电化学血糖传感器原理及发展

电化学血糖传感器原理及发展电化学血糖传感器原理及发展 前言前言 葡萄糖是一种在全世界范围内被分析测试最频繁的物质之一。电化学法血 糖检测系统已经成功开发了 3O 余年，目前全世界每年约消耗 60 亿片电化学血 糖测试试纸，是糖尿病人实施血糖自我检测、有效控制病情的重要手段。血糖 试纸实质是在一些塑料基片上印刷了导电碳墨和银墨后再复合印刷含酶涂层的 生物电化学酶传感器。我国现有糖尿病人 4000 万，每年还以 15的速度在 增加，对葡萄糖分析检测的研究也曰渐增多，因此，近年来有关葡萄糖氧化酶 电极的研究论文每年都有上千篇，国内也有上百家研究单位、lO 多家企业在从 事血糖仪和血糖试纸的研发和生产。 1 电化学葡萄糖传感器的研究基础电化学葡萄糖传感器的研究基础 电化学酶法测定葡萄糖可追溯到上世纪的 30 年代末，当时通过测定铂金 电极上过氧化氢的氧化分解而产生的电流变化测算出溶液中因氧的消耗导致的 氧分压下降值，进而测得葡萄糖的浓度。其反应过程如下： 葡萄糖+FAD葡萄糖氧化酶葡萄糖酸内酯+FADH2葡萄糖氧化酶 FADH2葡萄糖氧化酶+02FAD葡萄糖氧化酶+H2O2 H2022H+O2+2e- 25 年后，美国的 Updike 和 Hicks 成功简化了葡萄糖的电化学测定方法， 他们将葡萄糖氧化酶固定在某种胶体基质中实现了酶的固定和稳定化，使葡萄 糖氧化酶催化剂可以被反复使用。此后他们将固定后的葡萄糖氧化酶制成膜片 同 Clark 极谱式氧电极结合，制成了世界上第一个酶电极。 2 导电介质葡萄糖酶传感器的发展导电介质葡萄糖酶传感器的发展 随着葡萄糖电化学分析系统的成功商业化，1970 年 Williams 等试图采用 分子导电介质取代氧分子进行氧化还原电子传递的尝试。他们使用铁氰化钾 亚铁氰化钾导电介质系统成功实施了血液葡萄糖的电化学测定，同时还用同一 电化学系统测定了血乳酸。 尽管日后这一开创性的电化学测试原理被广泛使用在公司血糖仪的开发和 生产实践中，但遗憾的是当时并未被直接应用于家用血糖仪测试系统的商业化 开发。 世界上第一个便携式家用电化学血糖测试系统是 1987 年由美国 Medisense 公司推出的 ExacTech，该系统采用二茂铁及其衍生物作为氧化还 原导电介质，通过丝网印刷导电碳墨在 PVC 塑料基片上，制成外观尺寸如同 pH 试纸大小的血糖试纸，可以大规模制作生产。 3 血糖测试电化学试纸的产业化开发血糖测试电化学试纸的产业化开发 由于潜力巨大的全球糖尿病测试消耗品市场的增长，糖尿病人每天测试血 糖的实际需要，实施商品化血糖试纸的开发设计和生产有着极大的商业价值。 任何生产厂家或者技术开发商为了提高产品质量，降低生产成本必将对每一款 待开发的测试系统进行全面综合考虑和评估，需要评估考虑的主要内容包括： 系统的准确度和精密度要求、血糖测定的速度、所使用氧化还原酶的种类和稳 定化方式、采样量、进样方式、试纸的外观尺寸，原材料的选择包括导电介质、 试纸基片材料和导电油墨，在仪器的外观考虑用户友好界面的设计、使用方便 性、元气件器件的价格成本、芯片的综合性能因数等。 3.1 现行血糖试纸的总体设计考虑现行血糖试纸的总体设计考虑 (1)试纸基片的材料选择 血糖试纸的基片目前都趋向于使用 PET 聚酯材料，这种材料本身具有一定 的折弯机械强度，容易实施机械切割，有利于规模化生产。材料的耐热温度达 到 120，比较适合导电油墨印刷完之后的高温固化。为了便于用户使用和操 作，基片材料的厚度可控制在 0.350.5mm，试纸的实际长宽尺寸一般控制在 6mm30mm 左右。 (2)试纸电极的工作电极和参比电极的油墨 绝大多数血糖试纸的工作电极仍然使用碳墨材料，目前可考虑选择的碳墨 有多种，较常用的有美国的艾奇森，厄康、杜邦以及英国的格温特。商业化试 纸无论使用上述哪种碳墨均有良好表现。 参比电极传统上使用银/氯化银材料，近年来从成本上考虑也有大量改用碳 材料的趋势。金属材料近年来也开始批量使用在血糖试纸的制作中，这类材料 包括金、钯、铂金等，通常采用电化学真空溅射方法均匀涂布在试纸基板表面。 (3)试纸吸血槽的设计 随着对血糖试纸的精度要求不断提高，过去建立在光电比色的基础上实施 的滴血加样法逐步被虹吸式自动进样方式取代。由于虹吸式自动进样方式具有 控制采样量大小的优点，因此虹吸式吸血槽的设计及其空间大小必须被严格限 定而由下例公式计算设定： t=3l2/(cos)h 式中，t样品吸入所需时间； 血液黏度； l吸血槽长度； 溶液表面张力； 吸血膜湿润角度； h吸血槽高度。 式表明，试纸端口吸血槽吸血时间长短同吸血槽长度的平方正相关，同 吸血槽的高度和吸血膜的湿润角度呈负相关，因此通过精心设计吸血槽可以控 制和影响血糖测试系统的反应时间和测试精度。 (4)血糖试纸上的试剂配合 血糖试纸作为一种“干试剂”试纸，对试纸上的试剂配合有严格要求。这种 含生物酶的试剂可以混合在印制工作电极的碳墨中直接印刷在塑料片表面，也 可以另行配制成水性油墨单独印刷在工作电极碳表面。使用喷涂设备生产试纸 的还应将试剂配成适当浓度的水性溶液涂布在工作电极上。 任何一种试剂配合都少不了以下几个主要成分：氧化还原酶如葡萄糖氧化 酶、葡萄糖NAD脱氢酶、葡萄糖PQQ脱氢酶和葡萄糖FAD脱氢酶等， 各种导电介质如苯醌、铁氰化钾、二茂铁、钌化合物、锇化合物等。试剂配合 中还需要黏合剂，如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、表面活性剂以及酶和导电 剂的稳定剂等。表 l 列出目前国内外比较常用的试纸制作基本原料。 表表 1 血糖试纸制作的基本化学试剂配合血糖试纸制作的基本化学试剂配合 试纸基材黏合剂导电剂试剂酶表面活性剂 PET羟乙基纤维素对苯醌葡萄糖氧化酶曲拉通 PP羧甲基纤维素铁氰化钾葡萄糖脱氢酶土温 PC胶原蛋白二茂铁葡萄糖激酶道康宁消泡剂 PVC海藻酸凝胶金属导电化合物 氟类表面活性剂 3.2 血糖试纸的标定血糖试纸的标定 血糖试纸生产完成后的校准和标定是决定试纸在使用中是否长期稳定准确 的重要步骤。标定工作包括对每批产品的血糖测定线性范围、批内批间的重复 性变异系数(CV)，血细胞压积比(HCT)以及血液中电化学活性物质对测试系统 的干扰等进行分析和评估。 (1)血糖试纸线性测定范围的校准 血糖试纸在出厂前应完成严格的校验程序，这些校验程序不仅决定产品批 次的测定有效范围，而且还要设置试纸的校验码(Code)。通常校验方法需要配 制一组 68 个浓度值的血糖样品，该样品可以由静脉血配得（具体方法可参 考 ISO151932003）。待测的试纸及其血糖仪同标准仪器，分别对这 68 个 浓度进行对照测试，得到一组电流数据值进行相关性分析计算，制作出如图 10 所示的相关性图谱，相关曲线方程中的斜率和截距可用来决定本批试纸的校正 码。一般正常生产的企业每 3050 万片一批试纸大约出一个校正码值。 图图 10 采用采用 YSI-2300 Plus 与待定血糖试纸进行对照测定并进行相关分析的图谱与待定血糖试纸进行对照测定并进行相关分析的图谱 (2)血糖测试系统的精密度和误差接受范围出厂检验中除了控制上述线性范围和 设置校验码以外，待定试纸的精密度控制也十分重要，这个直接关系到出厂试 纸的分辨率和重复性等质量品质。考察试纸的精密度一般采用 CV 值来衡量。 实验要求在血糖范围 1.130 mmol/L 范围内进行约 10 个高低不同浓度，总量 约 300 份血糖值的对照测试。目前商品化的血糖试纸其总的变异系数 CV 应控 制在 5以内，高于这个 CV 值则被判定不合格或直接认定为废品不得出厂销 售。ISO 151972003 标准还对血糖试纸的准确度误差可接受范围做出了限定， 一般每批血糖试纸同标准葡萄糖分析仪对照分析测试误差，95以上需落在 15范围内，测试数据的 100应落在20的范围内。美国 FDA 更要求所 有血糖测试系统其不同批次的血糖试纸在针对同一血糖浓度进行质控测试时， 其变异系数 CV 必须落在 5以内。在控制血糖测试测试系统的准确度方面目 前已全面推出使用 Clarke Error Grid（CEG）方法，也即克拉克网格误差分析 法，使得针对血糖测试系统的准确度误差分析更为客观合理和严格。 (3)血细胞压积对血糖测试的影响 血细胞压积（HCT）对电化学试纸测定的影响已经受到许多大厂家的重视， 一般血糖试纸的 HCT 耐受力在 3555之问，也就是在这个范围内血糖测试 的结果不受干扰。但是很多 I 型糖尿病患者往往 HCT 高于这个范围，通常会造 成血糖测试假性偏低，而很多婴幼儿的 HCT 又低于这个范围而照成血糖测试值 的假性升高。这两种现象都有可能会误导随后采取的用药措施而造成对病人的 伤害。 目前国外的大厂家已经开始采取有效的措施在生产的试纸上采取 HCT 补偿 措施，扩大 HCT 的耐受范围，比如已经有 HCT 可测试范围在 070的血糖 试纸问世。 (4)血液电化学干扰物对血糖测试的影响 采用电化学酶电极方式进行血糖测试还要受到血液中电化学干扰物质的影 响。美国临床诊断中心标准列出的干扰物质有 16 种，如表 2 所示。任何出厂 前的试纸都要实行干扰物的检测以确认出厂产品不受这些干扰物质的影响。 表表 2 美国临床诊断中心标准列出的美国临床诊断中心标准列出的 16 种电化学干扰物质种电化学干扰物质 干扰物建议测试水平 (mg/dL) 干扰物建议测试水平 (mg/dL) 对乙酰氨基酚20抗坏血酸维生素 C3 水扬酸50甲糖宁100 四环素4甲磺吖庚脲1OO 多巴胺13胆红素20 麻黄硷1O胆固醇500 布洛芬40肌氨酸酐30 左旋多巴5甘油三酸酯3000 甲基多巴2.5尿酸盐20 4 血糖测试仪器的开发和生产血糖测试仪器的开发和生产 国内血糖仪器的开发生产起始于上世纪 90 年代。当时的产品外型粗糙、 功能单一、生产成本高、产量低。随着近年来微电子行业的快速发展，单芯片 计算机的选择和使用已能完全满足诸如血糖测试和储存这样的基本功能。 作为一种兼具医疗器械和民用电子产品的血糖测试仪器，除了要符合血糖 测试的精密度、准确度要求，又要手持轻便、外表美观、多功能、界面友好以 适合于不同层次糖尿病人使用，对于血糖测试仪的设计要求是很高的。 血糖测试的原理是依据血糖仪在插入仪器的血糖试纸电极两端施加一定的 恒定电压如 300mV，当被测血样吸入电极工作区后，试纸电极表面工作区内的 葡萄糖氧化酶与血样中的葡萄糖发生氧化还原反应。经过快速的生化反应（约 5s）后，酶电极试纸产生的响应电流在 0.110A 之间，与被测血样中葡萄糖 浓度呈线性关系，在单片机的控制下检测血样响应电流的大小，从而计算得出 准确的血糖浓度值并在仪器液晶屏上显示最终结果。 冻干技术原理与工艺简介冻干技术原理与工艺简介 冻干是从冻结的物料产品中去除水分的过程，冻干分为真空冷冻干燥和常 压冷冻干燥二种，由于一些条件限制目前采用的是真空冷冻干燥。冻干目的是 保留产品的完整的生物和化学结构及其活性。象其它许多的技术步骤，一种冻 干的类型被称做升华，是自然发生的。升华指的是溶剂，比如水，象干冰一样， 直接从固态变为气态的过程。传统的干燥会引起材料皱缩，破坏细胞。这种情 况将不会发生在冻干里，因为固体构成被在其位置上的坚冰支承着。在冰升华 时，它会留下孔隙在干燥的剩余物质里。 冻干过程分为冷冻、升华、解析干燥三个阶段，每一个阶段都有相应的要 求，不同的物料其要求各不相同，各阶段工艺设计及控制手段的差异直接关系 冻干产品的质量和冻干设备的性能。 一、冷冻阶段 冷冻干燥首先要把原料进行冻结，使原料中的水变成冰，为下阶段的升华 做好准备。冻结温度的高低及冻结速度是控制目的，温度要达到物料的冻结点 以下，不同的物料其冻接点各不相同。冻结速度的快慢直接关系到物料中冰晶 颗粒的大小，冰晶颗粒的大小对固态物料的结构及升华速率有直接关联。一般 情况下，要求 1-3 小时完成物料的冻结，进入升华阶段。 二、升华阶段 升华干燥是冷冻干燥的主要过程，其目的是将物料中的冰全部汽化移走， 整个过程中不允许冰出现溶化，否则便告冻干失败。升华的二个基本条件：一 是保证冰不溶化；二是冰周围的水蒸汽必须低于 610 帕（正确的说法应是低于 物料冻结点的饱和蒸汽压）。升华干燥一方面要不断移走水蒸气，使水蒸汽压 低于要求的饱和蒸汽压，另一方面为加快干燥速度，要连续不断地提供维持升 华所需的热量，这便需要对水蒸气压和供热温度进行最优化控制，以保证升华 干燥能快速、低能耗完成。 三、解析干燥 物料中所有的冰晶升华干燥后，物料内留下许多空穴，但物料的基质内还 留有残余的未冻结水分（它们以结合水和玻璃态形式存在）。解析干燥就是要 把残余的未冻结水分除去，最终得到干燥物料 生物芯片技术简介生物芯片技术简介 一、 概述： 生物芯片这一名词最早是在 80 年代初提出的，主要指分子电子器件。美 国海军实验室研究员 Carter 等试图把有机功能分子或生物活性分子进行组装， 想构建微功能单元，实现信息的获取、贮存、处理和传输等功能。用以研制仿 生信息处理系统和生物计算机。产生了“分子电子学“同时取得了一些重要进展： 如分子开关、分子贮存器、分子导线和分子神经元等分子器件，更引起科学界 关注的是建立了基于 DNA 或蛋白质等分子计算的实验室模型。 进入 90 年代，另一类“生物芯片“引起了人们的关注，通过机器人自动打印 或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列。 实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的 筛选或检测。 二、分类 根据分子间特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集 成了芯片表面，构建微流体(Microfluidics)生物化学分析系统。按照芯片上固定 的生物分子的不同，可以将生物芯片划分为：基因芯片、DAN 芯片、蛋白质芯 片及芯片实验室(Lab-on-chip)。从其功能不同的角度，又可分为：测序芯片、 表达芯片和比较基因组杂交(CGH)芯片。 三、制备 1. 载体材料的要求：作为载体必须是固体片状或者膜、表面带有活性基因，以 便于连接并有效固定各种生物分子。 2. 载体种类：玻璃片、PVDF 膜、聚丙烯酰氨凝胶、聚苯乙烯微珠、磁性微珠。 3. 芯片制备方法： 原位合成：适用于寡核苷酸，通过光引导蚀刻技术。已有 P53、P450，BRCAI/BRCA2 等基因突变的基因芯片。 预合成后点样：是将提取或合成好的多肽、蛋白、寡核苷酸、cDNA、基因 组 DAN 等通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。由于该技术相对简易 低廉，被国内外广泛使用，目前市场上销售的芯片大多采用这一技术制作的。 接触式点样：是指打印针从多孔板取出样品后直接打印在芯片上。打印时 针头与芯片接触。优点是探针密度高，通常一平方厘米可打印 2500 个探针。 缺点是定量准确性及重现性不太好。 非接触式点样：针头与芯片保持一定距离。定量准确重现性好，但喷印的 斑点大，密度低。通常 1cm2只有 400 点。但目前把喷印点直径大小由 150100m 降到 3025m 已成为可能，可将哺乳动物整个基因组 DNA 点阵 于一张芯片上成为可能。 4. 生物样品的制备：分离纯化、圹增、获取其中的蛋白质或 DNA、RNA 并用 荧光标记，才能与芯片进行反应。用 DNA 芯片做表达谱研究时，通常是将样 品先抽提 mRNA，然后反转录成 cDNA。同时掺入带荧光标记的 dCTP 或 dUTP。 四、检测设备： 以基因芯片为例：基因芯片的原