生命科学生物技术大实验指导

实验一实验一 应用应用 TRIzol 提取病毒提取病毒 RNA 一、实验目的一、实验目的 1.了解 Trizol 法分离总 RNA 的原理和方法。 2.掌握提取、分离总 RNA 的方法。 二、实验原理二、实验原理 TRIzol（Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）是从细胞和组织中提取 总 RNA 的即用型试剂。异硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放 RNA，抑 制 RNA 酶的活性，同时与 RNA 形成可溶性复合物。在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol 能 保持 RNA 完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中。取出水相，用 异丙醇可沉淀回收 RNA。 TRIzol 试剂可用于小量样品（50100mg 组织、5106 细胞） ，也可用于大量样品 （1g 组织或107 个细胞） ，对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大 量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总 RNA 没有 DNA 和蛋白质污染，可用于 Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase 保护分析等。本试剂为红颜色，便于区分水相和 有机相，同时最大限度的保持 RNA 的稳定性。 三、实验仪器和试剂三、实验仪器和试剂 1. 仪器仪器 高速低温高心机， Eppendorf 离心管。 2. 试剂试剂 TRIzol 试剂、氯仿、75%乙醇（0.1% DEPC 配制）、1% DEPC 、异丙醇 四、操作步骤四、操作步骤 所提取物为感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的细胞中的病毒。所用一切物品无 RNA 酶。 1. 在 1.5ml 的 eppendorf 管中加入病毒原液 500l，再加入 TRIzol 溶液 500l，充分混匀， 室温放置 10min。 2. 加入 200l 的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分 相现象） ，室温放置 10min （由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心） 。 3. 离心 4、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相） 。 4. 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10min。 5. 离心 4、13000r/min、15min，小心吸去所有上清。底部有 RNA，操作需小心。1ml 75%乙醇洗一遍，离心 4、8000r/min、10min。小心吸去所有上清，在超净台中干燥 5min。 6. 加入适量 DEPC 处理水(建议立即做 RT-PCR。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于 70，可保存一年；若加入 DEPC 水后则只能在20保存 1 个月左右。)。 五、注意事项五、注意事项 1. 操作时必须戴手套。 2. 所用的器皿和试剂均须经 DEPC 水处理或 250300干烤 4h。 3. Trizol reagent、氯仿、DEPC 水是剧毒物质，要注意防护。 实验二实验二 逆转录反应逆转录反应 一、实验目的一、实验目的 掌握 RNA 逆转录扩增 cDNA 的方法和原理 二、实验原理二、实验原理 RT-PCR 是指将逆转录(Reverse Transcription；RT)反应和 PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。 RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA 合成，它是一种分析基因表达的快速灵敏的方法。 RT- PCR 用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异 而不必构建 cDNA 文库克隆 cDNA。RT-PCR 比其他 RNA 分析技术更灵敏，更易于操作。 RT-PCR 的模板可以为总 RNA 或 poly(A)+选择性 RNA。逆转录反应可以使用逆转录 酶，以随机引物、oligo(dT) 或基因特异性的引物起始。RT-PCR 可以一步法或两步法的形 式进行。在两步法 RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA 的合成首先在逆转录 缓冲液中进行，然后取出 1/10 的反应产物进行 PCR。在一步法 RT-PCR 中，逆转录和 PCR 在同时为逆转录和 PCR 优化的条件下，在一只管中顺次进行。 三、实验仪器和试剂三、实验仪器和试剂 1.仪器仪器 PCR 仪、离心机、灭菌的 PCR 管、移液器等 2.试剂试剂 实验一中提取的总 RNA ；随机引物及 Oligo（dT） ；逆转录酶；dNTP；RNA 酶抑制 剂 四、实验步骤四、实验步骤 1. 在冰浴离心管里面加入模板 RNA 4L，引物 2L，去离子水 5L，混匀，离心 3-5 秒； 2. 70水浴 5 分钟，冰浴 30 秒（此处是为了使引物和模板正确配对） ； 3. 加入 5反应液 4uL，RNase 抑制剂 1L，dNTP 2L（这些应该先配好，然后分再装到 每一管） ，混匀； 4. 37水浴 5 分钟，加入 1L AMV-RT 反转录酶，混匀； 5. 37水浴 1 小时（此步是反转录过程） ； 6. 7010 分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰） ，产物置冰上进 行下一步 PCR 实验，余下的-70保存。 五、注意事项五、注意事项 1. 在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA的完整性。 2. 操作人员在实验过程中手套要勤换。 3. 加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均。 实验三实验三 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 一、实验目的一、实验目的 1. 了解聚合酶链反应（PCR）的基本原理及其影响因素， 2. 掌握 PCR 的基本操作过程。 二、实验原理二、实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）即 PCR 技术，是一种体外扩增特定基因 或 DNA 序列的 方法。PCR 具有很高的特异性、灵敏度，在分子生物学、基因工程研究、 某些疾病的诊断以及临床标本中病原体检测等方面具有极为重要的应用价值。 双链 DNA 分子在接近沸点的温度下解链，形成两条单链 DNA 分子（变性） ，与待扩 增片段两端互补的寡核苷酸（引物）分别与两条单链 DNA 分子两侧的序列特异性结合 （退火、复性） ，在适宜的条件下，DNA 聚合酶利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷酸 （dNTP） ，在引物的引导下，按 5至 3的方向合成互补链，即引物的延伸。这种热变性、 复性、延伸的过程就是一个 PCR 循环。随着循环的进行，前一个循环的产物又可以作为下 一个循环的模板，使产物的数量按 2n 方式增长。从理论上讲，经过 25-30 个循环后 DNA 可扩增 106-109 倍。 影响 PCR 反应结果的因素较多，主要包括： （1）模板的质量：在制备模板 DNA 时通常需要使用蛋白变性剂及乙醇等有机溶剂，这些 物质可直接影响 PCR 反应；另外当模板 DNA 分子量很高时，解 链不易，可用限制酶消 化以改善扩增效果；从理论上说，一个模板 DNA 分子即可获得扩增产物，模板浓度过高， PCR 反应的特异性下降，实际操作中可按 1ng、0.1ng、0.01ng 递减的方式设置模板浓度对 照。 （2）引物：引物是决定 PCR 结果的关键，引物设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR 反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则： 引物的长度以 15-30bp 为宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55 Tm=4(G+C)+2(A+T) 。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是 随机的。 引物的 3端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在 3端不应 出现同源性，以免形成引物二聚体。3端末位碱基在很大程度 上影响着 Taq 酶的延伸效率。 两条引物间配对碱基数少于 5 个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过 3 个由于影响引物设计的因素比较多，现常 常利用计算机辅助设计。 人工合成的寡聚核苷酸引物需经 PAGE 或离子交换 HPLC 进行纯化。 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer） ， 二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用 低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用 0.25-0.5pmoL/L 较好。 （3）Mg2+浓度：PCR 反应体系中 Mg2+浓度对扩增结果影响较大，通常是 1.5- 4mmoL/L，必要时可调整 Mg2+浓度。 （4）dNTP 浓度：1.25mmol/L，dNTP 浓度过高，反应的特异性下降。 （5）反应条件：PCR 反应条件中最重要的是退火温度，退火温度低，引物容易结合到模板 的靶 DNA 序列，但反应的特异性下降；反之，特异性增加，但 扩增效果不佳。一些生物 技术公司在合成引物时注明了 Tm 值，以此为依据，退火温度比 Tm 值低 3-5比较适宜。 当然，在实际操作时可设置梯度以确定最佳退火温度。 三、实验仪器和试剂三、实验仪器和试剂 1. 仪器仪器 PCR 仪、台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外检测仪 2. 试剂试剂 引物：用去离子水配成 10 mol /l；Taq 聚合酶；10PCR 反应缓冲液（加镁离子） ； dNTPs：四种核苷酸混合物（浓度为 10mM） ；模板：反转的病毒 cDNA；1%琼脂糖凝胶； 50 TAE 电泳缓冲液(1000 mL)：Tris 242 g、Na2EDTA2H2O 37.2 g，溶于 600 ml 去离子水中， 加冰乙酸 57.1 ml，最后用去离子水定容至 1000 mL；6上样缓冲液：0.25% 溴酚蓝；0.25% 二甲苯睛蓝，30%甘油，溶于水中，4保存。 四、实验步骤四、实验步骤 1. 反应混合液的配制反应混合液的配制：在一个 0.5mlPCR 管中加入下列成分。充分混匀，离心片刻，确保 管壁上液体沉入底部。 两种引物（各）1l 10PCR 缓冲液5l dNTPs （10mM each）1l 模板1l Taq 酶1l 去离子水补至 50l 2. PCR 反应条件反应条件 循环 1：94，3 分钟；循环 2-31：94变性 45s、52退火 45s、72延伸 1min；共 30 个循环；最后 72延伸 10 分钟。 3. 反应产物在反应产物在 1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。琼脂糖凝胶上进行电泳分析。 1）用 1 TAE 缓冲液配制琼脂糖凝胶：在电子天平上准确称取琼脂糖 0.2g，倒入 100 ml 三角瓶，加入 20 mL 缓冲液。 2）微波炉上加热 40s。 3）待冷却至 60左右时，加入 1L goldenview，摇匀。 4）将凝胶倒入预先准备好的制胶板上，插入梳子，待冷却。 5）将 PCR 产物在琼脂糖胶上电泳：80V，20min。 6）取出凝胶，在紫外灯下观察，记录观察结果。 7）用手术刀切取大小正确的 PCR 产物，放入 1.5mL 的 EP 管中。 4. PCR 产物的纯化产物的纯化 1） 加入胶重量 3 倍体积的溶液 A，42下溶解胶，期间颠倒几次促进其溶解。 2） 加入 1 倍溶液 A 体积的异丙醇，混匀后移入 PCR 产物回收柱，6000rpm 离心 30 秒， 将滤过液再次加入回收柱，6000rpm 离心 30 秒。 3） 加入洗涤液 500l，12000rpm 离心 30 秒，弃去洗涤液。 4） 重复步骤 3 一次。 5） 换 1.5ml EP 管，12 000 rpm 下离心 10 min。 6） 换 1.5ml EP 管，在回收柱中膜的中央加入 50ul 去离子水，12000rpm 下离心 1min，获 得纯化的 PCR 产物待用。 五、注意事项五、注意事项 由于 PCR 灵敏度非常高，所以特别需要防止反应混合物受到 DNA 的污染，因此在实验中 应注意下列事项： 1. 所有与 PCR 有关的试剂，只作 PCR 实验专用，不得挪作它用。 2. 操作中使用的 PCR 管、离心管、吸头等，只能一次性使用。 3. 特别注意防止引物受到用同一引物扩增的 DNA 的污染。所有试剂，包括引物，应从母 液中取一部分稀释成工作液以供平常使用，避免污染母液。 实验四实验四 质粒质粒 DNA 酶切、连接、转化、筛选、鉴定酶切、连接、转化、筛选、鉴定 一、实验目的一、实验目的 1. 学习和掌握限制性内切酶的特性 2. 掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3. 掌握利用 CaCl2制备感受态细胞的方法 4. 学习和掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法 5. 学习用试剂盒提取重组质粒 DNA 的方法 二、实验原理二、实验原理 重组质粒的构建需要对 DNA 分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。 限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶酶切分离法适用于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等 DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方 法也比较简单。 DNA 连接酶催化双链 DNA 片段相邻的 5-磷酸和 3-羟基间形成磷酸二酯键。在分子 克隆中最常用的 DNA 连接酶是来自噬菌体的 DNA 连接酶：T4 DNA 连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的 DNA 片段；2、连 接双链 DNA 分子间的平端；3、在双链平端的 DNA 分子上添加合成的人工接头或适配子。 目的 DNA 片段与载体 DNA 片段之间的连接方式（以 T4DNA 连接酶为例）主要有以下几 种： 1. 具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割 DNA 分子，形成 14 核苷酸单链 的粘性末端。当载体和外源 DNA 用同一种限制性内切酶切割时，会产生相同的粘性末端， 连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同粘性末端的限制酶 （同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组 DNA 分子消失了原来用 于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段 重新切割下来。 2. 平末端的连接 载体分子和外源 DNA 插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多 情况都是例外的，因为有些限制酶切割 DNA 分子之后所形成的是平末端的片段；有的实 验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源 DNA，形成的也多半是非互补的粘性末 端或平末端；再如用机械切割法制备的 DNA 片段，PCR 扩增的和化学合成的 DNA 片段或 由 RNA 为模板反转录合成的 cDNA 片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对 DNA 平末端均能在 T4 DNA 连接酶催化下进行连接，这给不同 DNA 分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端 的 5磷酸基团或 3羟基与另一个平末端的 3羟基和 5磷酸基团同时相遇的机会显著减少， 通常平末端的连接速度为粘性末端的 1/101/100。为了提高其反应活性，一般选择 16较 为合适。 外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组 DNA 分子，重组 DNA 分子必须导入 适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。随着基因工程的发展，从低 等的原核细胞，到真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程 的受体细胞。选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。 所谓受体细胞（receptor cell）又称为宿主细胞或寄主细胞（host cell）等，从实验技术 上讲是能摄取外源 DNA 并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研 究价值的细胞。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。一般情况下，受体细胞的选 择应符合以下基本原则： （1）便于重组 DNA 分子的导入；（2）能使重组 DNA 分子稳定存在于细胞中；（3）便 于重组体的筛选；（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长；（5）安全性高，无致 病性，不会对外界环境造成生物污染；（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低 的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达； （7）受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性；（8）具有较好的转译后加工机制，便 于真核目的基因的高效表达；（9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。以上是受 体细胞选择的总原则，在实际应用过程中，可根据具体需要或用途而重点考虑其中部分要 求即可。 原核生物细胞: 是较为理想的受体细胞类型，其原因是： 大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源 DNA 进入；没有核膜， 染色体 DNA 没有固定结合的蛋白质，为外源 DNA 与裸露的染色体 DNA 重组减少了麻烦； 基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；原核 生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周 期短，重复实验快。 鉴于上述原因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和 cDNA 文库， 或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主菌。至今被用作受体 菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌等。大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为 广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系 统。 体外连接的 DNA 重组分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外 源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染） 、转导、显微注射和电穿孔等多种 不同的方式。本实验以大肠杆菌为受体的基因转移。 转化方法：重组质粒 DNA 分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳 定维持和表达的过程称之为转化（transformation） 。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自 供体菌的游离 DNA 片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因 组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。 以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤： （1）细菌感受态的形成；（2）转化因子的吸收；（3）整合复合物前体的形成；（4）单 链 DNA 转化因子的整合；（5）转化子的形成。 大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不 同，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其 亲缘关系较远的 DNA 分子更是如此。因此在大肠杆菌的重组质粒 DNA 分子的转化实验中， 很少采取自然转化的方法，通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化 处理，其中代表方法之一是 Ca2 诱导的大肠杆菌转化法。 Ca2+诱导的转化：细菌处于容易吸收外源 DNA 状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进 入感受态的操作叫致敏过程。重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人 工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细菌内。其原理是将处于对 数生长期的细菌置于 0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时 Ca2+使细胞膜磷脂 层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大 肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入 DNA，Ca2+ 又与 DNA 结合形成抗脱氧核糖核酸酶 （DNAase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的 42热脉 冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加， DNA 分子便趁机进入细胞内。Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克 DNA 能获得 105106 个转化子，环化重组子分子愈小，转化率愈高，环状 DNA 分子比线性 DNA 分子的转化率 高 1000 倍。 转化子的筛选以及鉴定：在重组 DNA 分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的 受体细胞都能被导入重组 DNA 分子，一般仅有少数重组 DNA 分子能进入受体细胞，同时 也只有极少数的受体细胞在吸纳重组 DNA 分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量 未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们 所期待的重组 DNA 分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源 DNA 片段形成非期待重组 DNA 分子导入所致。因此，如何将被 转化细胞从大量受体菌细胞中 初步筛选出来，然后进一步检测到含有期待重组 DNA 分子的克隆子将直接关系到基因克 隆和表达的效果，也是基因克隆和工程操作中极为重要的环节。 在构建基因工程载体系统时，载体 DNA 分 子上通常携带了一定的选择性遗传标记基 因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化 子或重组子的初步筛选。一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在 选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转 化子。 选择培养基是根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用 LB 培养 基，在 LB 培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体 DNA 分子 上携带的选择标记基因所决定，一般与标记基因的遗传表型相对应，主要有抗菌素和显色 剂等，相应的筛选（选择）方法包括抗药性筛选、插入失活筛选和显色互补筛选等。 三、实验仪器和试剂三、实验仪器和试剂 1. 仪器仪器 恒温振荡培养箱、高速离心机、旋涡振荡器、水浴锅、酒精灯、微波炉、天平、电泳 仪、制胶槽、电泳槽、梳子、锥形瓶、量筒、移液枪、微量移液器 2试剂试剂 pCold-I 的质粒、质粒提取试剂盒、LB 培养基、抗生素氨苄青霉素(50ug/L)、TAE 电 泳缓冲液(10)、琼脂糖、50TAE 缓冲液、溴化乙锭(EB)、DNA marker、冰盒、枪尖、 Eppendorf 管、塑料薄膜、手套、记号笔。 四、实验步骤四、实验步骤 1. 准备阶段准备阶段 1)LB 培养基的制备 配置 1L 液体 LB 培养基：称取 10g 蛋白胨，5g 酵母浸膏及 10g NaCl, 加 1L 去离子水。 高压灭菌。 2)配置 500ml 固体 LB 培养基（氨苄抗性）：称取 5g 蛋白胨、2.5g 酵母浸膏、5g NaCl 及 15g 琼脂，加入 500ml 去离子水，高压灭菌。在大约培养基的温度与手背的温度差不多 时，加入 500l 的氨苄青霉素（先预热再将氨苄青霉素打入培养基中） ；倒平板，大约每个 平板 20ml； 3)枪尖及 EP 管的准备 1000 l、200l、20 l 的枪尖在枪尖盒内装好，EP 管放置饭盒内贴上标签，灭菌，备用。 2. 实验阶段实验阶段 2.1 酶切酶切 1)pCold-I 的质粒 DNA 酶切体系： 22l dd H2O、20l pCold-I 质粒 DNA、5l 10Fast digest 缓冲液、NdeI 和 Hind限制性内切酶各 1.5 l。 2)按上述的顺序将酶切体系加好，混匀，置于 37的水浴锅内孵育 2h。 3)酶切反应混合物琼脂糖电泳，回收相应条带。 4)取回收产物 40l，加入 5l 10碱性磷酸酶缓冲液，4l 去离子水，1l 碱性磷酸酶对 载体进行去磷酸化处理 1.5h，除去其 5末端的磷酸基，防止环化。连接反应后的缺口可在 转化细胞后得以修复。 5)用 PCR 产物纯化试剂盒回收上述反应体系中的载体。 a.加入 5 倍体积结合液及 1 倍体积异丙醇混匀后加入离心柱。 b.6000rpm 离心 1min，将滤过液重新倒入离心柱，6000rpm 离心 1min。弃去滤过液。 c.加入 500l 洗涤液，12000rpm 离心 30s，弃去滤过液。重复一次。 d.将离心柱取出置于 1.5ml 的 EP 管中， 12000rpm 下离心 10min； e.将离心柱取出置于 1.5ml 的 EP 管中，加入 40l 洗脱液或去离子水，将液体加在离心 柱的孔中，静置 2min 之后于 12000rpm 下离心 1min; f.将离心柱取出，将 EP 管中的质粒 DNA 做好标记，备用。 2.2 连接连接 1)连接体系：9l 的去离子水、3l 酶切的 pCold-I 载体、2l 的 10Buffer、1l 的 T4 连 接酶。 2)按照上述顺序依次加入，混匀，离心，4下连接过夜。 2.3 制备感受态细胞（无菌条件）制备感受态细胞（无菌条件） 1)将事先已经培养好的 OD600 值为 0.5 左右的大肠杆菌的菌悬液置于冰上，备用； 2)取出三个 EP 管，在酒精灯上将菌悬液加到三个管中，每管 1.5ml； 3)之后在 5000rpm 下离心 5min,离心之后将上清液倒掉（在酒精灯下） 4)之后再在每管中加入 1.5ml 的菌悬液，离心，倒掉上清液； 5)加入 800 l 的 CaCl2混匀，之后冰浴 5min； 6)5000 rpm 离心 5min，倒掉上清； 7)加入 100 l 的 CaCl2，混匀即可，之后放置在-4冰箱中备用，或者在冰盒中。 2.4 转化转化 1)在感受态细胞中分别加入连接产物，冰浴 30min。 2)混合均匀，42热击 90s（时间要准确计时） ； 3)之后置于冰上，再在每管中加入 200l 的新鲜的 LB 培养基； 4)摇床振荡培养 3-4h。 2.5 涂布及培养涂布及培养 1)涂平板（无菌条件） 2)在平板上做好标记，之后在 37下培养 12-16 小时。 3)涂布观察：在含有 Amp 的平板上涂有连接液的平板上可以看到白色的菌落，这就是我 们所需要的连接上的重组子形成的菌落。 2.6 质粒的提取质粒的提取 1)用接种环挑取平板上单独的大的白色菌落在液体培养基中； 2)挑取两管菌液，做好标记，37振荡培养过夜； 3)用试剂盒提取质粒： a.在两个 EP 管中各加 1.5ml 的菌液，10000rpm1min，之后倒去上清，在各加 1.5ml 菌 液离心（两管菌液不要混用，可以看做两种质粒） ； b.吸取上清后，加入 250l 溶液，充分振荡混匀，使细胞悬浮； c.加入 250l 溶液，请求那个翻转倒置数次，直到获得透明的裂解液； d.加入 350l 溶液，立即翻转倒置数次至有絮状沉生成； e.之后离心，10000rpm10min，吸取上清于离心柱中，离心 10000rpm1min，弃收集管 中的液体； f.在离心柱中加 500l BufferHB，离心 10000rpm1min，弃收集管中的收集液； g.在离心柱中加入 700l Wash Buffer，离心 10000rpm1min，弃收集管中的收集液； h.空离心柱再离心 13000rpm2min； i.将离心柱取出置于 1.5ml 的 EP 管中，加入 40l 洗脱液或水,将液体加在离心柱的孔中， 静置 2min, 之后离心 13000rpm1min; j.将离心柱取出，将 EP 管中的质粒 DNA 放好，做好标记。 2.7 重组质粒重组质粒 DNA 的酶切验证的酶切验证 1)重组质粒 DNA 的酶切体系：14 l 的 dd H2O，10l 的重组质粒 DNA，5l 的 10Buffer，0.5l 的 NdeI 和 XbaI 内切酶； 2)按照上述的顺序，一次加入，混合均匀，置于 37的水浴锅内孵育 1h； 2.8 电泳电泳 1)在所得的酶切液中加入 3 微升的 10样品缓冲液,混合均匀点在胶孔中，点上相应的核 酸 marker。电泳完毕后在紫外灯下分析条带； 2)实验结果分析：pCold-I 载体为 4.5kb，而 PRRSV 的 nsp7A 基因大小 520bp。因此在重 组质粒酶切的泳道上如果存在这两个大小的条带表明已经成功构建 pCold-I-prrsv-nsp7A 表 达载体。 五、注意事项五、注意事项 1. 限制性核酸内切酶的酶切反应属于微量操作技术，无论是 DNA 样品还是酶的用量都很 少，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系。 2. 注意酶切加样的次序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和 DNA，最后加酶。前几步要 把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从 -20冰箱取 出，酶管放置在冰上，取酶液时洗头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染 过多的酶液，取出的酶液应立即加入反应混合也得液面以下，并充分混匀。酶液使用完毕 后立即放回冰箱，防止酶的失活。 3. 注意盖紧 Eppendorf 管的盖子，防止水浴加热的过程中水汽进入管内，并注意做好标标 记以防样品混淆。 4. 为了提高连接效率，一般采取提高 DNA 的浓度，增加重组子比例。这样就会出现 DNA 自生连接问题， 5. 勿将含有 DNA 的凝胶长时间暴露在紫外灯下，减少紫外线对 DNA 造成的损伤。要回 收 DNA 时，尽可能采用长波长的紫外灯(300360 rim)。切胶时，紫外照射时间应尽量短， 以免对 DNA 造成损伤。 6. 涂布时先将涂布棒蘸取酒精，再在酒精灯火焰上烧三遍，烧时酒精会引燃，注意安全。 7. 酶切、连接及转化等涉及微生物部分的实验要注意无菌操作，涉及分子实验的部分虽然 不用无菌，但要注意不要污染杂质。 六、实验小结六、实验小结 质粒的酶切、连接、转化、重组子的筛选及质粒的提取等操作通过一系列实验有了进 一步的了解。学会了分析琼脂糖凝胶电泳所反应出来的信息，如看片段大小、连接结果的 分析等。通过这次一系列的实验，熟悉分子实验的基本操作技术，在平时的学习中学到的 很多分子生物学和基因工程的知识都得到了应用，这些操作中的注意事项都有了了解。现 在，经过学习，最有收获的就是相信等做完了后面的实验，自己就可以进行一系列简单的 分子实验了。 实验五实验五 目的蛋白原核表达与纯化目的蛋白原核表达与纯化 一、实验目的一、实验目的 1. 掌握目的基因原核诱导表达的原理和方法 2. 了解目的蛋白“标签”纯化的基本原理和方法 3. 掌握 PAGE 变性凝胶电泳的原理和方法 4. 掌握考马斯亮蓝染色的方法 二、基本原理二、基本原理 1. 目的蛋白的表达目的蛋白的表达 E.coli 的乳糖操纵子编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列 O，一个启动序列 P 及一个调节基因 I。I 基因编码一种阻遏蛋白，与 O 序列结合，使操纵 子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列 P 的上游还有一个分解（代谢）物基因激活 蛋白 （CAP）结合位点。由 P 序列、O 序列和 CAP 结合位点三者共同构成 lac 操纵子的 调控区，三个酶的编码基因由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存 在时，lac 操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I 序列在 PI 启动序列操纵下表达的 Lac 阻遏 蛋白与 O 序列结合，阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结 合，抑制转录启动。当有乳糖存在时， lac 操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞， 经-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构 象发生变化，导致阻遏蛋白与 O 序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一 种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢且十分稳定，因此被实验室广泛应用。 带有 T7 lac 启动子的载体这些质粒在紧邻 T7 启动子的下游有一个 lac 操纵子序列。 它们同样带有常规启动子以及编码 lacI 阻遏蛋白的序列，T7 lac 和 lacI 启动子位置交错。 采用这种载体和 DE3 溶原菌，lac 阻遏蛋白既可以作用于宿主染色体 lacUV5 启动子，抑 制宿主聚合酶转录 T7 RNA 聚合酶，也可以作用于载体 T7 lac 启动子，从而阻断任何 T7 RNA 聚合酶导致的目的基因转录。普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子的区别在于蛋白表达 的严紧性不同。T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列， 属于高严紧性的启动子。该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录。 而普通的 T7 启动子表达量更高些。 如果这还不够，更为严谨的调控手段还有在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制 T7 RNA 聚合酶的基因T7 溶菌酶，降低本底表达。常用的带溶菌酶质粒的表达菌有 pLysS 和 pLysE，相容的 ori 都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者 低得多，对细胞生长影响小，而 pLysE 会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节， 增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。 蛋白表达系统有原核细胞表达系统和真核细胞表达系统。原核细胞表达系统常用大肠 杆菌表达系统，实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备但不能有效地对重组蛋 白质进行修饰加工，易形成包涵体；真核细胞表达系统分酵母表达系统、昆虫表达系统、 哺乳动物细胞表达系统，表达的蛋白具有正常的活性、构象 技术难度较大、耗时、耗资。 原核细胞表达系统菌株因菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定， 所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的 BL21 系列就是 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。 2. 目的蛋白质的纯化目的蛋白质的纯化 用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （Tag） 。标签位于表达载体的多克 隆位点的 N 端或者 C 端，能够与目的基因融合表达（N 端或者 C 端融合表达） 。目前常用 的标签有组氨酸标签（His-Tag） ，谷胱甘肽 S 转移酶（glutathione S transferase）标签 （GST-Tag） ，硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）标签，麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP） ，白质 A（protein A） ，纤维素结合位点（cellulose binding domain）标签等。 一般对于小分子用较大的 Tag（如 GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小 Tag（如 His）减少对目的蛋白的影响。 GST 可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。由于 GST 对谷胱甘肽的亲和力非 常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对 GST 及其融合蛋白进行 纯化，最后通过含有游离的谷胱甘肽的缓冲液,洗脱结合的 GST 融合蛋白。Poly His 多聚组 氨酸能与多种过渡金属或过渡金属鳌和物结合，因此带 HIS-6 的蛋白能结合与固化的 Ni2+ 树脂，用适当的缓冲液（PBS）洗冲洗去除其他杂蛋白后，再用可溶的竞争性鳌合剂（咪 唑）洗脱可以回收靶蛋白。 3. 目的蛋白质的检测目的蛋白质的检测 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质分子量最 好的方法。SDS 是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠， 破坏蛋白质分子的二级和三级结构。在样品和凝胶中加入 SDS 和还原剂后，强还原剂例如 巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，通过加热使蛋白质解离。 解离后的氨基酸侧链与 SDS 结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。 三、实验仪器与试剂三、实验仪器与试剂 1. 仪器仪器 低温摇床、电泳仪、染色盘、脱色盘 2. 试剂试剂 1) LB 培养基（1L：5 酵母膏，10g 氯化钠，10g 蛋白胨） ； 2) IPTG 贮备液：2 g IPTG 溶于 10 mL 蒸馏水中，0 . 22 m 滤膜过滤除菌，分装成 1 mL / 份，20 保存。 3）染色液：考马斯亮蓝 R-250 1g、甲醇 500ml、蒸馏水 450 ml、冰醋酸 50 ml 4）脱色液：甲醇 500 ml、蒸馏水 450 ml、冰醋酸 50 ml 5）蛋白电泳相关溶液的配制 30%丙稀酰胺混合液: 29g 丙稀酰胺 1g N,N-亚甲基双丙稀酰胺 加 ddH2O 100mL ,加热助溶, 4避光保存。 10mL 12%分离胶: 3.3mL ddH2O 4.0mL 30%丙稀酰胺混合液 2.5mL 1.5M Tris-HCl (pH8.0) 0.1mL 10%SDS 50L 10%过硫酸铵 10L TEMED 4mL 5%浓缩胶： 2.46mL ddH2O 0.66mL 30%丙稀酰胺混合液 1.04mL 1.0M Tris-HCl(pH6.8) 0.04mL 10%SDS 13.3L 10%过硫酸铵 4L TEMED 5Tris-Glycine Buffer： 0.125M Tris 1.25M Glycine 0.5%(W/V) SDS 5SDS-PAGE Loading Buffer： 2.5M Tris-HCl(pH6.8) 10%(W/V) SDS 0.5%(W/V) 溴酚蓝 50%(W/V) 甘油 5%(W/V) -巯基乙醇 6）蛋白纯化所用溶液： 缓冲液 A：20mM Tris-HCL(pH8.0)、100mMNaCL、0.1mM PMSF 缓冲液 B：20mM Tris-HCL (pH8.0)、100mM NaCl、250mM 咪唑、0.1mM PMSF 四、实验步骤四、实验步骤 1. 外源基因的诱导表达与检测外源基因的诱导表达与检测 1）将鉴定正确的重组质粒转化入 Rosetta2 感受态细胞中。 2）挑取生长状态良好的菌落，接种于 5mL 含氨苄抗性的 LB 培养基中。37，200