盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血所致学习记忆障碍的改善作用

盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血所致盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血所致 学习记忆障碍的改善作用学习记忆障碍的改善作用 黄琳 1,2 郭莲军1 李玉珍2 （1 北京大学人民医院，北京 100044； 2 华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系，武汉 430030） 摘要摘要 目的目的 探讨 Rho 激酶抑制剂盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血损伤的影响。方方 法法 永久性结扎大鼠双侧颈总动脉制作大鼠慢性低灌性脑缺血损伤模型。运用 Morris 水迷 宫检测各组大鼠空间学习记忆能力；运用在体电生理技术记录各组大鼠海马 CA3 区群峰电 位，给予高频刺激后观察诱发长时程增强(Long-Time Potentiation, LTP)的情况；免疫组化、 Western blot 技术分析 nNOS 的表达。结果结果 Morris 水迷宫检测发现模型组大鼠学习记忆能 力受损，与假手术组比较逃避潜伏期延长、空间辨别能力下降；在体电生理记录中模型组 大鼠 LTP 诱发困难；模型组大鼠皮层和海马部位 nNOS 表达均减少。给予盐酸法舒地尔能 改善脑缺血所致的大鼠学习记忆障碍，提高 LTP 诱导率和幅值，增加 nNOS 的表达。结论结论 盐酸法舒地尔可以改善慢性低灌性脑缺血所致的学习记忆能力损害、突触传递功能障碍和 神经元损伤，其可能的作用机制为增加 nNOS 的表达。 关键词关键词 盐酸法舒地尔；Rho 激酶；慢性脑缺血；Morris 水迷宫；长时程增强（LTP） ； nNOS 小 G 蛋白 Rho 参与调节多种细胞功能，如平滑肌细胞的收缩、细胞骨架的 重塑、细胞粘附和移动、胞质分裂、基因表达等1。Rho 激酶为 Rho 特征性的 效应器。目前，Rho/Rho 激酶途径在细胞水平的功能和信号转导已被广泛研究， 然而，有关该信号通路在体水平的报道则很匮乏。盐酸法舒地尔（hydroxy fasudil, HF），一种 Rho 激酶特异性抑制剂，是研究 Rho/Rho 激酶信号通路非 常有效的工具药2。该信号通路可以调节平滑肌收缩的最终阶段肌球蛋白轻链 的磷酸化水平，与血管痉挛3、动脉粥样硬化4和高血压5等疾病的发生均密切 相关。我们前期的实验也表明 HF 可缓解及预防狗迟发性脑血管痉挛，改善狗 迟发性脑血管痉挛模型的大脑皮质血流，选择性地增加脑血流量6。然而，有 关该通路在脑缺血神经元损伤方面的报道很少。 Rho/Rho 激酶信号通路与神经细胞的生长和功能活动是密切相关的。在两 种短暂性脑缺血动物模型小鼠大脑中动脉栓塞模型7和大鼠脑微血栓模型8 中， 法舒地尔或盐酸法舒地尔可显著改善神经功能并减少脑梗死体积。Lehmann 等 报道 C3 毒素抑制 Rho 从而促进神经轴突生长9。p160ROCK 抑制剂 Y-27632 促进皮质脊髓束损伤大鼠的神经轴突生长，加快其运动功能的恢复10。因此， Rho/Rho 激酶信号通路在神经损伤的病理生理过程中也占有重要地位11。 目前，有关 Rho/Rho 激酶在慢性脑缺血所致神经损伤的研究尚很少见。有 研究指出：双侧颈总动脉永久性结扎致慢性低灌性脑缺血动物模型中，大鼠前 脑区局部脑血流量和葡萄糖利用率均下降，而 Rho 激酶抑制剂 HA1077 可改善 这些变化12。然而，Rho/Rho 激酶信号通路是否参与慢性脑缺血所致认知功能 障碍和神经元损伤？本实验中，我们采用永久性结扎双侧颈总动脉方法制作慢 性低灌性脑缺血模型，观察长期给予盐酸法舒地尔对模型大鼠学习记忆能力和 突触传递功能的影响。此外，我们还探讨了药物发挥作用的可能机制。 2 作者简介：黄琳(1982-)，女，药剂师，Tel:E-mail: 1 材料和方法材料和方法 1.1 实验动物实验动物 雄性 Sprague-Dawley 大鼠，体重 180220g，华中科技大学同济医学院 实验动物中心提供。大鼠随机分笼饲养，维持室温 2022，自由摄食与饮 水，自然光照节律，每天提供足量的食物和水。 1.2 主要药品和试剂主要药品和试剂 盐酸法舒地尔(hydroxy fasudil，HF)，白色粉剂，纯度98%，Tocris Cookson Ltd. (Britol, UK)公司生产，批号 040311，临用前用生理盐水溶解并稀释至所需 浓度，注意避光；尼莫地平（Nimodipine）针剂，德国拜耳制药公司生产；兔 抗鼠 nNOS 抗体购自 Santa Cruz Biotechnology；即用型 SABC 试剂盒及二氨基 联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司； PMSF、钒酸钠、Aprotinin、Pepstatin 和 Leupeptin 均购自美国 Sigma 公司， ECL 购自美国 Pierce Biotechnology。 1.3 主要仪器主要仪器 水迷宫检测仪器及软件分析系统：EthoVision, Noldus Information Technology BV, Wageningen, The Netherlands；SN-3 型脑立体定位仪：日本 Tokyo Narishige 公司产品；SEN-7203 电子刺激器：日本 NIHON KOHDEN 公 司产品；SS-104J 隔离器： 日本 NIHON KOHDEN 公司产品；SMUP-PC 生物 信号处理系统软件：上海嘉龙教仪厂产品；低温高速 TGL 台式高速冷冻离心机： 湖南仪器仪表总厂离心机厂； DYY-8C 型电泳仪：北京六一设备厂生产。 1.4 动物模型制备动物模型制备 参考 Ni 等方法13，永久性结扎大鼠双侧颈总动脉建立大鼠慢性低灌性脑 缺血损伤模型（2VO） 。大鼠用 10水合氯醛 0.35ml/100g 腹腔内注射麻醉，仰 卧位固定，颈部去毛，强力碘消毒，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，并套 以“0”号线，分别结扎双侧颈总动脉的远近端，并从中间剪断，以确保阻断颈总 动脉血流。缝合后腹腔注射生理盐水 45ml，放回笼中饲养；假手术组除不结 扎、不剪断双侧颈总动脉外，其余过程与手术组相同。术中保持大鼠肛温 36.537.5。各组大鼠同条件饲养，在相同时间点作各种检测。 1.5 实验分组与给药实验分组与给药 Sprague-Dawley 大鼠随机分为五组：假手术组；脑缺血模型组；HF 低剂 量治疗组：2VO + HF 1 mg/kg；HF 高剂量治疗组：2VO + HF 10 mg/kg；尼莫 地平治疗组：2VO + Nimo 0.028 mg/kg。术后第一天开始腹腔注射给药，每天 一次，持续 30 天。 1.6 大鼠空间学习和记忆能力检测大鼠空间学习和记忆能力检测 利用 Morris 水迷宫对各组动物学习记忆能力进行检测。各组均于造模 30 天后开始进行。测试程序包括：1. 定位航行实验；2. 空间探索实验14。 数据由水迷宫统计软件获得，以均数标准差( s)表示，各组数据用x SPSS12.0 软件处理，逃离潜伏期的组间差异用双因素方差分析(TWO-ANOVA) 进行检验，探索性实验采用单因素方差分析(ONE-ANOVA)结合 Duancans 检验。 P0.05） 。见 Fig.1A。 2.1.2 空间探索实验结果空间探索实验结果 探索过程中可观察到假手术组大鼠主要在原来平台所在象限进行来回穿梭， 其次较多地在原平台象限相邻的左右两侧象限寻找，很少跨至对侧象限；而模 型组在原来平台所在象限穿梭时间明显少于假手术组（P0.05） ，盐酸法舒地尔 和尼莫地平均可显著增加大鼠在靶象限中的游泳时间（P0.05） 。假手术组、模 型组、盐酸法舒地尔低剂量组、高剂量组和阳性药物对照组在原平台所在象限 探索时间占探索总时间百分比分别为(39.895.68)%、 （20.177.87）% 、(32.004.00)%、 （33.704.77）%、 （33.804.80）%。见 Fig.1B。 2.2 盐酸法舒地尔对盐酸法舒地尔对 2VO 大鼠大鼠海马突触传递功能的影响海马突触传递功能的影响 假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组和阳性药物对照组大鼠强直刺激 PP 纤维后 60 min 内海马 CA3 区 PS 幅值变化（Fig.2A） 。结果发现，强直刺激 PP 纤维可诱导 CA3 区 LTP 形成，其后 60 min 内 PS 相对幅值持续升高并稳定 在基础幅值的（196.39 9.43）%水平，显著高于高频刺激前（100.004.11） (P 0.01)；模型组大鼠 LTP 诱导明显被抑制，其 PS 相对幅值在各时间点均显 著低于 LTP 组(P 0.05)， 60 min 内 PS 相对幅值平均为（124.49 1.12）%； 与模型组相比，低剂量组、高剂量组和阳性药物对照组大鼠 LTP 诱导情况均得 以改善，其 PS 相对幅值在各时间点均显著高于模型组(P 0.05)。见 Fig.2B 和 Fig.2C。 2.3 盐酸法舒地尔对盐酸法舒地尔对nNOS 表达的影响表达的影响 1) 免疫组化结果显示：经DAB染色后光镜下nNOS 阳性反应产物呈深棕色， 大鼠脑内各部位都有nNOS 表达, 以大脑皮质、海马CA1区表达最丰富。 假手术组中，可见胞浆内nNOS 表达，细胞形态完整；与假手术组相比， 模型组胞浆nNOS 阳性染色明显减少；治疗组胞浆nNOS 阳性染色增强， 阳性对照药作用不如HF。见Fig.3A。 2) 免疫印迹结果显示：Western blot结果与免疫组化结果一致。在缺血脑损 伤组中，皮层和海马nNOS 阳性反应产物显著降低(P 0.05)。与之比较， HF及阳性药治疗均可上调其表达(P 0.05)。见Fig.3B。 3 讨论讨论 我们的实验结果显示永久性结扎双侧颈总动脉致慢性缺血 30 天后，大鼠皮 层和海马组织 nNOS 蛋白表达水平均下降。长期给予 Rho 激酶抑制剂盐酸法舒 地尔能减弱这些变化，并改善脑缺血所致的大鼠学习记忆能力损害，提高 LTP 诱导率和幅值，减少神经元丢失。 行为学检测发现，术后 30 天模型组出现明显的学习记忆功能障碍，表现为 逃离潜伏期的延长和在目标象限中游泳时间的缩短，表明慢性脑缺血可以导致 学习记忆障碍和神经元损伤，与文献报道一致10。有意义的是，腹腔注射 Rho 抑制剂盐酸法舒地尔，一天一次，连续 30 天后，脑缺血损伤的 SD 大鼠在习得 性试验及探索性试验中，学习能力和记忆保持能力均明显提高。提示盐酸法舒 5 地尔对大鼠慢性低灌所引起的认知功能障碍和神经元死亡具有保护作用。 长时程增强（long-term potentiation, LTP）是高频刺激引起的神经特征的稳 定变化，是反应学习记忆过程中神经元生理活动的一个重要的客观指标17。以 前研究18及我们的近期研究19亦证实刺激穿通纤维可激活 CA3 区锥体细胞并 诱发特征性场电位。因此，刺激穿通通路记录 CA3 区场电位是研究海马信息处 理机制及探究药物干预作用的良好途径。体内外实验表明缺氧或缺氧缺糖均可 使 ATP 产生减少，导致突触传递的抑制，并可影响神经递质的合成、动员和释 放，特别是在高频电刺激后，可显著减少小泡内 ATP 和递质的储存，从而影响 LTP 的诱导和维持20。本实验发现，模型组大鼠 Perforant path-CA3 通路处 LTP 诱发困难，其诱导率和幅值均低于假手术组，而盐酸法舒地尔治疗组 LTP 诱导情况得以显著改善，表明慢性脑缺血抑制 LTP，盐酸法舒地尔可以促进海 马突触传递功能。LTP 诱导过程中，海马锥体神经细胞的树突棘和分支发生动 态改变，Rho/Rho 激酶信号通路对这些结构的产生和维持密切相关21。这些电 生理学实验结果与我们在行为学实验中的发现相一致，共同表明了 Rho 激酶抑 制剂盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血损伤具有保护作用。 虽然脑内 NO 的过量释放对其周围神经元具有毒性作用，但NO 也是一种重 要的血管、神经活性物质。在正常生理情况下nNOS 催化产生的NO 作为中枢神 经系统细胞间信使分子，在学习记忆机制中具有重要作用。 NO 在突触后产生并 弥散出神经元，逆向运行至突触前以及周围相关神经元，透过细胞膜活化鸟苷 酸环化酶，使cGMP 水平升高，促进神经递质（如谷氨酸）释放，谷氨酸作用 于突触后 NMDA 及非 NMDA 受体，Ca2+ 内流进入突触后与钙调蛋白一起激活 NOS，诱发产生NO，诱导和维持长时程增强（LTP）过程，因而NO 作为逆行 信使介导 LTP 的形成22。本研究中，慢性低灌注缺血性脑损伤 30 天后大鼠皮 层和海马 nNOS 表达比假手术组显著降低，此结果与以往研究结果一致。慢性 脑缺血后期，脑血流严重减少，神经元及血管内皮严重受损，nNOS 表达持续 减少，NO 含量显著低于正常水平，可以加重脑缺血的症状。与模型组比较， 盐酸法舒地尔治疗组明显提高 nNOS 的表达，增加 NO 的含量。此时，上调 nNOS 的表达促进 NO 的合成对脑组织有保护作用。 综上所述，Rho/Rho激酶信号通路与慢性脑缺血损伤的病理生理学过程密 切相关。长期给予盐酸法舒地尔治疗可以改善模型大鼠空间学习记忆能力损害， 提高LTP诱导率和幅值，减少神经元丢失，其神经保护作用可能通过增加nNOS 的表达而实现。 参考文献参考文献 1.Hiroaki Shimokawa, Akira Takeshita. 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Morris water maze was used to measure spatial memory performance. Electrophysiological equipments were used to record long-term potentiation (LTP). The expression of nNOS was assayed by immunohistochemistry and Western blot. RESULTS: Chronic cerebral hypoperfusion in rats resulted in spatial memory impairments shown by longer escape latency and shorter time spent in the target quadrant. These behavioral dysfunctions were accompanied with reduction of LTP, decreases in nNOS protein expression. Long-term administration of hydroxyl fasudil markedly improved the spatial memory impairment, prevented the reduction of LTP, attenuated neuronal damage, enhanced the expression of nNOS. CONCLUSION: Long-term hydroxyl fasudil treatment provides neuroprotective effects on memory deficit and neuronal damage after ischemia, which may associated with enhancement of nNOS expression. Moreover, rho kinase plays a critical role in the pathogenesis of chronic ischemic cerebral damage. KEY WORDS Hydroxyl fasudil; Rho-kinase; chronic cerebral ischemia; Morris water maze; LTP; nNOS 8 (A) (B) Fig. 1. Effect of hydroxy fasudil on water maze performance deficits 30 days after 2VO in rats. (A) Each point represents the mean of escape latency results from the start point onto the hidden platform for each day. (B) The bar graph shows percentage of the time spent in the target quadrant (Q3) in 180 s probe trial (no platform). Following cerebral ischemia, the rats were given intraperitoneal injection of saline or hydroxy fasudil 1 mg/kg or 10 mg/kg, once daily for 30 days. The sham-operated group was given only saline. For A and B, each data point represents mean SD, n=7-10; aP 0.05 and aaP 0.01 when compared to sham-operated group; bP 0.05 and bbP 0.01 compared to ischemia group. 图 1 盐酸法舒地尔对 2VO 术后 30 天大鼠水迷宫成绩的影响。 （A）逃避潜伏期随时间变 化曲线图；（B）各组动物在原平台所在象限探索时间占探索总时间的百分比。 (A) 9 (B) (C) Fig. 2. In vivo effect of hydroxy fasudil on LTP in the perforant path-CA3 synapses of rats with chronic hypoperfusion after 2VO. (A) PS amplitude was measured before (left) and after (right) tetanus stimulation. LTP was inhibited in the ischemia group as compared to sham-operated group. Hydroxy fasudil at 10 mg/kg abolished the inhibition. (B) The linear graph illustrates the relative PS amplitude alteration at different time point within the 60 min after tetanus stimulation. (C) PS amplitudes expressed as the ratios of PS height of pre-tetanus divided by post-tetanus times 100% (mean SD, n=5-7). Note: significantly higher levels of PS amplitude in hydroxy fasudil treated ischemia group than those in ischemia group alone. aP 0.05 and aaP 0.01 when compared to sham-operated group;