10min 的第一点溶出量不 得大于某一限度（以控制突释） ，第二点规定一定时间内溶出不得小于某一限度以保证溶出 完全”的作法（如日本橙皮书中卡马西平片拟定为5min 不得过60%和30min 不得少于 70%） ；二可采用缓控释制剂拟定法：第一点规定5或10min 时溶出量为一限度范围而非一 上限，以保证其溶出曲线呈现“缓慢上升性” （如美国药典卡马西平片规定：10min 释放量 应为30%50%，45min 时不得少于75%） ，该规定亦可有效防止处方中加入大量表面活性 剂或增溶剂的“投机取巧”作法。 各国制订的技术指导原则中收载的此类药物清单如下：氨茶碱、茶碱、胆茶碱、双羟 丙茶碱、苯妥因钠、丙戊酸、炔雌醇/孕酮制剂、地高辛、洋地黄毒甙、华法令钠、甲磺酸 异他林吸入气雾剂、卡马西平、可乐定透皮贴剂、磷酸丙吡胺、硫酸胍乙啶、硫酸奎尼丁、 硫酸哌唑嗪、硫酸异丙肾上腺素、米诺地尔、扑米酮、碳酸锂、盐酸克林霉素、盐酸可乐 定、盐酸普鲁卡因胺、左甲状腺素钠、环孢霉素 A、他克莫司、西罗莫司、丙戊酸/丙戊酸 钠等。 装置的选择装置的选择 建议首选通用性强、耐用性好、广泛普及的篮法与桨法。胶囊剂首选篮法、片剂首选 桨法。对于不易采用篮法（如发生堵塞篮法孔隙、或样品塌陷于篮底底、或粘附于篮顶）对于不易采用篮法（如发生堵塞篮法孔隙、或样品塌陷于篮底底、或粘附于篮顶） 、 且易漂浮于液面的制剂，可考虑采用桨法、加沉降篮且易漂浮于液面的制剂，可考虑采用桨法、加沉降篮；对于采用了粘附性较强辅料的缓释 制剂，极易发生试验过程中始终粘附于溶出杯不同部位、而使溶出数据均一性较差的情况 时，更推荐采用沉降篮。绝不建议采用自制沉降装置，因其制作的不规范性会导致数据的 难以重现性。 不推荐使用非法定或非标准试验装置。如确实有必要采用，应提供详尽验证资料和充 足理由，并充分验证其必要性与质量可控性（即实验室间的可操作性、耐受性和易重现性） 。 如美国药典第37法，决不能因价格昂贵而自行设计组装，且由于其现阶段该仪器尚难以 推广和普及，故笔者建议勿采用。如经典的篮法与桨法无法正确表达出该样品体外溶出特 征，可在此基础上进行改装，如针对栓剂或阴道制剂的体外溶出度研究与测定，即如此。 转速的拟定转速的拟定 既有观念的错误既有观念的错误 由于50转的搅拌强度与中老年人体胃肠道蠕动强度相当，且患者大多为中老人群，故 首选该转速。现今国内仍普遍认为桨板法/50转转篮法/100转，其实这是错误的。笔者在 日本国家药检所进修期间，经导师指教、并亲自采用 USP 溶出度校正片实验验证，结果为： 最弱级，桨板法桨板法/50转转转篮法转篮法/50转（样品在篮内）转（样品在篮内）转篮法转篮法/100转（样品在篮外、即转（样品在篮外、即 沉于杯底沉于杯底） ；中级，桨板法中级，桨板法/75转转转篮法转篮法/75转（样品在篮内）转（样品在篮内）桨板法桨板法/50转（样品置转（样品置 于沉降篮内）于沉降篮内） ；最强级，桨板法；最强级，桨板法/100转转转篮法转篮法/100转（样品在篮内）转（样品在篮内）桨板法桨板法/75转转 （样品在沉降篮内）（样品在沉降篮内） 。 由此猜测可能是当年我国引入溶出度试验时将英文译错所致，当样品置于沉降篮内， 在试验过程中始终处于杯底，由此受到的外来涡旋力将大于样品任意漂浮或停滞于杯中某 处，故其级别比不置于沉降篮内高出一级。 需放宽试验参数时需放宽试验参数时 不能随意采用高于50转速，因为这将极大地弱化对不同制剂/处方溶出行为的区分力。 对于有必要放宽溶出度试验参数的情况，应分别考察转速为75100转和加入表面活性剂两 种方式，以更好地建立起体内外相关性和能区分不用来源制剂内在品质优劣。 目前倾向于采用“不提高转速、加入表面活性剂”方式，由于中老年患者胃肠道蠕动 虽较弱，但体内存在胆碱类物质，可用表面活性剂表达。但当样品在杯底出现锥度堆积、 呈“小山状”时，则倾向加大转速、而非加入表面活性剂方式。 表面活性剂添加浓度研究应从0.01（w/v）起板、按照1、2、3、5级别逐步增加去 “剖析”原研制剂（即逐步试验 0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%，9个浓度；另外，另外， 配制溶出介质、溶解表面活性剂以及无机盐时，一定要采用加热煮沸方式，切忌采用振摇配制溶出介质、溶解表面活性剂以及无机盐时，一定要采用加热煮沸方式，切忌采用振摇 或超声）或超声） ，不建议采用3.0%以上浓度。当两级别间溶出曲线差异较为显著时，则应适当增 加中间浓度以进一步研究。需强调的是：绝不建议不经以上“循序渐进” ，而根据“漏槽条 件”推断出某浓度便直接撷取。 研究时应注意不同来源的表面活性剂可能会对试验结果带来显著性差异情况，如十二 烷基硫酸钠（SDS）的使用，现今愈发倾向在研究时采用市场某一主流品牌（分析级） ，并 在质量标准中注明，以使其后试验的重现，绝不建议研究时采用市场上多个品牌、在质量 标准中不注明的作法，费时费力、且导致试验结果无法预料。 综上所述，若质量标准中未制订50转或采用了添加表面活性剂的介质，就应在研发资 料和起草说明中予以详尽验证和阐述。 最极端试验条件最极端试验条件 质量标准中拟定的最极端条件建议为：桨板法/100转、溶出介质中加入3.0%表面活性 剂。因目前上市的所有原研制剂，在此条件下产品溶出介质皆可达到85%（或80%）溶出 量；且在该条件下，如任何一个介质中皆未有85%以上溶出量，亦可推断该制剂犹如“石 头般坚硬” ，如此制剂在人体内的生物利用度也就可想而知了，这一点对于创新药的制剂研 发具有很强的指导意义。 溶出介质中严禁添加有机溶剂。因为这将极大地降低体内外相关性，严重背离溶出度 试验应用理念，是典型的“为了溶出合格而设定”的标准；同时对于人体而言，是不可能 “先喝2两白酒再吃药的” 。遗憾的是，国内的一些质量标准仍有这样的品种存在，值得深 思。 若确实找不到一个理想溶出条件，说明现今的制剂手段尚无法解决该原料药的溶解性， 尚无法开发成适合人体吸收的制剂，此时则应果断、明智地放弃，使之休眠，直至开发出 可解决其生物利用度的辅料。 特例特例 pH 值特例：鉴于3.0%表面活性剂的加入，对于配制和试验操作皆会带来极大困难， 此时若在 pH 大于8.0的介质中（即溶解度显著提高的 pH 值）可找到一个较为温和试验条 件下最终溶出量达85%以上，则推荐采用该 pH 值，即便该值已背离人体正常生理值。美 国药典中“阿维 A 酸胶囊”采用“篮法/100转，pH9.610.0缓冲液中加3.0%SLS（十二烷 基磺酸钠）作溶出介质，900ml，30min，85%限度”的条件就是出于该考虑。 转速特例：不推荐采用低于50转的条件，除非针对特定剂型或特定工艺。如中国药典 “布洛芬缓释胶囊”拟定30rpm。此时则应格外注意仪器适用性，曾发现不同仪器间测定 结果存在显著差异情况（即低转速下显示出仪器间性能差异性） 。又如悬浮剂一般采用 2550rpm，但对于出现锥度堆积的情况，可通过适当增加桨速予以改善。 体积选择体积选择 统一设定为900ml 或1000ml。900ml 与人体消化道内的体液总体积较为接近，1000ml 则是为便于计算。其他体积均无必要选择。 至于中国药典收载的第三法小杯法，是特定历史时期产物（当时液相不普及，对 于小规格制剂，即便采用5cm 吸收池，仍无法满足紫外吸收度应达0.2的最低要求，于是在 第二法的基础之上衍生改良而来） 。由于该法不满足当初设计溶出仪时所追求的漏槽条件， 更不符合大杯法所应具有的流体力学特征，故截至目前其他各国药典均未采用。现今，随 着液相色谱仪在国内已完全普及，即便再小规格，亦可通过各种措施解决准确测定问题， 因此，即便既有国内质量标准拟定该法，因原研制剂在研发和质量控制时从未采用过该法， 故强烈建议实验者一律改为大杯法。 投样量投样量 之前曾有为满足样品最低定量限需要，采用一杯内投入2片作法，现今采用 HPLC 法已 皆可解决，故投样原则必须遵循单片样品方式。对于多计量的颗粒剂、混悬液、干混悬剂 等机型，可采用一次单位服用量投入。投入方式可采用：混匀后立即倾入已标化的、带有 刻度的试管中510ml，即刻用滴管加样品至刻度，倾入溶出杯中，并用溶出杯中液体清洗 试管。 测定法测定法 无论采用何法检测，均应牢固树立“研发阶段测定法与质量标准测定法应区别对待” 的科学理性理念。 研发时测定法研发时测定法 研发时，溶出测定工作量十分巨大，具不完全统计：速释制剂仿制药研发需测定约 500