第七章 细菌和噬菌体的重组和连锁

第七章第七章 细菌和噬菌体的重组和连锁细菌和噬菌体的重组和连锁 我们已经看到，减数分裂和分离的关系，交叉和重组的关系，这些 现象都是真核类生物的基因传递方式的特征，是有性生殖过程的反映。 然而还有一类生物称为原核生物（Prokaryotes），它们没有明显的核， 不进行减数分裂。例如细菌在核质和细胞质之间不存在明显的核膜，又 如病毒没有细胞结构，这类生物的基因传递方式是非减数分裂式的。我 们在这一章里将讨论它们的遗传物质从一个世代到另一世代的几种传递 方式。 第一节第一节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位细菌和病毒在遗传学研究中的地位 作为遗传学研究对象的细菌和病毒作为遗传学研究对象的细菌和病毒 细菌的结构简单，世代时间短， 通常 20 分钟一代，而且容易得到它们的生化突变型，所以细菌已成为最 常用的遗传学实验材料之一。 细菌是单细胞，形状和大小变化很多，它的遗传物质是一个大型的 环状核酸分子，称之为基因带（genophore），也可称为染色体。细菌通 常由简单的裂殖法增殖。通过这种无性的分裂过程，单一细菌可在固体 培养基上形成一个菌落（clone）。虽然一个菌落有着共同的祖先，但不 是所有的菌落都是一样的。当一个细菌的遗传组成（genetic constitution）偶而发生突变（mutation）时，由这突变细菌所形成的 菌落当然跟其它菌落不同。如这种细菌的菌落或菌株（strain）已经丧 失产生某种营养物质的能力（通常是氨基酸），就称为营养缺陷型 （auxotroph），相对于缺陷型的野生型菌株，可以叫做原养型 （prototroph）。 相当长的一段时间，认为细菌只是无性生殖的，各个细菌间没有遗 传物质的交换。在 1946 年，Lederberg 和 Tatum 发现两型大肠杆菌 （Escherichia coli）间有遗传物质的交换。他们观察到，如果一型大 肠杆菌对某一化学成份是缺陷型，而另一型对另一化学成份是缺陷型， 一个混合的培养物中，偶而会出现对两种化学成份都能产生的原养型细 菌。 这些结果当然也可能是由于实验的误差，例如污染（contami- nation），新的突变或其它原因，但通过各种实验，已经可以肯定，这 种新型的细菌的起源可归致于细胞与细胞接触中遗传物质的直接交换。 近年来，很多微生物遗传学家已经研究清楚，这些物质交换是怎样产生 的，这也是我们这一章中要详谈的内容。 说到病毒，近年来这方面的研究进展很快。它们不是细胞，是比细 胞更单纯的一种生命存在形式。它们自身没有代谢机能，不能单独地生 长和增殖，必须寄生在活细胞中，利用活细胞的代谢机器来进行增殖。 病毒根据宿主细胞的不同，可以分为动物病毒，植物病毒和细菌病 毒三种。细菌病毒又称噬菌体（bacteriophage，或简写为 pha-ge）。 病毒的结构包括蛋白质的外壳和包裹在中间的病毒遗传物质一个单 一的核酸分子，这核酸分子也称为基因带或染色体。 病毒似乎是无性的，可是 Delbrck 等发现，当具有不同特性的噬菌 体添加到细菌培养中，以后在它们的后裔中出现原有病毒性状的新组合。 当排除了其它可能原因后，可以得出结论说，某种形式的遗传物质交换 是存在的，这些过程也将在本章中讨论。 细菌和病毒是遗传学研究的好材料细菌和病毒是遗传学研究的好材料 细菌和病毒结构简单，繁殖力强， 世代时间短，培养要求和生理状态的变化多，大都能在一定成分的培养 基上生长繁殖。因为细菌和病毒有这些特性，所以带来了细菌和病毒作 为遗传学研究材料的优越性： （1）细菌本身和作为病毒宿主的细菌大都能合成全部氨基酸和维生 素，能在一定成份的培养基上生长，所以容易找出营养缺陷型，并且不 难找出各个营养缺陷型所需要的物质。 （2）研究基因的作用时，常常要用到营养缺陷型，也常常需要对代 谢产物或细菌本身进行化学分析，而细菌繁殖迅速，代谢作用旺盛，在 培养中短时间内能累积大量代谢产物，所以便于基因作用的研究。 （3）突变的频率是很低的，要在几十个培养皿中才能观察到一个突 变型。现在如果所观察的性状是抗链霉素突变型，只要在培养基中加入 链霉素，那末敏感的细菌就不能形成菌落，而只有发生抗性突变的细菌 才能在培养基上长成菌落，所以可以在培养基中观察若干亿细菌中所发 生的少数突变。这种选择性培养方法是遗传学研究中一个很有用的方法。 （4）研究基因的精细结构，必须获得某一基因内的大量不同位点 （sites）的突变型，然后通过重组分析测定它们的位置。由于这些突变 发生在同一基因中，它们的位置非常接近，所以要观察极大量的子代才 能发现少数重组子，这只有用细菌和噬菌体作材料，应用选择性培养的 方法，才能做到。关于这一点，将在“基因的基本特性”一节中详细谈 到。 （5）高等动植物具有复杂的体制，比较难以着手研究一些复杂的遗 传学问题，例如代谢作用的调节控制问题等。细菌的体制简单，便于着 手。当然在细菌中得到的结论不一定能应用到高等生物中，但是可以得 到启发，推动高等生物中这些问题的研究。 除了上述这些以外，细菌和病毒作为遗传学研究的材料还有很多方 便之处，如便于建立纯系，便于长期保藏等。细菌和病毒在医学上也很 重要，研究它们还有实际意义。 第二节第二节 细菌的遗传分析细菌的遗传分析 细菌中，大肠杆菌是用得最为广泛的遗传学实验材料，因为它对于 人类不是一种严重的病原菌，而且可以在含有盐类和葡萄糖的简单培养 基上生长。 细菌的杂交细菌的杂交 细菌的杂交最初是在大肠杆菌中发现的。 大肠杆菌有很多菌株，有的对抗生素是敏感的，有的则是有抗性的， 例如在含有链霉素的培养基中，所有对链霉素敏感的细菌都被杀死，只 有抗链霉素的细菌能够生长。有的菌株在基本培养基（minimal medium）上不能生长，需要加一些特殊的物质，如氨基酸之类。例如野 生型大肠杆菌能在基本培养基上生长，而甲硫氨酸营养缺陷型只能在加 有甲硫氨酸的基本培养基上生长，生物素缺陷型只能在加有生物素的基 本培养基上生长。 这些细菌菌株通常都能真实遗传，那就是说，子代细胞跟亲代细胞 一样，有同样的生长要求。一旦我们知道了菌株间的遗传差异后，我们 就可探讨细菌能否杂交，以及有否基因的交换了。 为了方便起见，这些菌株按照它们所短缺的，不能合成的物质来命 名，取前面三个字母，右上角写上负号“-”，或正号“+”，负号代表 缺陷型或突变型，正号代表野生型。例如上面已提到过的， 甲硫氨酸缺陷型写作 met- 生物素缺陷型写作 bio- 而与它们相对的能合成这种物质的野生型写成 mat+和 bio+。对抗生 素敏感或抗性的品系，也取前面三个字母，不过在右上角写上 s 或 r，代 表敏感（sensitive）或抗性（resistant）。例如对链霉素敏感的写成 str3。 对链霉素抗性的写成 strr。 现在看 Lederberg 和 Tatum（1946 年）的一个实验：大肠杆菌 K12中 两个菌株 A 和 B，菌株 A 需要在基本培养基上补充甲硫氨酸和生物素， 菌株 B 需要在基本培养基上补充苏氨酸、亮氨酸和硫胺，因此它们的基 因型可以写作： 菌株 A：met- bio- thr+ leu+ thi+ 菌株 B：met+ bio+ thr- leu- thi- 菌株 A 与 B 在基本培养基上都不能生长，因此把它们分别涂布在基 本培养基的固体平板上，培养几天后都没有看到任何菌落。若是把 A 和 B 混合培养在含有以上五种物质的液体培养基中，几小时后，离心培养 物，把沉淀细胞洗涤后涂布在基本培养基上，发现长出了菌落，频率是 107中有一个（110-7）。用图 71 说明。 110-7是一个很低的数值，从一千万个细胞中挑出一个来，在果蝇 等传统实验材料中很难做到这一点，可是在细菌中，应用只有原养型 （met+bio+thr+leu+thi+）能在基本培养基上生长的道理，甚至比 110-7还 要低的频率都可轻而易举地挑出来，所以这种选择技术是非常有用的。 这种与亲代不同的能在基本培养基上生长的细菌是由于营养上的互 补，即一些物质从一个菌株的细胞中泄漏出来而为另一菌株的细胞所吸 收呢？还是菌株 A 和菌株 B 发生杂交后，交换遗传信息（genetic information）后，出现重组，产生 met+bio+thr+len+thi+的细菌呢？我们再来 看一个实验。 设计一种 U 型管，中间有过滤器隔开，滤器的孔很小，细菌不能通 过，但培养液和营养物质可以通过（图 7-2）。U 型管的一臂添加菌株 A，另一臂添加菌株 B（图 72）。在 U 型管中培养一些时候，再测定 每一臂的细菌，没有发现一个细菌能在基本培养基上生长。看来要有原 养型细胞的形成，两个菌株间的直接接触是必不可少的。 概括上面的两个实验，我们可以这样说，菌株 A 和菌株 B 的细菌通 过接触后，就象高等生物的有性过程一样，发生了杂交，遗传物质有了 交换，产生与两个亲代菌株不同的野生型 met+bio+thr+eu+thi+。 F 因子因子 在大肠杆菌的遗传学研究中，很早就知道，它们的遗传物质 的传递方式跟具有典型减数分裂过程的生物不同。例如两个亲本类型对 它们子裔的遗传贡献并不相等，有些亲代基因组合出现在子裔中，而另 一些则不见了。而且所有在子裔中出现的基因都是连锁的。对这些特点 有各种说法，不过 Hayes 证明大肠杆菌有性的分化后，才逐渐清楚了。 Hayes 做一个杂交试验，用的菌株跟 Lederberg 和 Tatum 用的相似： 菌株 A 菌株 B met-thr+leu+thi+met+thr-leu-thi- 但是他用链霉素处理菌株 A 或菌株 B，这种处理并不杀死它们，只 是阻碍它们的分裂。他把处理过的菌株 A 跟未处理的菌株 B 混合，或把 处理过的菌株 B 跟未处理的菌株 A 混合，结果大不相同。菌株 B 经处理 后，在基本培养基上没有活下来的；但是菌株 A 经过处理后，基本培养 基上有活下来的，而且频率跟未经处理的对照一样。 这是怎么一回事呢？一个解释是：大肠杆菌中遗传物质的交换不是 交互的，事实上一个菌株（菌株 B）作为遗传物质的受体（recipient）， 而另一菌株（菌株 A）是供体（donor）。供体经链霉素处理后不能分裂， 但仍能转移基因，而受体未受处理，当然仍能分裂，所以接受转移过来 的基因后，有可能在基本培养基上形成菌落。这种单向的基因交换可以 比之于性的差别，所以可以把供体看作是雄的，而受体是雌的。 供体和受体间性行为的不同，以后发现，是由一个微小的可转移的 因子叫做 F 引起的。F 因子又称性因子或致育因子（sex orfertility factor），它是能独立增殖的环状 DNA 分子。供体细胞含有 F 因子，记 作 F+。F+细菌的表面有称作性伞毛（sex Pili）的细长纤毛，由此与 F-细 菌接合（图 73）。F 因子具有能形成性伞毛的基因，此外 F 因子还可 改变细胞表面的构造，以防止 F+细菌间的接合。因此接合仅发生在 F+与 F-之间；而 F+与 F+间以及 F-与 F-间是不发生的。 细菌由分裂而增殖时，从 F+细菌产生 F+细菌，从 F-细菌产生 F-细菌； 但 F+细菌与 F-细菌混合培养时，F-细菌变为 F+细菌。这是因为 F+细菌与 F-细菌接合，F 因子通过性伞毛从 F+细菌转移到 F-细菌。在转移时，F+ 细菌中的 F 因子复制，其中一个虽转移到 F-细菌，原来的细菌仍为 F+。 从而 F-细菌的培养液中添加少量 F+细菌而培养时，几乎所有的细菌都成 为 F+细菌，但染色体很少通过结合而转移到 F-细菌，所以染色体上基因 的重组频率很低，还不到百万分之一。 另一方面，F+细菌丢失 F 因子，成为 F-细菌。要把 F+细菌变为 F-， 最有效的方法是用吖黄素（acriflavine）处理。调节吖黄素的浓度，使这 浓度不妨碍细菌的增殖，但可选择性地阻碍 F1因子的复制。这样在含有 吖黄素的培养液中培养 F+细菌，所有的细菌都成为 F-。 高频重组高频重组 随后不久，在菌株 A 中发现一个新的菌株，跟菌株 B（F- ）杂交时，出现重组子的频率很高，几乎比 F+F-杂交高上一千倍。这 个新的菌株就叫做高频重组（high frequency of re-combination）菌株，或 简称 Hfr 菌株。在上面已谈到过，在 F+F-杂交中，几乎所有 F-细菌都 转变为 F+，而在 HfrF-杂交中，尽管出现高频率的重组，但 F-细菌很 少有转变为 F+细菌的。这个问题使遗传学家感到迷惑不解。 用中断杂交技术作连锁图用中断杂交技术作连锁图 Wollman 和 Jacob 思考这个问题，他们想 了解 Hfr 细菌在交配中，什么时候把基因转移给 F-细菌。他们把两个菌 株混在一起，进行杂交： 菌株的基因符号的说明见表 71，把这两菌株在培养液中进行通气 培养，Hfr 细菌与 F-细菌开始接触，形成接合管。每隔一定时间取样， 把菌液放在搅拌器内搅拌，断开结合管，使配对的细菌分开。然后稀释 菌液，防止再度配对。把稀释后菌液涂布在含有链霉素，但不含有苏氨 酸和亮氨酸的培养基上。在这培养基上，带有 thr+和 leu+的 Hfr 菌对链霉 素是敏感的，而带有 strr的 F-菌不能合成苏氨酸和亮氨酸，都不能生长， 所以只有带有 thr+和 leu+的 Hfr 菌和带有 strr的 F-菌的重组子可以生长。 重组子 thr+ leu+strr的菌落影印培养（replica plating，这是使一系列培养皿 的相同位置上出现相同菌落的接种培养方法）在若干不同的选择培养基 （selective media）上，分析 Hfr 染色体上其它非选择性标记基因进入 F- 细菌的顺序和所需时间（分钟），绘制出连锁图。这种根据供体基因进 入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术，称为中断杂交技术 （interrupted mating technigue）。 * 不同基因影响同一性状时，在基因符号后加一大写字母以资区别， 如 metA，metB 等。 结果发现（表 72），在两菌株混和后 8 分钟时，还未见有供体菌 的非选择性标记基因进入 F-细胞。在混和后 9 分钟取样时，开始出现少 量叠氮化钠抗性菌落，但此时受体菌对 T1 噬菌体还是敏感的，说明 tonr 基因尚未进入 F-细菌中。混和后 11 分钟时，开始出现对 T1 噬菌体有抗 性的菌落。混和后 18 分钟和 24 分钟取样时，又陆续出现乳糖能利用 （lac+）和半乳糖能利用（gal+）菌落，而在这以前，全部菌落都属于不 能利用型。 从图 74 还可以看到，从 Hfr 菌株的基因在 F-细菌中出现开始，随 着时间的推移，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一百分数为止； 而且某一基因出现的时间愈早，它所达到的百分数也愈高。例如叠氮化 钠抗性基因出现最早，在 24 分钟时就达到大约 90的 F-菌落；半乳糖 发酵基因出现最迟，即使在混和后 60 分钟时取样，也只有 30的菌落 属于能利用型。 这些事实说明，Hfr 细菌的基因按一定的时间顺序依次地出现在 F- 细胞。因为基因是在染色体上，因此这也就是说，染色体从一端开始， 这一端称为原点（origin）或 O，以线性方式进入 F-细胞中。基因离开原 点越远，进入 F-细胞越迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程 （transfer process）停止以前，仍未转移，因而斜率较低，达到的最高值 也较小（图 74）。 Wollman 和 Jacob 认识到，根据中断杂交技术，用杂交后 Hfr 基因 最初在受体细菌中出现的时间作为指标，可以作连锁图。这里距离的单 位是分钟，那就是说，如果 ton 在 azi 开始进入 F-细胞后 2 分钟进入，那 么 azi 和 ton 相隔 2 单位。这种连锁图是根据遗传学资料作成的，并没有 什么已经知道的物理基础（图 75）。 如果让 HfrF-杂交继续进行，长达二小时，然后使之中断，这样发 现某些 F-受体转变为 Hfr。换句话说，致育因子最后转移到受体，并使 它们成为供体；但效率很低，是线性染色体的最后一个单位。这样我们 就得到下面这样的图形： 大肠杆菌的染色体呈环形大肠杆菌的染色体呈环形 用不同 Hfr 菌株进行中断杂交试验，都可 作成连锁图，可是基因转移的顺序，转移起点和转移方向却很不相同 （表 73）。 乍一看，似乎很难理解，但如仔细比较基因转移顺序，却有一定线 索可寻。每一 Hfr 菌株的基因顺序虽不相同，但不是随机的。例如所有 trp 基因都有 mal 在一边，gal 在另一边；其它基因也是如此，除非它们 是在连锁群的另一端。基因转移的顺序是不恒定的，但有规可循。例如 两个菌株（H 和 P 72）的次序是 O gel trpmal，而另外两个菌株 （C，J4）的次序是 O mal trp gal。两者的转移顺序正好相反。还有，上 面已提到过，致育因子是最后转移，所以总是在原点的另一端。 科学工作者把上面这些事实贯穿起来，提出假设说，F+细胞有一小 小的细胞质因子F 因子，能在细菌相互接合时，从 F+细胞转移到 F- 细胞，使 F-细胞成为 F+细胞。如果 F+雄性细胞的染色体是环状的，而且 还有一个 F 因子，那末任何线性的 Hfr 染色体的形成都可用 F 因子插入 环状染色体的不同地点来说明（图 76，又见图 7-15）。 F 因子整合到细菌染色体的过程因子整合到细菌染色体的过程 细菌染色体是环状的，这是从遗传 学资料推导出来的，这在当时是难以置信的概念，在若干年后才得到证 实。F 因子的插入决定了 Hfr 染色体的极性，F 因子所在的地方是末端， 而跟 F 因子相对的一点是原点，是染色体转移的起点。那末 F 因子怎样 插入到环状染色体呢？ 现在知道，F 因子也是环状 DNA 分子，跟细菌的染色体一样。在环 状的细菌染色体和环状的 F 因子间的一个简单交换，可形成一个较大的 环（图 77）。 F 因子是质粒（plasmid）的一种。所谓质粒是指染色体外遗传因索， 它可以自律地复制，并在细胞分裂时分配到子细胞中。质粒中，有的除 了可在染色体外自律地增殖以外，还可整合到染色体上，成为染色体的 一部分，这样的质粒特称为附加体（episome）。F 因子或 F 质粒在 F+细 菌中存在于细胞质内，在 Hfr 细菌中整合到染色体，所以 F 质粒是附加 体的一种。 环形的 F 因子包括几个部分：1）原点，是转移的起点；2）形成性 伞毛的基因群（gene family），使细菌表面出现一至若干性伞毛，通过 性伞毛与 F-细菌接合；3）DNA 复制酶基因，与 F 因子本身的复制有关， 以及 4）插入序列（insertion sequence，IS），与其插入细菌染色体的过 程有关（图 78）。 F 因子含有的 IS 聚集于 F 因子的某个区域，另一方面，在 E.coli 染 色体的各个区域也有多数 IS 存在。如 F 因子内的一个 IS 与细菌染色体 上的一个 IS 配对，发生交换，F 因子就整合到染色体上。IS 有极性，或 者向左，或者向右，所以交换后整合到细菌染色体的 F 方向也就随着定 了。如图 78（a）所示，F 因子的 IS3跟染色体的 proB 和 lac 之间的 IS3发生交换时，F 以顺时针方向插入 proB 与 lac 之间。若如（b）所示， 则 F 的 IS2跟 lac 与 proC 间的 IS2配对，F 以逆时针方向插入 lac 与 proC 之间。结果两者的染色体转移方向正好相反。所以前述各 Hfr 菌株染色 体的原点和转移方向的不同，可以认为是 F 因子整合到细菌染色体的不 同 IS 部位的结果。 细菌的交换过程细菌的交换过程 到现在为止，我们只讨论了杂交中遗传信息的转移 过程。这是根据杂交中产生的重组子推论出来的。然而在重组子被检出 以前，转移过去的基因必须通过一种交换过程整合到受体的基因组 （genome）去。我们现在来讨论一下这种交换过程的某些特点。原核类 中的遗传交换并不是在两整套基因组间进行，象在真核类那样，而是在 一完整的基因组（称作 F-内基因子，endogenote）与一不完整的基因组 （称作供体外基因子，exogenote）间进行，所以是在部分二倍体 （partial diploid）或部分合子（merozygote）（图 79）间进行。现在我 们把大肠杆菌的性过程概括在图 710 中。 这儿还有一点要提出来说明：部分合子中完整的 F-染色体与部分 Hfr 染色体间发生单交换是没有用的，因为环断裂后，只能产生不平衡 的部分二倍体线性染色体（图 711）。 F-染色体与部分 Hfr 染色体间发生偶数的交换，才能产生有活性的 重组子（recombinant）和片断（fragment）（图 712）。片断是部分基 因组，也就是说，只有全部基因内容的一部分，大都在以后的细胞分裂 中丢失。所以在细菌的重组中，有两个特点： 1）只有偶数交换才能产生平衡的重组子。 2）相反的重组子（reciprocal recombinant）不出现，所以在选择 培养上只出现一种重组子。 重组作图重组作图 在中断杂交试验中，可以根据基因转移的先后次序，以时 间为单位，得出基因的连锁关系。如果两基因间转移的时间单位接近两 分钟，那末用中断杂交技术，测定基因间的正确图距，就不很可靠。这 时可用传统的重组作图法（recombinationmapping）。 例如两个基因，lac 和 ade，根据中断杂交试验，知道这两基因是紧 密连锁的，而且就某些 Hfr 供体来说，ade 是 lac 之后进入 F-受体的。这 样我们就可以做杂交试验： Hfr lac+ ade+ strsF- lac- ade- strr 把这两型细菌混和，使相互作用 60 分钟。然后在含有链霉素的基本 培养基上倒平板。在这种培养基上，Hfr 细胞都被杀死，因为它们对链 霉素是敏感的，未杂交的 F-细胞也被杀死，因为它们是腺嘌呤缺陷型， 所以选出来的重组子都是 ade+ strr。因为 ade+是在 lac+之后进入 F-细胞的， 转移顺序在 ade+前面的 lac+自然也已进入，所以我们选出的 F-ade+strr，一 定是由同时得到 lac+和 ade+的部分二倍体起源的（图 713）。 把得到的重组子菌落影印培养在加有曙红和美蓝的培养基（EMB 培 养基）上，检定能否利用乳糖。如能发酵乳糖（lac+），菌落是紫红色的； 如不能利用（lac-），菌落是粉红色的。 我们选得的 F-ade+如果同时是 lac+，表明 lacade 之间没有发生过交 换；如果是 lac-，表明在这两个基因之间发生过交换，（表 74，图 714）；所以求两基因间的距离，或所谓重组频率，可用下式表示： 象 lac 和 ade 这样两个座位，根据时间单位方法，距离是 1 分钟，用 重组方法，重组值是 22，时间单位和重组值的关系，大致上是，1 个 时间单位（1 分钟）相当于 20重组值。因为时间单位接近 2 分钟时， 测得的基因间的距离，就不那么可靠，所以应该采用比较稳定的重组作 图法。 用重组频率所测得的基因间距离和由 Hfr 基因进入 F-细菌的时间先 后所测得的基因间距离基本上是符合的。 根据中断杂交实验，基因重组试验，以及其它基因定位实验的结果， 目前已经绘制出环状遗传学图，包括 52 个准确定位的基因座位，而初步 定位的基因则不下五、六百个（图 715）。 性导性导 在 1959 年，Adelberg 在大肠杆菌中发现一种新的 F 因子。正 常的 Hfr 菌株只有在性接合之末，才把性因子转移进去；而有一个 Hfr 菌株，它的性因子的转移频率似乎跟 F+菌株一样高。这种新的 F 因子象 它的原来 Hfr 状态一样，以同一方向和顺序把细菌染色体转移过去，但 是效率比普通 Hfr 低得多。这种新 F 因子转移到 F-细胞后，使 F-细胞变 为 F+细胞。由此看来，这种新的性因子似乎已从稳定的 Hfr 状态转变为 细胞质中的 F+状态。但是这种新的 F 因子仍能在同一地点整合到细菌的 染色体上，回复到 Hfr 状态，又以高频率转移细菌染色体。Adelberg 称 这种新的 F 因子为 F（F-prime）。 例如有一 Hfr 菌株，这菌株的 lac+座位（乳糖发酵基因）接近 Hfr 染 色体的末端，也就是说，lac+是最后转移的基因。他发现一个新的 F+菌株， 能把 lac+以很高频率转移到 F-lac-受体，使受体细胞在表型上成为 F+lac+，但这些 lac+菌落不稳定，偶而（110-3）出现 lac-子细胞，所以 受体细胞应该是部分二倍体，Flac+ lac-（图 7-16）。因为 F1ac+/lac- 细胞的表型是 lac+，所以知道 lac+对 lac-是显性。 利用 F因子形成部分二倍体，叫做性导（sexduction 或 F duction）。有些 F因子带有相当大部分的细菌染色体，如适当标记， 可在部分二倍体中进行重组研究。 三种不同的致育因子的相互关系三种不同的致育因子的相互关系 现在把雄性菌株（malestrains）的 不同致育因子 F，Hfr，F 的关系概述如下（图 717）。 （1） F是带有部分细菌染色体的 F 因子，它的性质在 F 和 Hfr 之 间。Hfr 通过交换，可以形成带有部分细菌染色体的 F因子，而 F因 子又可通过交换整合到细菌染色体上的原来位置，回复到以前的 Hfr 状 态。 （2）F 因子连同它所带有的部分细菌染色体可一起转移到 F-细 胞，其转移速率近于 F 因子。利用 F可以形成部分二倍体，进行重组 研究。F因子偶而也可把它所在的供体细菌的染色体转移到 F-细胞， 这是由于 F的整合，所以供体细菌染色体上基因的转移方向和顺序跟 F所来自的 Hfr 一样。 （3）有 F 因子的细胞是 F+细胞，没有 F 因子的细胞是 F-细胞。相 对于每一细菌染色体，有 13 个 F 因子，F 因子的复制是自律的。 F+F-，F 因子由供体进入 F-细胞，使受体细胞成为 F+细胞，但供体细 胞仍为 F+，其染色体很少转移。F 因子可通过简单交换整合到细菌染色 体上，形成 Hfr 染色体。反过来，通过简单交换，又可从 Hfr 染色体产 生 F 因子。不同的 Hfr 菌株的染色体转移起始点和方向不同，这是由于 F 因子整合的位置和方向不同的缘故。 （4） Hfr 能以高频率把细菌染色体转移到 F-细菌中，而 F 因子因 位于 Hfr 染色体的最末端，极少进入。F因子和 F 因子很容易转移到 F- 细胞中，但供体染色体的转移率很低。 第三节第三节 噬菌体的遗传分析噬菌体的遗传分析 很多细菌都能被噬菌体（bacteriophage，简作 phage）感染。噬菌体 是化学成份最简单的生物，它没有一般的细胞结构，它由核酸和周围的 蛋白质外壳构成。噬菌体的结构和大小变化很多，图 718 表示几种噬 菌体的形态和相对大小。 烈性噬菌体烈性噬菌体 烈性噬菌体（virulent phage）是使宿主菌发生裂解的噬 菌体。它在侵染细菌时，先吸附到菌体表面的特异受体上，由噬菌体所 产生酶的作用下，在细菌细胞壁上形成一个微孔，把它的头部中所含的 核酸遗传物质注入到菌体内。噬菌体核酸所带的遗传信息把宿 主菌的生物合成装置接收过来，停止合成细菌成分，使细菌的合成装置 转为合成更多的噬菌体成份，最后细菌细胞裂解（lysis），释放出很多 子代噬菌体（图 719）。 但是噬菌体这样小，只有在电子显微镜下才能看到，如何研究它们 的遗传呢？有一些性状，我们可以研究，就是噬菌斑的形态（plaque morphology）。一个噬茵体裂解一个细菌后，子代噬菌体感染邻近的细 菌，这些细菌又裂解，再侵染其它细菌，这是一个指数增加的现象。这 种实验开始后，过了一夜，第二天就可在长满细菌的不透明菌苔上看到 一个圆形的透明区噬菌斑（plaque）。一个噬菌斑中通常含有 107 108噬菌体，这是由一个噬菌体起源的。所以一个噬菌斑中的噬菌体在遗 传上是均一的，相当于一个克隆。由于噬菌体的基因型不同，噬菌斑可 以是大的或小的，边缘清晰的或模糊的，等等。另一些遗传上可以分析 的噬菌体性状是宿主范围（host range），某些细菌菌株不受噬菌体的吸 附，而噬菌体能感染和裂解的细菌菌株也可以不同。 噬菌体的基因重组噬菌体的基因重组 从野生型噬菌体可以分离出突变型。各突变型的 性质可以传给后裔。用两种突变型噬菌体感染同一宿主菌，它们的后裔 可以出现重组子。在 40 年代早期，Delbrck 就注意到了噬菌体的这些性 质，进行了遗传学分析。 我们现在来看烈性噬茵体 T2 的两对性状及其重组。 第一对性状有关宿主范围（host range，h）。野生型 h+噬菌体能侵 染和裂解 E.coli 菌株 B，但不能侵染 E.coli 菌株 B/2，因为 E.coli B/2 的 细胞表面能阻止 T2噬菌体对它的吸附。所以把 T2噬菌体接种到 B 和 B/2 的混合培养物时，噬菌斑是半透明的。突变型 h 的宿主范围扩大，除了 能够侵染菌株 B 外，还能侵染菌株 B/2，所以接种到 B 和 B/2 的混合培 养物后，能够形成透明的噬菌斑。 另一对性状是有关噬菌斑形态。野生型 r+噬菌体在侵染细菌后，形 成小噬菌斑，直径约 1mm 左右，周边有朦胧的光环。这光环是这样形成 的：早期受侵染的细菌裂解后，形成侵染中心，由此释放的噬菌体数量 增多，往往有 2 个以上的噬菌体侵染一个细菌，这时出现溶菌阻碍现象 （lysis inhibition），使宿主菌的裂解延迟，所以侵染中心的外周混有裂 解的细胞和未裂解的细胞，从而在周边形成朦胧的光环。从众多的野生 型小噬菌斑中，偶而会出现直径约 2mm 的大噬菌斑。这是由称为快速溶 菌（rapid lysis）的突变型噬菌体 r 引起的。r 噬菌体即使有 2 个以上侵入 宿主菌，也不会出现溶菌阻碍现象，所以 r 噬菌体形成的噬菌斑不仅大， 而且周缘清晰。 进行重组实验时，把上述两个亲本噬菌体（hr+和 h+r）去感染菌株 B，噬菌体的浓度要高，使有高比例的细菌同时受到两种噬菌体的感染 （称为混合感染或复感染，mixed or double in fection）（图 720）。 把释放出来的噬菌体（子代噬菌体）接种在同时长有菌株 B 和 B/2 的培养基上。现在可以看到 4 种噬菌斑（表 7-5，图 7-21）。 注：透明是由 h 基因产生的，h 可以感染菌株 B 和 B/2。半透明是 由 h+基因产生的，h+只能感染菌株 B 4 种噬菌斑中，透明而小（hr+）和半透明而大（h+r）是亲组合，半 透明而小（h+r+）和透明而大（hr）是重组合。所以重组值可用下式计算： 用上述公式求得的重组值，去掉，通常即可作为图距。不同的快 速溶菌突变型在表型上不同，记作 ra，rb，rc等。用不同快速溶菌突变型 （rxh+）与宿主范围突变型（r+h）杂交，结果如表 7-6。 我们可以根据表 76 的结果，作一连锁图。亲组合（rh+和 r+h）出 现的频率较高，重组合的频率较低，求得的重组值随 r 基因的不同而有 变化。我们可以根据每一杂交作一连锁图（图 722）。 三种不同的重组值，表示三个 r 基因的座位是不同的，所以有 4 种 可能的连锁图（图 7-23）。 我们能在这些可能的排列间作出抉择吗？首先我们只考虑 rb，rc，和 h，看排列顺序是 rchrb，还是 hrcrb。我们进行杂交 rcrb+rc+rb， 把得到的重组值跟 rbh 间的距离比较。如 rc-rb的重组值大于 rb-h=12.3， 我们可以认为 h 位于 rb和 rc之间，所以排列顺序是 rchrb。 剩下来的问题是，ra在 h 的哪一边？靠近 rb还是靠近 rc？这个问题不 能单是把 ra跟 rb和 rc杂交来回答，因为资料得不出明确的答案。只有当 很多不同的 T2品系发现后，才能进行广泛的遗传学作图，我们才发现两 种排列顺序都是正确的。为什么可以 rarehrb和 rehrbra都正确 呢？原来 T2噬菌体的连锁图也是环状的（图 7-24）。 事实上，T2连锁群的图距总长约有 1500 图距单位（mapunit）。 溶源性细菌溶源性细菌 烈性噬菌体感染细菌后，总是使菌体裂解；而另一类噬 菌体感染细菌后，除偶而情况外，不出现溶菌现象。这后一类噬菌体被 称为温和噬菌体（temperate phage）。 温和噬菌体感染细菌后，可采取两种增殖周期中的一种（图 7-25）。 其中一种是溶菌周期，细菌受到感染后，菌体内噬菌体迅即增殖，菌体 被裂解，噬菌体释放出来。这一周期是偶而自发产生的，也是烈性噬菌 体所必然采取的。另一种是所谓溶源周期，细菌受噬菌体感染后，好象 未被感染一样，细菌继续增殖。这时受感染的细菌具有下列两个特征： （1）细菌细胞内已有了侵入的噬菌体，再也不会受到同一种噬菌体 的侵染，也就是说，有了免疫性。这种免疫性的特异程度很高。例如受 噬菌体侵染的细菌仅对 噬菌体有免疫性，对其它温和噬菌体就没 有免疫性，仍可被感染。 （2）这种细菌即使没有外来噬菌体的感染，有时偶而也会自发地释 放噬菌体。如用紫外线照射，或以丝裂霉素 C 等化学药剂处理，进行诱 导（induction），则能一齐地释放成熟噬菌体。 象这样，有些细菌带有某种噬菌体，但并不立即导致溶菌，这种现 象称为溶源性（lysogeny），而这样的细菌称为溶源性细菌或溶源菌 （lysogenic bacteria）。受温和噬菌体感染的细菌，几乎都成为溶源菌， 而且能把这种特性传给子代细胞。从单个溶源菌开始的培养中，所有的 细菌都是溶源菌，只要不进行诱导，溶源性几乎可以半永久性地传下去。 溶源性的遗传基础溶源性的遗传基础 细菌的溶源性能一代代传下去，而在诱导后又能 产生成熟的噬菌体，所以细菌细胞内必然含有无感染能力的噬菌体。如 把处于这种状态的噬菌体称为原噬菌体（propha-ge），那末原噬菌体以 何种方式存在于细菌细胞内呢？在细胞质中有很多份呢，还是跟染色体 联系在一起呢？现在知道，溶源菌中原噬菌体的存在形式有两种：一种 是染色体外的以游离形式存在，另一种是整合到细菌染色体上。原噬菌 体在细菌细胞中采取哪一种形式，视噬菌体的种类而定。P1 以游离状态 存在，而 以及 80， 等以整合状态存在（图 7-26）。 事有巧合，Lederberg 等所用的原始 E.coli 菌株对于 温和噬菌体 来说是溶源菌。 噬菌体是一种富有特点的噬菌体，受到了广泛的研究。 值得注意的是，如果 F+与 F-细胞间进行杂交，发现杂交结果与所用的溶 源菌菌株有关。如 F+F-()，即 F-细胞是带有 噬菌体的溶源菌时， 可偶而产生溶源性重组子；而反交 F+()F-，即 F+细胞是带有 噬菌 体的溶源菌时，几乎不产生溶源性重组子。那末这些结果如何说明呢？ 当 Hfr 菌株被用于遗传学分析以后，这些结果就容易理解了。在杂 交 HfrF-（）中，Hfr 基因转移到 F-细胞，所以有 Hfr 基因的溶源性 F-重组子很容易得到。然而在反交 Hfr（）F-中，Hfr 菌株的前端基 因可在 F-受体中出现，但后端基因的重组子得不到。因为溶源性 Hfr 跟 非溶源性 F-受体杂交时，经过一定时间， 原噬菌体进入一个无免疫能 力的细胞，原噬菌体随即开始复制，使细胞裂解，释放出游离的噬菌体， 这个现象叫做合子诱导（zygotic induction）。既然原噬菌体进入非溶源 性细胞后，使受体细胞裂解，这样在 噬菌体转移以后才进入 F-细胞的 Hfr 后端基因就无法得到了。上面谈到的 F+()F-，几乎不出现溶源性 重组子，就是因为 进入 F-细胞后，使 F-细胞裂解，所以就得不到溶 源性重组子了。 通过中断杂交试验可以证明， 原噬菌体在一特定时间进入 F-细胞， 这时间跟 gal（半乳糖发酵基因）的进入时间密切有关，表示 原噬菌 体所在的地点就在 gal 座位的附近。关于这一点，下一节中还要谈到。 转导转导 细菌杂交发现以后，过了几年又发现了转导（trans-duction）。 转导是指以噬菌体为媒介，将细菌的小片段染色体或基因从一个细菌转 移到另一细菌的过程。 转导有两种，一为普遍性转导，一为特异性转导。 （1）普遍性转导 细菌杂交是在大肠杆菌中发现的。为了要知道鼠 伤寒沙门氏菌（salmonella typhimurium）中是否也有同样现象，用沙门 氏菌的两个突变菌株进行实验，一个菌株是 phe-try-tyr-，另一突变株是 met-his-。这两菌株分别在基本培养基上培养时，没有发现野生型细胞。 然而把这两突变株在基本培养基上进行混合培养时，大约在 10-5细胞中 得到一个原养型菌落这好象跟大肠杆菌的重组没有什么不同。 然而把这两菌株放入 U 型管的两臂，中间有一滤板隔开，防止细胞 接触，也得到了野生型细胞。这说明沙门氏菌的基因重组不是通过细胞 接合，而是通过过滤因子（filterable agent）而发生的。以后发现这过滤 因子就是噬菌体 P22一种已知的沙门氏菌的温和噬菌体，因为 过滤因子的大小和质量与 P22相同； 过滤因子用抗 P22血清处理后失活。 这种实验虽然没有证明沙门氏菌中有接合现象，却发现了由噬菌体 介导的基因转移过程转导。 现在知道，P22感染细菌细胞时，细菌染色体断裂成小片段。在形成 噬菌体颗粒时，偶而错误地把细菌染色体的片段组合到头部，而不是它 们自己的遗传物质。因为决定感染细菌的能力的是外壳蛋白质，所以这 种病毒或转导颗粒（transducing particles）可以吸附到细菌细胞上，注入 它们的内容物，现在这内容物是宿主细菌的部分基因了。当转导中的噬 菌体内容物注入一个受体细胞后，形成一个部分二倍体，然后导入的基 因通过重组，整合到宿主菌的染色体上（图 7-27）。 利用部分二倍体，还可测定细菌基因间的连锁关系。现在举一个例 子，用大肠杆菌的 P1噬菌体进行下列转导实验： 供体 thr+leu+ara+受体 thr-leu-ara- 我们可以在受体中选择一个或几个供体的标记基因，然后检定非选 择性标记基因的有或没有（表 7-7）。 以 leu+为选择标记，得知被转导的供体菌染色体中，同时有 50为 azir，2为 thr+。这表明 leu 比较靠近 azi，而离开 thr 较远。所以排列顺 序是 以 thr+为选择标记，发现同时被转导到受体菌的，有 3为 leu+，而 未检出有 azir，这表明 thr 比较靠近 leu，所以基因顺序应该是 如果同时选择 thr+和 leu+，则被转导的受体菌染色体中都没有包括 azi。这样看来，转移噬菌体所带有的供体菌染色体片段从 thr 开始，有 时延伸到 leu，但没有扩展到 azi 的。根据细菌接合实验等，这段染色体 长度相当于细菌染色体的 1/100，大致上也就是噬菌体染色体的长度。 1. 噬菌体附着到 E.coli 染色体的 gal+座位附近，噬菌体染色体通过 交换整合到细菌染色体，成为原噬菌体。带有原噬菌体的细菌菌株 K12 成为溶源菌 K12（） 2.通过不规则交换，产生转导噬菌体 d gal+。转导噬菌体约丧失 25的噬菌体基因，却获得了整合位置附近的细菌基因 gal+等 3. 转导噬菌体 d gal+感染 gal-细菌，形成转导子 d gal+/gal-。转 导子中少数是稳定的 gal+型，这是由 gal 座位上的重组形成的；但大多数 是不稳定转导子，是 d gal+/gal-型 4.不稳定转导子在少数情况下会分离出 gal-细胞，这可用 d gal+染 色体的切除来说明，因为 d 不能复制，所以在细胞分裂中丢失或被稀 释 一般地说，根据转导实验构建的遗传学图与依照接合实验作成的遗 传学图是一致的，但前者更为精细些。 上面谈到的 P22，P1 这一类噬菌体可以转移细菌染色体的很多不同 部分，所以称为普遍性转导（generalized transduction）。 （2）特异性转导我们现在介绍另一类噬菌体，它们所进行的转导是 特异性转导（specialized transduction），或局限性转导（restricted transduction），这类噬菌体只转移细菌染色体的特定部分。 上面讲到过的 噬菌体是特异转导者（transducer）的一个很好例 子。大肠杆菌的一个溶源菌株 K12（）可由紫外光诱导，用来进行转导。 唯一成功的转导包括 gal 座位。根据实验知道， 总是附着到 gal 座位 的邻近位置。gal+供体gal-受体的转导过程，可用图 7-28 的模式简明地 说明。转导过程中有一些值得注意的特点： （1）所有 gal+转导子（transductants）对 噬菌体的超数感染 （superinfection）都是免疫的，但 gal+转导子在菌体裂解时不能产生成熟 的 噬菌体，可见带有 gal+的 噬菌体是有缺陷的，记作 dgal+（- defective gal+）。 （2）d gal+转导粒子（transducing particles）约丧失 25的噬菌体 染色体，但具有完整的 外壳，所以仍能感染细菌。 （3）以 dgal+转导粒子去感染 gal-细菌，所形成的 gal+转导子中有 相当一部分是不稳定的，能持续地产生 gal-分离子（segregants），所以 这些不稳定转导子是部分二倍体，除了受体染色体上的 gal-外，还有 d 原噬菌体上的 gal+，基因型应为 d gal+/gal-。 遗传学规律的普遍性遗传学规律的普遍性 最后关于细菌和病毒的遗传分析还要说几句话。 大约在 40 年代以前，人们认为细菌的分裂是无丝的（amitotic），那时 自然不会想到细菌会有类似于性过程的现象。现在由于细菌和病毒遗传 学的迅速发展，不仅了解了细菌和病毒染色体的结构，还知道了细菌和 病毒染色体的复制形式（其中有些将在以后谈到），而且还发现细菌有 类似于性过程的现象，以及细菌和病毒的基因连锁和基因重组。我们学 习细菌和病毒的遗传分析，不仅使我们认识到遗传规律在微生物和高等 生物中的一致性，而且还使我们意识到，学习细菌和病毒的遗传分析方 法，还对我们的实验设计和结果分析有相当大的帮助呢。 习题习题