碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展

中国畜牧兽医2011 年第 38 卷第 1 期遗传繁育遗传繁育 157 碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展 王秋颖王秋颖 (河北旅游职业学院, 河北承德 067000) 摘要摘要:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase , AP)是一种非特异性磷酸单酯酶, 能催化磷酸单酯的水解反应, 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖, 也能催化磷酸基团的转移反应。 A P 广泛存在于微生物和动物体内, 在磷生物地球化学循环过程中有重要作用, 并广泛应用于诊断学、生物化学及分子生物学等领域。 作者对碱性磷酸酶的研究历史、催化作用机制及其应用进行了 综述。 关键词关键词:碱性磷酸酶;非特异性磷酸单酯酶;催化作用机制 中图分类号中图分类号:Q 50文献标识码文献标识码:A文章编号文章编号:1671-7236(2011)01-0157-04 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase , EC 3 .1.3.相似的作用机制。另外 ,功能相似的磷酸二酯酶 ,如 1 ,AP)是非特异性磷酸单酯酶, 可以催化几乎所有蜡状芽孢杆菌中的磷脂酶 C 、桔青霉中核酸酶 P1 , 的磷酸单酯的水解反应,生成无机磷酸和相应的醇、它们的活性部位和金属离子结合位点与大肠杆菌 酚糖等还可以催化磷酸基团的转移反应且大肠AP 相似。所以 ,大肠杆菌 A P 还可作为其它磷酸酯 、, 杆菌 A P 还是一种依赖亚磷酸盐的氢化酶(Yang酶和以金属离子作辅助因子的磷酸酯酶的研究 等2004AP 存在于除高等植物外几乎所有的生模型。 , )。 物体内可直接参加磷代谢 在钙 磷的消化 吸收1 .1 大肠杆菌碱性磷酸酶的一级结构大肠杆菌 , 、 、 分泌及骨化过程中发挥了重要的作用。 1911年AP 是由两条多肽链组成的同型二聚体金属蛋白 Levene 等、1912 年 Grosser 等分离到(碱性)磷酸酯酶 ,每个单体包含 449 个氨基酸, 单体分子质量 47 酶;1934 年 , Davis 提出了碱性磷酸酶这一命名 ;ku , 有 3 种同工酶:同工酶 1 的 NH 2-末端有一个 21958 年 ,Agren 等用同位素标记的方法分离到磷酸A rg 残基, 同工酶 3 的 NH-末端无 Arg 残基 ,同工 丝氨酸;1961 年 ,Schw ar tz 在大肠杆菌中也发现了酶 2 是这两种形式的异源二聚体。AP 单体在细胞 这一复合物,并认为丝氨酸可能是 AP 活性部位的中合成后,在富含亮氨酸的 N 末端信号序列的引导 组成成分 ;1962 年 , Plocke 等证实 AP 是一种金属下 ,定位在周质间隙并二聚化,成为有催化活性的酶 酶;1981 年, Bradshaw 测定了大肠杆菌 AP 氨基酸分子。大肠杆菌 A P 分泌过程是由具有 A TP 酶活 全序列,并克隆了大肠杆菌 AP 的基因 phoA ;之后性的分泌蛋白 SecA 和陪伴蛋白 SecB 催化 多种生物 AP 的基因相继被克隆, 近些年对 AP 的(Khokhlova 等,2004)。Kononova 等(2000)研究结 果证明 ,AP 输出信号不仅存在于 AP 前体 ,也存在 结构、作用机制和功能的研究越发深入,使 AP 的应 于成熟 AP 的 N-末端 ,且其一级结构会影响 AP 分 用更加广泛。作者对碱性磷酸酶的研究历史、催化 泌功能和酶活力。 作用机制及其应用进行了综述。 1 大肠杆菌碱性磷酸酶大肠杆菌碱性磷酸酶1 .2 大肠杆菌碱性磷酸酶的空间结构1973 年, 20 世纪 80 年代相继完成了大肠杆菌 AP 、人胎Knox 等首先解析了大肠杆菌 AP 的 7 .7三维结 构 ;1985 年, Sow adski 得到 2 .8结构 ;1991 年, 盘型 AP 、人肝/骨/肾型A P 、人小肠型AP 和酿酒酵 母 AP 氨基酸序列的测定, 通过序列比较发现相似Kim 等将分辨提高至 2 .0;2000 年 , Stec 等得出 性为 25 % 30 %, 活性部位高度保守 , 都保留了1 .75 结构,更详细的阐明了酶分子的活性部位和 催化反应机制。大肠杆菌 A P 整个分子约 100 Ser102 残基 、A rg166 及金属离子配体 , 这些保守的 与催化活性相关的基团暗示了不同来源的 AP 具有50 50 ,每个单体各有一个活性部位;酶分子 整体上呈现出 / 拓扑结构,分子中央是 10 层 折 收稿日期收稿日期:2010-07-08叠片,两侧有 15 个长度不等的 螺旋, 分子顶部还 作者简介作者简介:王秋颖(1976 -), 女, 河北人, 硕士, 讲师, 主要从事生有一个 3 层 折叠和一个小的 螺旋;每个活性部 物大分子结构与功能关系研究。位都是一个凹槽 , 在酶表面开口, 活性部位对磷酸 158 遗传繁育遗传繁育中国畜牧兽医2011 年第 38 卷第 1 期 基、反应产物和竞争性抑制剂有很强的亲和性 ,但没有磷酸单酯 R-基团的明显结合位点, 符合 AP 是非特异性磷酸单酯酶这一特点(Kim 等 , 1991)。活性部位由 A sp101-Ser102-A la103 、3 个在空间上相靠近的金属离子及配体、Arg166 及其它一些相邻氨基酸残基组成。3 个金属离子 Zn1 、Zn2 和 M g2 + 的大肠杆菌 AP 的活性最强,如果被其它离子代替 ,活性将会降低约 5000 倍, 但枯草芽孢杆菌等的 AP 在 Co 离子存在下才表现出最大活性(W ang 等 , 2005)。大肠杆菌 AP 中金属离子排列成一个三角 , 创造了一个正电性环境, 为吸引和稳定底物创造了条件 ,其中 Zn1 位点的 Zn2 +在催化反应中激活一个水分子作为亲核物质进攻磷酸 丝氨酸共价中间物 , 并有助于 RO - 基团的解离;Zn2 位点的 Zn2 + 靠近 Ser102 ,在反应中激活 Ser102 作为亲核物质进攻底物;M g2 + 对于 Ser102 亲核物质的形成, 稳定酶分子在它的最大活性构型上发挥了重要作用(Ste c 等 , 2000)。 1 .3大肠杆菌碱性磷酸酶的催化作用机制 AP 催化磷酸单酯水解或磷酸基转移的反应如图 1 。首先形成共价中间体(E-P), 这一共价中间体随后水解为非共价复合物(E Pi)。如果有磷酸受体存在(如 Tris 或乙醇胺), 该酶就会表现出催化磷酸基转移的活性 ,将磷酸基转移给醇生成新的磷酸单酯。反应的限速步 骤受 pH 的影响, 酸性条件下, E-P 水解是限速步骤, 而碱性条件下的限速步骤是 E Pi 中磷酸基的解离(H oltz 等 ,1999)。 图 1 碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解或碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解或 磷酸基转移的反应示意图磷酸基转移的反应示意图 单纯酶的活性部位是被 3 个水分子占据, 和镁配位的氢氧根离子与 Ser102 的羟基 O 形成氢键 , 酶与底物(ROP)结合成复合物(E ROP), Ser102 位于解离基团的对面 , 为了亲核进攻 O 需要脱质子化 ,为此它将质子转移给与镁配位的羟基, 形成镁与水分子的配位, 同时, Zn2 也与 Ser102 的 O 配位,使之稳定在亲核状态。AP 的催化机制包括两 次置换反应 :被激活的 Ser102 羟基进攻 E ROP 复合物的磷中心, 形成共价酶磷中间体(E- Pi),E-Pi的形成引起磷中心构象的改变, RO - 基团解离,Zn1通过底物的桥接氧原子参与此步置 换促使 RO- 基团离开 ;与 Zn1 配位的亲核氢氧根进攻 E-Pi , 水解磷酸丝氨酸中间物 ,生成非共价酶磷复合物 E Pi , 同时亲核的 Ser102 再生 , 并导致第二次磷中心构象的变化。 1 .4 大肠杆菌碱性磷酸酶的功能 AP 确切的生理功能还不十分清楚 , 但认为它对有机体内磷代谢的调节有重要作用。大 肠杆菌 AP 的结构基因是 phoA ,它是 pho 调节子的一部分, pho 调节子主要调节磷的转运和代谢。Phobox 是 pho 调节子所有基因启动子区域的共有序列, 受 PhoB 蛋白的调控。 phoB 基因产物直接激活 pho 调节子的转录, 而 PhoB 蛋白又被 PhoR 蛋白磷酸化激活 。细胞外磷的水平是调控 PhoR 的信号 ,信号传递通过大肠杆菌 Pst 系统实现。当接收到环境信号后, PhoR 再去调节 PhoB , 而 PhoB 就是大肠杆菌 AP 结构基因 phoA 的直接转录调节者 。当处于低磷状态时, PhoR 使 PhoB 磷酸化 ,激活大肠杆菌 AP 结构基因 phoA 的转录 ;当处于高磷状态时, PhoR 会使 PhoB 去磷酸化以阻止 phoA 大肠杆菌 AP 结构基因的转录。 2哺乳动物碱性磷酸酶特点哺乳动物碱性磷酸酶特点 哺乳类 AP 和大肠杆菌 A P 基本三维结构框架非常相似, 与催化活性相关的部位高度保守 , 2001 年获得 PLAP 的 X -射线晶体结构也证实了这一点 (Le Du 等,2001),所以哺乳类 AP 与大肠杆菌 AP 应具有相似的催化机制。但哺乳类 A P 也有其特点 ,如哺乳类 AP 主要为膜结合蛋白, 它们通过磷脂酰肌醇葡聚糖锚定在细胞膜外侧 ;另外 ,细菌 AP 是由单基因编码 ,而哺乳类 AP 则是多基因编码的 ,细菌的 AP 分子两个亚基完全相同 ,而哺乳类 A P 分子两个亚基可能不同;哺乳类 AP 还是糖基化的分子 ;大肠杆菌 A P 每个亚基只有 4 个 Cys 残基, 形成两个链内二硫键, 而哺乳类 AP 有 5 个 Cys 残基 ,表 明至少有一个是自由的 Cys ;H oylawets 等(2006) 的研究结果还表明 , 哺乳类 AP N- 末端的正确折叠及其微环境对于整个分子结构的完整 性和催化过程中分子内转变是极其重要的;与大肠杆 菌 AP 结构相比,在人类 AP 的活性部位, 细菌 AP 的 Asp153 和 Lys328 被 His 替代, Thr155 被 Ser 替代。 目前已知人类 A P 同工酶包括:组织非特异 中国畜牧兽医2011 年第 38 卷第 1 期遗传繁育遗传繁育 159 性 AP(TNAP),来源于肝脏、肾脏、骨及其它脏器和组织 ,即肝/骨/肾型 A P , 其中骨型 AP 是成骨细胞的一种细胞外酶 ,能被释放到血液循环中,在机体的生理功能主要是在 成骨过程中水解磷酸酯, 为羟磷灰石的沉积提供必需的磷酸, 同时水解焦磷酸盐, 解除其对骨盐形成的抑制作用, 有利于成骨过程。骨型 AP 在体内的其它生化功能有待进一步的阐明 (Orimo ,2010);肠型 AP(IA P)又分胎儿 IAP 和 成人 IAP , 由肠黏膜上皮微绒毛、肾近曲小管远侧端和子宫分泌, 胎儿 IAP 又称笠原同工酶 ,它作为肿瘤标志物 ,出现于肝癌及其它器官发生肿瘤的病人血清中;胎 盘型 AP(PLAP)又分早期 PLAP 和末期 PLAP 两种形式 ,主要由孕 8 周后的胎盘合胞体滋养层细胞微绒毛分泌, 肺脏、卵巢、子官、胃肠道及其它脏器也分泌少量的 PLAP , PLAP 在人体的生理功能主要是参与细胞膜对物质的主动运 输及钙、磷代谢,提供胎儿生长发育所需营养,对胎儿 的生长发育起着重要作用 ,动态观察胎盘型碱性磷酸酶活性可作为妊娠的一项指 标;类 PLAP 又称 Nagao 同工酶,本质是精原细胞 AP(GCAP), 是一种肿瘤标记物,出现于多种癌症中 ,如精原细胞瘤、卵巢癌等。现在认为, 人类 AP 的同工酶至少来源于 4 种不同的基因:PL AP 基因、类 PL AP 基因、I AP 基因和 T N AP 基因 ,其中 TN AP 基因表达后经过不同的修饰形成肝脏、肾脏、骨等次 级同工酶, PL AP 基因也被认为是类P LA P 基因复制与突变的产物。前 3 种基因位于染色体 2q34-37 , T N AP 基因位于染色体的 1q34 36 。其它哺乳动物 AP 研究的报道多集中在鼠、猪、兔、猫、牛和犬等, 主要研究和应用的是血清 AP ,动物血清 AP 和人体一样是一组同工酶 ,主要来源于骨骼、肝脏、胎盘和小肠等。 哺乳类 AP 确切的生物学功能和作用机制还不十分清楚。目前认 为骨骼的矿化依赖于正常的 AP 的活动,对此观点最直接的证据可能是低磷酸酯酶症 。低磷酸酯酶症是一种先天性代谢紊乱的骨疾病,为 TNAP 编码的结构基因发生突变, 使血液中 AP 活力低于正常水平, 表现为骨化及骨发育不全 , 至今已有 200 多种 TNAP 突变基因型被报道 ,虽然还无法治愈,但最近间叶干细胞移植的成功为该 病的治疗提供了新的途径(Orimo , 2010)。另外, 在运输营养物质的组织中如小肠上皮刷状缘表面、 胎盘合胞体滋养层表面、胆小管表面细胞膜上 AP 的含量很高 ,提示 AP 与磷酸的转移和代谢有关。总之 , 不同组织和器官的 AP 有不同的生理功能 , 但有一 些仍然是未知的。 3碱性磷酸酶的应用碱性磷酸酶的应用 AP 在医学和分子生物学等领域有广泛的用途。在临床医 学上, 测定血清中 AP 的活力已成为诊断和监测多种疾病重要手段。AP 主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆 汁淤积性肝炎等的检查 , 患这些疾病时 , 肝细胞过度制造 AP , 经淋巴道和肝窦进入血液 , 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍 ,反流入血而引起血清 AP 明显升高(Fer-nandez 等, 2007)。而血中肠型 AP 明显升高可见于各种肠道疾病,也有文献报道某些消化 系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者血中还可 以出现免疫球蛋白复合物型 AP ,此种 A P 同工酶出现的机理尚未清楚。AP 同工酶作为肿瘤组织的一个标志也逐渐为人们所认识 ,如肺脏、睾丸、卵巢、胰腺、结肠和淋巴组织等恶性 肿瘤病人血清中含有 PLA P 。骨型 AP 作为骨代谢异常的标志物越来越受到临床重视 ;血清骨型 A P 活力的定量测定可作为监测骨形成变化的有效参数 ,在其他的骨代谢异常疾病(如骨软化症、佝偻病等)及 早期甲状腺机能亢进的病人、慢性肾衰病人、接受肾 脏移植的病人血清中的骨型 AP 活性均有不同程度的改变, 对骨型 AP 活性的检测及动态观察将为疾病的早期诊断、治疗效 果的监测、病情预后等提供有效的依据(周新等, 2006)。 在动物饲养和疾病诊断方面 , AP 是反映成骨细胞活性、骨生成状况和钙、磷代谢的重 要生化指标。钙、磷供应不足对动物的影响主要表现 为骨结构异常、软骨病、食欲降低、生长迟缓、生产 性能下降等。年幼动物血液 AP 主要来自骨骼 ,随着动物长大成熟和骨骼成年化 , 来自骨骼的 AP 逐渐减少。在动物营养研究中 ,血清 AP 活性常作为重要的生化检测指标协助评定日粮钙、磷 水平的适宜程度。在动物疾病诊断上, 依据骨质疏松等骨骼疾病发生时 AP 活性的变化规律, 可应用血清 AP 活性来诊断因钙、磷及 VD 失调所引起的骨质疾病。临床骨型 AP 的检测比血钙测定体内钙营养水平更具敏感性 ,因此, 国内外研究一致认为骨型 AP 是反映骨改变全过程最正确的指标, 其特异性、灵敏度及准确性优于其它物质的检测(王石 莹 ,2009)。另外, 在动物患肝疾患、胃肠疾患、肾脏疾病和缺锌时, 血清 AP 均会有改变 , 如果继续对脏器特异性、A P 变化机制、AP 在不同动物体内生理功能深入研究 ,会使 AP 在兽医临床上意义更大。 在免疫学研究方面, 已广泛应用 AP 标记抗体 160 遗传繁育遗传繁育中国畜牧兽医2011 年第 38 卷第 1 期 进行酶联免疫荧光反应(E LISA)和 Western 印迹分析 ,即将 A P 与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来 揭示靶与检测酶复合物的存在, 与辣根过氧化物酶相比, AP 用作标记酶的优点是稳定性高、灵敏度高 ,缺点是成本高、标记困难。 在生物化学和分子生物学方面 ,用 AP 催化除去 DNA 分子的 5末端磷酸基团以防止载体自连是基因克隆中的常规 手段之一。用 AP 脱去 5末端磷酸基团,再用(-3 2 P)A TP 标记 5末端 ,可用于化学测序, RNA 测序和特异性 DNA 或 RN A 片段的图谱构建。应用 AP 代替同位素标记核苷酸探针用于分子杂交。研究中最 常用的 AP 有 :细菌碱性磷酸酶(BAP);SAP (来源于一种北极虾);小牛肠碱性磷酸酶(CIAP);胎 盘碱性磷酸酶(PLAP)和分泌性碱性磷酸酶(SEAP), 后者是前者的 C 末 端短缺版, 与 PLAP 相比, SEAP 没有 PLAP 的 C 末端最后 24 个氨基酸(这 24 个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的 区域)。另外, 将 phoA 基因与其它基因融合表达杂合蛋白可用于基因表 达的研究。在 1995 年还报道了以 AP 作为识别元件的生物传感器。目前工业上一个普 遍的应用是基于巴氏杀菌可破坏 AP ,因此将 AP 作为检验牛奶的巴氏灭菌的标志。 4展望展望 AP 的研究已经有近百年的历史, 对于 AP 的结构、功能、性质、作用机理、活性调控等方面的 研究均已取得了不小的成就。近年来 , 科研工作者将研究目光聚焦在 AP 的生理功能及应用上, 取得了许多新成果 ,如 Gomez 等(1995)应用对骨型 AP 特异很强的单克隆抗体建立的免疫分析法具有高度的 敏感性和特异性,而且操作简便重复性好,被认为是目 前鉴别和定量骨型 AP 的最佳方法 ;Lorenz 等(2001)研究结果证实, 小牛肠 AP 具有较强的外切多聚磷酸酶活性 ;Lalls(2010)研究结果认为 ,肠型 AP 在保持肠道平衡中发挥重要作用 , 膳食可以影响它的活性 ,肠型 A P 具有参与调节碳酸氢盐分泌和十二指肠 pH 、通过脱磷酸作用控制细菌内毒素诱发的肠道炎症等 功能。但对该酶在生物体内确切的生物学功能、工作 机理,以及哺乳类 A P 的晶体结构分析等方面还有待进一步研究 ,相信随着科学的发展、科研手段的进步、对 AP 认识的不断深入 ,将使 AP 在科研和临床诊断中发挥更大的作用。 参参 考考 文文 献献 1王石莹, 闫素梅.碱性磷酸酶在动物骨骼代谢中的研究进展 J . 饲料博览, 2009(4):14 17 . 2周新, 涂植光.临床生物化学和生物化学检验 M .第 3 版.北京:人民卫生出版社, 2006 . 3惠永华, 杨国宇, 韩立强,等.国际法对乳碱性磷酸酶的检测及其 在巴氏消毒上的研究 J .中国畜牧兽医, 2007 , 35(4):14 16 . 4Fern andez N J , Kidney B A .Alkaline phosph atase:beyond the liver J .Vet C lin Pathol , 2007 , 34(9):68 70 . 5Gomez B J , Ardakani S , Ju J , et al .Monoclonal antibody 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