第十八章核酸2

第十八章 核酸和辅酶化学(简介) 核酸(nucleic acid)是与人类生命活动，尤其与遗传密切相关的生 物大分子。天然存在的核酸有两类，一类是脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA)，存在于细胞核和线粒体内，能携带遗 传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)；另一类是核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA)，存在于细胞质(90%)和细胞核内(10%)，可 参与细胞内 DNA 遗传信息的表达，即蛋白质的生物合成。 核酸是由瑞士外科医生米歇尔(F. Miescher)于 1868 年从绷带的 浓细胞核中分离得到的，最初的名称是“核素” (nuclein)，但实际 上是核蛋白。1889 年奥特曼(R. Altmann)得到了第一个不含蛋白质的 核素，并命名为核酸，因为它是酸性物质。但当时对其功能并未认 识。1944 年，埃佛雷(O. Avery)利用致病肺炎球菌中提取的 DNA， 使另一种非致病性的肺炎球菌的遗传性发生改变，成为致病菌，从 而证实了 DNA 是遗传的物质基础。此后的大量实验证实，生物体 的生长、繁殖、变异和转化等生命现象，都与核酸有关。1953 年沃 森(J.Watson)和克里克(F.Crick)提出了 DNA 的双螺旋结构模型，从 而揭示了生物界遗传性状得以世代相传的分子奥秘。 蛋白质的生物合成受核酸控制，遗传学中长期使用的“基因” 一词，就是指 DNA 分子中某一区段，它可以经过复制遗传给子代； 也可以经转录和翻译，保证支持生命活动的各种蛋白质在细胞内的 有序合成。因此， “基因表达调控” 、 “基因重组与基因工程” 、 “基因 诊断与基因治疗”以及“人类基因组计划”都成为近代分子生物学 的研究关注热点。 为了今后对核酸的深入学习和了解，本章着重介绍核酸的分子 结构、组成和理化性质，并对它们的生物功能作一简介。本章同时 简介辅酶的化学。 第一节 核酸 一、分类 如前所述，根据核酸中所含戊糖的种类（核糖或 2/-脱氧核糖） ， 核酸可分为 DNA 和 RNA 两类。根据 RNA 在蛋白质合成中所起的 作用，其又可分为三类（主要的）： 1核蛋白体核蛋白体 RNA（ribosomal RNA, rRNA） ，也称为核糖体 RNA，是核蛋白体的组成成分。核蛋白体是蛋白质合成时的场所， 参与蛋白质合成的各种成分都必须在核蛋白体上将氨基酸按特定顺 序装配； 2信使信使 RNA（messenger RNA, mRNA） ，其功能是把细胞核内 DNA 的遗传信息，抄录并转送至细胞质中，并翻译成蛋白质中氨基 酸的排列顺序，是蛋白质合成的直接模板； 3转运转运 RNA（transfer RNA, tRNA） ，其功能是在蛋白质合成 中作为氨基酸的载体，并将氨基酸转交给 mRNA。 二、化学组成 核酸的基本组成单元是核苷酸。核苷酸经水解可释放出等摩尔 量的含氮碱基（简称碱基） 、戊糖和磷酸。 （一）碱基：（一）碱基： 构成核苷酸的碱基主要有五种，分属嘌呤和嘧啶两类含氮杂环。 嘌呤类的有腺嘌呤（adenine, A）和鸟嘌呤（guanine, G） ，它们在 DNA 和 RNA 中均存在；嘧啶类的有胞嘧啶（cytosine, C） 、胸腺嘧 啶（thymine, T）和尿嘧啶（uracil, U） 。胞嘧啶在 DNA 和 RNA 中 均存在；胸腺嘧啶仅存在于 DNA 中；尿嘧啶仅存在于 RNA 中。 上述五种碱基在结构中可存在酮式-烯醇式或氨基-亚氨基的互 变异构，但体内或中性和酸性介质中存在的形式如下： N N N H N NH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 HN N N H N O H2N N N H NH2 O 1 2 3 4 5 6 HN N H O O HN N H O O CH3 腺嘌呤(A) 鸟嘌呤(G) 胞嘧啶(C) 尿嘧啶(U) 胸腺嘧啶(T) 即酮式-烯醇式的互变异构中,以酮式为主；氨基-亚氨基的互变 异构中，以氨基为主。 练习题 18.1 请写出尿嘧啶和腺嘌呤的烯醇式和亚氨基的结构 形式。 嘌呤和嘧啶环中均有共轭双键，因此，对波长 260nm 左右的紫 外光有较强吸收。此物理性质可用于核酸各组分的定量和定性分析。 不同碱基的吸收波长稍有差异。 （二）戊糖：（二）戊糖： 核酸中的戊糖是-D-核糖（RNA 中）和-D-2/-脱氧核糖 （DNA 中） 。为区别碱基中碳原子的编号，戊糖中的碳原子标以 1/、2/等。 OOH H HH OH OH HOOOH H HH HOH HO -D-核糖 -D-2 /-脱氧核糖 为了减少取代基间非键相互作用，戊糖的呋喃糖环不是平面， 而是折迭的。折迭情况由 C2/和 C3/相对于 C1/- O4/- C4/构成的平面的情 况而定。通常可采用两种优势构象，即信封式（envelope）和扭转式 （twist） ，简称为 E 式和 T 式。 1信封式折迭 C5/ B O3/ O3/ BC5/C5/ O3/ B C2/-endo C3/-endo C2/-exo C3/-exo B C5/O3 / 在信封式折迭中，C2/和 C3/可分别处于 C1/- O4/- C4/构成的平面的 两侧。当处于与 C5/和碱基同侧时，称为内式（endo） ；处于异侧时， 称为外式（exo） 。 2扭转式折迭： 扭转式也可称为半椅式。它是 C2/或 C3/同时偏离 C1/- O4/- C4/构成 的平面，而且是偏离方向相反时的构象，如下所示： C2/-endo-C3/-exo C2/-exo-C3/-endo O3/ C5/ B C5/ B O3/ 上述构象都是极限的形式，实际上中间还有很多构象。在溶液 中它们可以处于快速平衡中。 （三）核苷（三）核苷 核苷（nucleoside）是指由戊糖（核糖或 2/-脱氧核糖）C1位的 -半缩醛羟基与嘌呤类碱基的 N9或嘧啶类碱基的 N1上的氢原子脱 水而成的氮苷。核苷中包括腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷 和尿嘧啶核苷；脱氧核苷中是前三种核苷的脱氧产物及胸腺嘧啶脱 氧核苷。 HO B O H HH R HO R=OH ( ) H ( ) 核苷 B= 碱基 它们的英文名称分别为：腺嘌呤核苷 adenosine；鸟嘌呤核苷 guanosine；胞嘧啶核苷 cytidine；尿嘧啶核苷 uridine 腺嘌呤脱氧核 苷 deoxyadenosine；鸟嘌呤脱氧核苷 deoxyguanosine；胞嘧啶脱氧核 苷 deoxycytidine 和胸腺嘧啶脱氧核苷 thymidine。 核苷中的碱基平面几乎垂直于糖环，并接近于平分 O4/- C1/- C2/ 夹角，因而使碱基有两种旋转方式。一种是较小的嘧啶环中的 H-6 或嘌呤环中的 H-8 在糖环的上方，称为 anti(反式)-构象；另一种是 较大的嘧啶环中的 O-2 或嘌呤环中的 N3处于糖环上方的，称为 Syn- (同式)构象。 HO O HO H N NO NH2 HO N N NH2 O O HO H HO O HO H N N H O NH2 N N HO N N H O NH2 N N O HO H Syn-脱氧胞苷 anti-脱氧胞苷 Syn-脱氧鸟苷 anti-脱氧鸟苷 （四）核苷酸（四）核苷酸 核苷酸(nucleotide)是指核苷分子中核糖或脱氧核糖的 3/或 5/位的 羟基与磷酸生成酯后的产物。生物体内的核苷酸主要是 5/-磷酸酯。 核苷酸的命名要包括磷酸在戊糖上的位置。例如，腺苷酸(adenylic acid)是由腺苷核糖的 C5/羟基形成磷酸酯，因此又称腺苷-5/-磷酸 （adenosine-5/- phosphate）或单磷酸腺苷（adenosine monophosphate AMP） ；脱氧胞苷酸(deoxycytidylic acid)又称为脱氧胞苷-5/-磷酸或单 磷酸脱氧胞苷（deoxycytidine monophosphate dCMP） 。 O HH OH OH OP O O_ O N N N N NH2 H O HH OH H OP O O_ O H N N NH2 O 腺苷酸(adenylic acid) 脱氧胞苷酸(deoxycytidylic acid) 核苷酸的磷酸还可进一步与一分子或两分子磷酸成酸酐，如腺 苷酸可形成二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP)。 AMP ADP ATP OH OO P O O O P O O O OH O N N N N NH2 H P O O 练习题 18.2 请写出 2/-去氧胞苷酸-3/-单磷酸的结构 （五）核酸（五）核酸 由 2 个以上的核苷酸，通过 3/,5/-磷酸二酯键连接起来的人工合 成片断常称为寡核苷酸。天然界由多个核苷酸构成的 3/,5/-磷酸二酯， 称为多核苷酸，核酸即为高分子量的多核苷酸。核酸分子中各种核 苷酸的排列顺序称为核酸的一级结构。它们是由前一个核苷酸的 3/- OH 与下一个核苷酸的 5/位磷酸之间形成 3/,5/-磷酸二酯键，从而构 成一个没有分支的线性大分子。例如，DNA 和 RNA 单链的结构可 用以下结构式及其简化形式表示： 5- PPP5 PPOH 3 CGTCA 5 dpApCpTpGpC-OH 3 5d(ACTGC)3 3- R R R O H O OP O O O O H OP O O O O H OP O O O HH HH H H H H 5 pApCpUpG-OH 3 5(ACUG)3 GUAC PPP OH 5 P OHOH OH OH R=H (DNA) R=OH (RNA) DNA RNA 3 书写核酸的结构时，习惯上从 5/到 3/。在它们的简化形式中，P 代表磷酸酯。在核酸中，核糖(脱氧核糖)和磷酸共同构成骨架结构， 但不参与信息的贮存和表达。DNA 和 RNA 对遗传信息的携带和传 递是依靠核苷酸中的碱基排列顺序变化而实现的。 1DNA 的空间结构： 1953 年，沃森和克里克两人提出了著名的 DNA 双螺旋（double helix）结构模型，这是 DNA 的二级结构，也是 DNA 作为遗传物质 的分子结构基础。 N N N N N H H NN CH3 O H O N N N N N H H H NN O NHO H (A) (T) (G) (C) 图 18-1 DNA 双螺旋结构示意图 图 18-2 配对碱基间氢键示意图 根据该模型设想的 DNA 分子由两条核苷酸链组成。它们沿着 一个共同的轴心以反平行走向（一条链的走向是 5/3/；另一条的走 向是 3/5/） ，盘旋成右手双螺旋结构（如上图 18-1 所示） 。亲水的 脱氧核糖基和磷酸基位于双螺旋的外侧；碱基朝向内侧。两条链的 碱基之间有氢键结合成对（如上图 18-2 所示） 。配对的碱基始终是 腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间形成两个氢键（A=T） ；鸟嘌呤 （G）与胞嘧啶（C）之间形成三个氢键（GC） ，此称为碱基互补 规律或碱基配对规律。双螺旋结构在横向上的稳定就是靠两条链间 互补碱基的氢键维系。在纵向方面的稳定则靠碱基平面间的疏水性 堆积力维持（由于碱基近似地垂直于糖环，在 DNA 中，碱基平面 是相互堆积的） 。 练习题 18.3 已知海鳖中的 DNA 含有 28.7%的腺嘌呤和 21.3% 的胞嘧啶，试问其鸟嘌呤的含量约为多少？ 从外观看，DNA 的双螺旋分子中存在一个大沟(major groove)和 一个小沟(minor groove)。目前认为这些沟状结构与蛋白质和 DNA 间的识别有关。在以核酸作为作用靶的药物研究中，沟区结合是研 究的一个方面。目前认为，很多蛋白与 DNA 的特异性结合是通过 DNA 大沟区作用；而药物小分子多数在小沟区作用。大小沟区在电 势能、氢键特征、立体效应和水合作用方面都有很大不同。 *阐明 DNA 分子双螺旋结构的历史人物* 1953 年 4 月 5 日出版的一期美国自然杂志同时刊登了两篇论文，一篇 是维尔金斯(M Wilkins)和富兰克林(R Franklin 女)关于 DNA 结晶的 线衍射 研究的论文；一篇是沃森和克里克关于 DNA 分子双螺旋结构模型的论文。这 四位科学家中，富兰克林因患癌症于 1958 年逝世(19201958)，其中三人在论 文发表九年后共同荣获 1962 年生理学或医学诺贝尔奖。 令人注目的是，这一被称为分子生物学基石的发现全过程为时仅为 18 个月， 提出这个模型的沃森仅 25 岁，其它人也只有 37 岁（克里克、维尔金斯）和 33 岁(富兰克林)。而且，其中两位学者_克里克和维尔金斯竟是物理学家。在从 事 DNA 结构研究之前，他们都是名不见经传，默默无闻的青年科学工作者。 20 世纪 30 年代起出现了一股物理学家研究生物现象的热潮。例如，物理 学家、量子论的先驱者玻尔(N Bohr,18651962)和物理学家薛定谔(E Schrdinger, 18871961)分别在 1932 年和 1945 年出版了题为生命是什么？ 的专著，他们都是试图从物理学家的眼光回答生物学的中心问题。这两本书曾 影响了一批物理学家，其中就有维尔金斯和克里克；同时也影响了一批生物学 家，引导他们去研究基因的本质，其中就有沃森。 维尔金斯维尔金斯：英国人，1938 年英国剑桥大学物理学学士，1940 年获物理学哲 学博士。第二次世界大战爆发后，他从事雷达阴极管屏幕的改进研究和原子弹 的放射性铀的质谱分析。战后，他一方面受社会舆论遣责原子弹的影响，对物 理学的研究失去兴趣；另一方面读了薛定谔的生命是什么？一书，被书中 所论述的关于控制生命过程的高度复合性的分子结构的观念所吸引，于是改变 了研究方向，并参加了当时由伦敦大学国王学院新组建的医学科学院生物物理 学研究室的工作，并在该研究室发现了 DNA 凝胶产生的蜘蛛网丝那样细细的、 几乎是看不见的 DNA 纤维。他认为，这种纤维既然如此完美和大小一致，其 分子排列一定是有规则的，因此开始了对 DNA 的 线衍射的研究，并得出了 DNA 是一个非常长的分子链，是排成双螺旋的结论。 克里克克里克：英国人，1937 年毕业于伦敦的大学学院物理系。1939 年因世界大 战中断了博士学位的学业。战时他在美国海军部科学研究室工作。战后留在海 军部准备从事粒子物理学的研究。这时(1946 年)他读到了薛定谔的生命是什 么？一书，书中提到的“生物现象可能导致新的生理学定律的发现”的前景， 对他具有极大诱惑力，于是打算改变研究方向，从事生物学课题的探索。 1949 年他参加了英国医学科学研究院分子生物学研究室的工作，进行血红 蛋白 线衍射的研究，即此时的他还没有直接进行 DNA 的研究，直至美国年 青的生物学者沃森来到了克里克所在的实验室，才开始了两人的协作研究。 沃森沃森：美国人，1947 年获芝加哥大学动物学学士学位。在大学期间就研读 过薛定谔的生命是什么？一书。他后来曾说过：“这本书使他走向基因秘 密的发现” 。1950 年在印第安纳大学获动物学哲学博士学位。 1951 年 5 月，沃森与维尔金斯第一次相会于一个生物学的学术讨论会，并 听了维尔金斯关于 DNA 的 X 线衍射分析的报告，第一次看到了 DNA 结晶的衍 射照片，从而引起他对核酸结构的兴趣。 1951 年 10 月，沃森正式进入了克里克所在的分子生物学研究室，并对克 里克的科学思想敏锐和能吸引其它年青科学家的特点给予高度评价(但克里森当 时还是学生，1954 年才获得博士学位)。与此同时，克里克也被沃森所吸引。共 同的兴趣使两人抛掉了对红血蛋白的研究任务，开始了对 DNA 结构的研究工 作。 * * 2RNA 的空间结构 RNA 通常以单链形式存在，但也可以有局部的二级或三级结构。 RNA 分子比 DNA 分子小得多，小的仅有数十个核苷酸；大的由数 千个核苷酸组成。RNA 的种类较 DNA 多，它们的结构也不相同， 现将 mRNA 和 tRNA 的结构简介如下： (1) mRNA： 在细胞核内合成的 RNA 的初级产物比成熟的 RNA 大得多。前 者称为不均一核 RNA(heterogeneous nuclear RNA, hn RNA)，它在细 胞核内存在时间很短，经过剪接成为成熟的 mRNA，并移位到细胞 质中。在真核生物中，成熟的 RNA 由编码区和非编码区构成（如图 18-3 所示） 。 UAAAUGGUC 5 mGPPP 5 3 3 A AAAAA- - An 图 18-3 真核生物中成熟 mRNA 的结构特点 在编码区每 3 个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸，称 为三联体密码(triplet code)。在 5/-端均在转录 DNA 的信息后加上了 一个 7-甲基鸟苷，同时在第一个核苷酸的 C2/位也是甲基化的。这种 mGPPP 结构称为帽子结构(或称帽子序列)。帽子结构在 mRNA 作为 模板翻译成蛋白质过程中具有促进核蛋白体与 mRNA 的结合、加速 翻译起始速度的作用，并可增强 mRNA 的稳定性。在 3/-末端，大多 数有一段长短不一的多聚腺苷酸（poly A）结构，称为多聚 A 尾， 一般由数十个至一百几十个腺苷酸连接而成。随着 mRNA 存在时间 延续，此段聚 A 尾也会慢慢变短。此段结构与控制蛋白质的合成无 关系。因此认为，可能与 mRNA 从核内向胞质的转位及 mRNA 的 稳定性有关。在原核生物的 mRNA 中未发现有这种特殊结构。 (2) tRNA： tRNA 是细胞内分子量最小的一类核酸，约有 7090 个核苷酸 组成。 tRNA 分子中有 10%20%的稀有碱基(rare base)，它们是指 除 A、G、T、C 和 U 之外的其它一些碱基，如双氢尿嘧啶、伪尿嘧 啶(pseudouri -dine)、次黄嘌呤(inosine)和甲基化嘌呤(mG、mA)等。在 伪尿嘧啶核苷中，是碱基的 C-5 位与糖环的成 CC 苷键。 C11 HN N H O R O HN N H O O HN N O H2N N H N CH3 HN N O N H N 伪尿嘧啶核苷 双氢尿嘧啶 N7-甲基化鸟嘌呤 次黄嘌呤 (R=糖) 在 tRNA 中存在着一些碱基能局部互补配对的区域，可形成局 部双链，进而形成一种茎状结构或称发夹结构，中间不能配对的部 分则突出形成环状。这种茎环结构的存在，使 tRNA 具有了类似三 叶草形的二级结构(如图 18-4a 所示)。位于左右两侧的环状结构根据 其含有的稀有碱基为特征，分别称为 DHU 环和 T环；位于下方的 环称为反密码环，环中间的 3 个碱基称为反密码子(anticoden)，与 mRNA 上相应的三联体密码子可形成碱基互补。不同的 tRNA 按照 其转运的氨基酸的不同，有不同的反密码子。不同的 tRNA 有共同 的三级结构，它们呈倒 L 型（图 18-4b） ，在这种结构中，原来在二 级结构相距较远的 T环和 DHU 环在这里相距很近。 图 18-4 a. 酵母 tRNA 的一级和二级结构； b. t-RNA 的三级结构 最后需提到的是，所有 tRNA 的 3/-末端均有相同的 CCA-OH 结 构，t-RNA 所转运的氨基酸就连在此末端上。 三、理化性质 （一）物理性质（一）物理性质 DNA 为白色纤维状固体，RNA 为白色粉末。两者均微溶于水， 但因有酸性而易溶于稀碱溶液中。在乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂 中，均难溶。 在介绍碱基时已提到，由于碱基存在共轭结构，故在 260nm 左 右有较强的紫外吸收。DNA 是线性高分子，故粘度极大；RNA 分 子量较小，粘度也小得多。 （二）酸碱性（二）酸碱性 核酸是两性分子，既有碱基部分；又有磷酸二酯部分的游离磷 酸根，但碱基的碱性较弱。对于碱基环外的氨基来说，类似苯胺的 情况，氮原子上未共享电子对已离域到环上，降低了碱性，故碱基 的碱性主要反映在杂环环内的氮原子上。在生理条件下，核苷和核 苷酸的碱基部分是不带电的。 （三）稳定性（三）稳定性 在加热、机械力等理化因素作用下，DNA 分子可由稳定的双螺 旋结构松解为无规则的单链结构，此称为 DNA 的变性(denaturation)。 变性过程中是断裂了碱基对之间的氢键和碱基平面间的堆积力；磷 酸二酯键不受影响，所以变性不影响一级结构。变性的产生可从紫 外光谱中的增色效应观察到：DNA 由双链发生解链后，在 260nm 处的吸收会增强；此外，溶液的粘度也下降，沉降速度也增加。当 然，变性也会影响 DNA 的生物功能。但 DNA 的变性是可逆的。在 适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，此称为 “复性”(renatura -tion)。DNA 的复性速度受温度影响，复性时温度 缓慢下降才可使单链重新配对复性。若加热后(变性)将其迅速冷却 至 4以下，则几乎不可能发生复性。在复性过程中，若将不同的 DNA 单链分子放在同一溶液中，或者将 DNA 单链和 RNA 放在一 起，则又可形成双链分子。双链分子的再形成可发生在序列完全互 补的核酸之间；也可发生在碱基部分互补的不同 DNA 之间或 DNA 和 RNA 之间，这种现象称为核酸分子的杂交(hybridization)。有关杂 交方面的研究在核酸领域中应用很广。 DNA 和 RNA 对碱性水解的敏感性是不同的。DNA 和 RNA 都 具有磷酸二酯键的结构，但 DNA 对碱性水溶液的敏感性较 RNA 差。 例如，在 1N NaOH 中，100加热 1 小时，DNA 没有降解发生；但 RNA 在 1N NaOH 中，室温下，25 分钟后就有 50%降解。这与两者 结构差异有关。在 RNA 中，由于核糖 2/-羟基可在碱性条件下形成 烷氧负离子，并可向 3/-位磷酸二酯键进行分子内的亲核进攻(向磷- 氧双键)，形成五元环的环状磷酸二酯，同时离去部分 RNA 片断。 环状的磷酸二酯具有环张力，可进一步被 OH水解，生成 2/-和 3/- 磷酸酯。 H O BOCH2 OO P OCH2 OO n ) ( OH ( OO O P O O BOCH2 OH O O B OCH2 OOP O O ( 3- O B OCH2 HOOP O O O ( 2- RNA DNA 分子中脱氧核糖 2/-位没有羟基，不会发生分子内的亲核进 攻，没有环状磷酸二酯的生成。而一般来说，磷酸二酯对碱的水解 是比较惰性的。因此，DNA 在碱性溶液中较稳定。磷酸二酯对碱惰 性的原因，是由于进攻试剂 OH与磷酸二酯中的游离磷酸根之间的 排斥，使其不易接近磷氧双键。磷酸单酯更难水解；但磷酸三酯很 易水解。例如： CH3OPOCH3 OCH3 O 2420 C 1N NaOH CH3OPOCH3 O O 16 100 C 1N NaOH O CH3OP O O (50%) ONa CH3OPOCH3 O 四、ATP（三磷酸腺苷）： ATP 是三磷酸腺苷的英文名称的缩写。它具有以下结构式： N N N N NH2 HOP O O_ O P O O_ O P O O_ OCH2 O H HOOH H ATP 结构式中的腺嘌呤和核糖是用于识别与其相关的酶；真正起作 用的是三磷酸酯。在生理条件下，磷酸酯中四个酸性氢中有三个解 离，第四个酸性氢 pKa 值为 6.5，因此大部分也离子化。在细胞内 这种多负离子型体可与镁离子形成 1:1 的配合物。金属离子的存在 可作为 ATP 水解和其它亲核反应的催化剂。 ATP 在生物学上的重要性及特色之一是两个末端磷酸酯的水解 （及其它亲核取代反应）和伴随着不寻常的能量释放。在标准条件 下（pH 7.0） ，末端两个磷酸酯键水解的 G水解大约是-31.2kJmol- 1，在细胞内 G 水解约为-50 kJmol-1。从生物系统内的化学反应意 义上来说，ATP 是一个高能化合物。这个定义是人为规定的：高能 化合物是指在生理 pH 条件下，其 G水解超过-29.4 kJmol-1或 H水解超过-25 kJmol-1的物质。产生高能的键称为高能键，并以 符号“”表示。在 ATP 中具有两个高能键。从化学上讲，高能来 自 ATP 中磷酸酯的结构。实际上，它相当于我们学过的酸酐结构。 酸酐具有比酯更高的水解（及其它亲核取代反应）活性，这在羧酸 衍生物一章已作介绍。因此，ATP 是能量贮库，所释放的能量能提 供其它反应的进行。此外，ATP 常通过磷酸化反应，将潜在的能量 转移给其它物质，增加后者的活性，这种情况很多，这里先介绍一 个简单的例子苯甲酸在体内的解毒途径。苯甲酸对人体有毒， 但可与体内大量存在的甘氨酸，在 ATP 作用下，生成无毒的马尿酸， 从尿中排出。反应第一步是苯甲酸根对 ATP 的位磷氧键的亲核进 攻，得到活性的混合酸酐和焦磷酸，然后，甘氨酸的氨基进攻混合 酸酐，给出 N-苯甲酰甘氨酸（马尿酸） 。 P O O_ O P O O_ O P O O_ O HO O HO OH Ad C O O ATP + PPi + NH2CH2COO C O NH CH2COO + AMP PPi= O OP O O_ O O HOHO Ad 很明显，如果没有 ATP 的存在，苯甲酸的羧基与甘氨酸的氨基是难 以直接形成酰胺的。ATP 通过形成混合酸酐，将能量转移给苯甲酸， 使羧酸根转成活化的形式（酸酐） ，从而使反应顺利进行。此外，产 生的焦磷酸（PPi）很容易水解，可提供大量能量，促进反应进行。 在生物体内，除 ATP 外，凡是具有酸酐结构的键都属于高能键，都 具有较高反应活性，例如下列体内代谢的反应中，1,3-二磷酸甘油酸 与 ADP（二磷酸腺苷）反应，生成 3-磷酸甘油酸和 ATP。 ADP CH2OP O O O OH COP O O O O H CH2OP O O O OH COH O H + ATP 1,3-二磷酸甘油酸 在 1，3-二磷酸甘油酸中有两个磷酸酯，但 C1位的磷酸酯与羧 基之间形成了混合酸酐，所以它可被 ADP 磷酸根亲核进攻，生成 ATP，羧酸根作为离去基离去。处在 C3位的磷酸酯未形成酸酐结构， 没有高能键就不发生反应。又如，磷酸烯醇式丙酮酸转成丙酮酸这 一代谢反应，前者分子中同样存在高能键。 C C CH2 OO OP O O O ADP ATP + C C CH2 OO OH C C CH3 OO O 磷酸烯醇式丙酮酸中,C2-C3之间的双键与 C2位的氧原子之间存在 p共轭关系，氧上电荷可转移到双键上，因此与磷酸之间同样形 成类似酸酐的结构，这里的磷酯键也是高能键。 由以上例子可以看出 ATP 在代谢反应中的重要作用，其既提供 能量，又活化代谢物。 * 五、扩展性知识 * （一）核酸控制的蛋白质生物合成中的化学反应（一）核酸控制的蛋白质生物合成中的化学反应 蛋白质的生物合成是受核酸控制的。遗传信息贮存在 DNA 分 子上，转录、翻译生成 mRNA (mRNA 是指导合成的直接模板)，并 由 tRNA 作为氨基酸的运载体，按照碱基配对的互补规则在核蛋白 体上进行装配，共同协调完成合成工作。有关生物合成中的详细过 程将在“生物化学”课程中详细介绍，这里重点介绍蛋白质生物合 成中的某些化学反应。 1 1、tRNA 和氨基酰和氨基酰- tRNA tRNA 分子的反密码子与 mRNA 上的密码是配对的，tRNA 的 3/-末端的 CCA-OH 是结合氨基酸的位点。所谓 tRNA 携带氨基酸， 实际上是一种酶促的化学反应，反应的产物是氨基酰- tRNA(aminoacyl- tRNA)，催化此化学反应的酶是氨基酰-tRNA 合成 酶。此酶对 tRNA 和氨基酸两种底物都有高度特异性的识别。反应 中，ATP 的参与是促进反应进行的因素。反应分两步进行。 R H3N O A O P OCH OO O HOOH NH3 RCH COO + ATP Mg2+ + PPi R H3N O A O P OCH OO O HOOH R H3N CHC O OtRNA + AMP tRNA(3-OH) -tRNA 1 2 第一步中，ATP 不仅提供能量(通过 PPi 的水解)，而且活化氨 基酸的羧基，生成混合酸酐中间体；第二步是混合酸酐与 tRNA 的 3/-OH 的醇解反应。通过上述反应，tRNA 能顺利地与氨基酸结合， 作为后者的载体参与下一步生物合成。 2 2、肽键形成中的化学、肽键形成中的化学 在蛋白质生物合成中，肽键形成的化学可由图 18-5 表示。核蛋 白体提供合成的场所，它是由两个大小不同的亚单位组成。它们分 别是由不同的蛋白质和 rRNA 组成。有些蛋白质可能是催化反应的 酶；而 rRNA 可能与合成中的专一性构象有关。 PA 5 3 mRNA fMet-tRNAfMet R-tRNAR 5 3 mRNA tRNAfMet R-tRNAR RH2N CH CO O H S CH3 CH CO O R NHC O CH N O H OH S CH3 N H H O CH CO O PA 图 18-5 肽键形成的化学 蛋白质的生物合成可分为起始、延长和终止三个阶段。在原核 生物中，合成开始时是将带有甲酰化蛋氨酰的起始 tRNA 连同 mRNA 结合到核蛋白体上。甲酰化蛋氨酰-tRNA 可表示为 fMet- tRNAfMet，其结合的部位称为肽基位点(peptidyl site)简称 P 位，是结 合肽链的位置；第二个氨基酸进入时，是以氨基酰-tRNA 的形式进 入，可用 R-tRNAR表示。R 代表特定的氨基酸；tRNAR代表对 R 特 定氨基酸专一的 tRNA。R-tRNAR是结合到称为氨基酰位的地方，氨 基酰位(aminoacyl site)简称 A 位，P 位和 A 位是互相很接近的。 开始时，P 位和 A 位上的氨基酸间并不反应，但当加入 GTP 作 为能量的来源时，反应发生：R-tRNAR的氨基进攻 fMet-tRNAfMet的 酯基，发生酯的氨解，生成第一个肽键，tRNAfMet作为离去基离去。 形成的肽键(以肽酰-tRNA 形式)最初是结合在 A 位上，但它必须移 位至 P 位，才能让出位置，进入第三个 R-tRNAR。因此，下一步是 肽酰-tRNA 的移位，并置换掉原 P 位处的 tRNAfMet，空出 A 位，准 备下一个循环的发生。肽链的合成就是通过上述的过程循环进行， 但每次进入的氨基酸不同，它是由 DNA 及 mRNA 决定，并通过 tRNA 进行精准的有序的运载，进入合成的场所。 最初的甲酰基在蛋白质生物合成完成后会除去。反应的终止也 有特定的密码子来决定。合成后的蛋白质还需进行修饰、加工，才 能成为功能多样的各种类型的蛋白质。 （二）酶性核酸（二）酶性核酸 20 世纪 80 年代，切赫(T. Cech)和阿特曼(Altmann)分别独立地 发现了具有生物催化作用的 RNA，从而改变了生物催化剂的传统概 念。为此，他们共同获得 1989 年诺贝尔奖。 1982 年，T .切赫等发现：原生动物四膜虫(Tetrahymena thermophi -la)含有一种 RNA，其组成除了 rRNA 外 ，还有一个由 413 个核苷酸组成的插入序列(intervening sequence，缩写为 IVS)或 称内含子(intron)，成熟的 rRNA 即从该前体生成。T.切赫等研究了 细胞中刚从 DNA 转录成 RNA 后，插入序列如何从前体 RNA 分子 中剪切下来，形成功能完善的 rRNA 的过程。根据过去传统概念， 此过程必须由蛋白质(酶)完成。但他们发现，rRNA 前体能靠自己完 成剪接过程，该 RNA 分子是作为自身催化剂，加速 RNA 本身参与 的化学反应。 阿特曼等研究了 tRNA 分子的剪接过程。他们注意到 tRNA 前 体在核酸酶 P 的作用下切下一段无意义的序列而形成成熟的 tRNA。现知核酸酶 P 虽含蛋白质和 RNA，但它的催化作用是由 RNA 部分完成，蛋白质本身并无催化作用。T.切赫和阿特曼等把这 个新的类似酶的 RNA 定名为“ribozyme” ，中文译为酶性核酸或核 酸性酶。 * 第二节第二节 辅酶的化学（简介）辅酶的化学（简介）* 在很多情况下，酶除了蛋白质外，还需要另一种非蛋白质类物 质存在，才得以表现其催化活性。这些非蛋白质物质称为辅助因子 （cofactor） 。此时酶的蛋白部分叫做酶朊或酶蛋白（apoenzyme） ， 它们通常是无活性的。辅助因子常是金属离子或非蛋白的有机物。 辅助因子中有的与酶蛋白以共价键结合，用透析法不易除去，须经 化学处理才能与蛋白质分开，这类辅助因子称为辅基（prosthetic group） ；另一类情况是，此辅助因子与酶蛋白之间结合松散，用透 析法即可除去，此类辅助因子称为辅酶（coenzyme） ，不过有时两者 也不严格区别，统称为辅酶。辅酶与酶蛋白结合后形成全酶 （holoenzyme） ，又称复合酶。在复合酶中酶蛋白是辅酶的胶性载体， 同时提供键连接的位置及控制该处的化学环境和立体构象；而辅酶 是执行催化任务的基团，能直接与底物作用，完成诸如传递氢、电 子等任务，故常被称为“天然的特殊试剂” 。酶蛋白对辅酶有一定选 择性；而同一种辅酶却往往可与多种不同的酶蛋白结合成为多种复 合酶。下面将结合体内某些代谢反应，介绍某些辅酶的结构和功能。 一、NAD+ NAD+是烟酰胺(又称尼克酰胺)腺嘌呤二核苷酸的英文名称的缩 写(Nicotinamide adenine dinucleotide)，其被称为辅酶 I（其核糖 2/位 磷酸化后的 NADP+被称为辅酶 II） 。 由于它能抗糙皮病，因此又称为抗糙皮病因子或维生素 PP，由 瓦布格（Warburg）于 1935 年首先确定其结构。 O N O NH2 HO OH O P O O O P O O O O HO OR Ad H Ad = R = H(NAD+) = (NADP+) P O O O NAD+NADP+ + N N N N NH2 NAD+是脱氢酶的辅酶，某些脱氢酶还需要 Zn2+离子作为辅助因 子。在反应过程中 NAD+接受一个氢离子和两个电子，这等于接受 一个氢负离子（H） ，生成还原型的 NADH，反应发生在烟酰胺的 4 位。 N R + H+ 2e- + N HH CONH2 R NAD+ -NADH R=核糖-二磷酸-腺嘌呤核苷 具体情况介绍如下： NAD+ H CR OH R(H) + RC O R(H)NADH +H+ 1 或 2 醇 醛或酮 在脱氢酶存在下，NAD+与 1 或 2 醇反应，底物中-H 可发生氧 化脱氢，以负离子（或看成是一个质子，二个电子）形式传递给 NAD+，生成 NADH；醇羟基中的氢同时以质子的形式脱去，进入 溶剂中，底物醇转成醛或酮；在逆反应中，DNAH 失去氢负离子， 醛、酮还原成醇，如丙酮酸还原成 L-乳酸（即 S-乳酸） 。 C C CH3 O O O + NADH + H+ L- C CH3 HOH OO + NAD+ L- 上述反应具有立体专一性。在 L-乳酸脱氢酶作用下，丙酮酸 （包括其它-羰基酸）只还原成 L-乳酸，即(S)-2-羟基酸，这是由 酶与底物之间的结合状况决定的。根据产物构型，可写出以下反应 机理： N R C HH O H2N CO R HOOC H B+ Re OH COOH C R H (S)-2- 图 18-6 -羰基酸的生物还原反应机理 此时，-羰基酸是以 Si 面与酶结合，暴露在外的 Re 面接受来自 NADH 的氢负离子，并从邻近酶上的质子化碱性基团（如 NH3+）夺 取一个质子，最后生成醇。 NAD+（及 NADH）与酶的结合情况同样有两种可能，并影响 产物的结构。NAD+中烟酰胺的吡啶环可用任一环面与酶结合；另一 面则可接受 H的进攻。吡啶环面构型的标定原则类似羰基：以 C3 为标定中心，观察 CONH2、双键及 C 三者的关系。由于酰胺为优先 基团，其次为双键，因此，下列所示的结构中，面对观察者的面为 Re 面： N R CONH2 N HRHS CONH2 R + 在以上 NADH 中，C4位的两个氢处于不同位置，它们与酶结合 时，也会处于不同状态，一般可用前手性的标记方式，将它们标定 为前手性 R 氢（pro-HR）或前手性 S 氢（pro-Hs） 。不同的酶，与 NAD+结合的面可能不同，例如，若用 D作为还原剂，酵母醇脱氢 酶是将 D结合到 NAD+的Re面，得到如下所示的 NADD(A)式；但 若是甘油醛-3-磷酸脱氢酶，NAD+是从 Si 面接受 D，得到 NADD（B）式。 N DH CONH2 R N HD CONH2 R (A) (B) 上述的 NADD 在进行还原反应时，也都是从原来 D进入的方 向脱去 D。例如，若用酵母醇脱氢酶和 NADD（A）还原乙醛时， 产物是 CH3CHDOH，而不是 CH3CH2OH。 H CH3CO + NADD(A) CH3CHDOH + NAD+ H+ + 上述例子也充分体现了由酶进行生物催化作用时的立体化学特 点。实际上，很多体外是非手性的分子，当进入体内发生反应时， 由于与酶的结合而成为手性分子，因而具有了反应的选择性。例如， 乙醛和乙醇都是非手性分子，但在体内发生反应时，羰基的两个面 并不是机会均等地与还原剂反应的，乙醇的两个-氢也不是机会均 等地被氧化脱氢的，NAD+只夺取这两个氢中的一个，即下列结构中 的 HS或 HR。 CH3 HO HRHS 虽然体内反应时看不出这种特点，但用重氢标记的实验可以看 到这种区别： CH3 O NAD D ab CH3 HO CH3 HO (A) (B) H+ Re a b DH DH H 对乙醛的 Re 面具有选择性的脱氢酶，用标记的 NADD 还原时， 只得到产物 CH3CHDOH（A） ，而不是 CH3CHDOH（B） ；对于逆反 应醇的氧化来说，CH3CHDOH（A）也只脱去 D，生成 CH3CHO 而 不是 CH3CDO，这些在体外是不可能实现的。 二、辅酶 A 和乙酰辅酶 A 1945 年李普曼（F Lipmann）发现许多酶所催化的乙酰化反应 都需要一种耐热的辅助因子，几年后将其分离出来并确定了结构。 这种辅助因子称为辅酶 A（coenzymeA 缩写为 CoA 或 HS-CoA） ，A 代表乙酰化（acetylation） 。辅酶 A 是由-巯基乙胺，泛酸和 3/,5/- 三磷酸腺苷构成。 _ ACoA CH2CH2NHCCH O C OH CH2OH CH3 CH3 O O _ _ H2SCH2CH2NHCCH2CH2NHC OO O Ad OHO PO O O OP O O O P O O CH2OC CH3 CH3 CH OH 辅酶 A 是酰基转移酶的辅酶，末端巯基是其活性部位。例如， 形成乙酰辅酶 A 的一种途径就是乙酸在 ATP 的催化下生成混合酸酐， 然后辅酶 A 的末端巯基向酸酐亲核进攻，生成乙酰辅酶 A 和磷酸根。 CH3COOH + ATPCH3C O OPO O O + ADP HSCoA CH3C O SCoA + Pi A 其它酰基辅酶 A 也可以类似的方式形成。酰基辅酶 A 中的硫酯 键不稳定，是类似 ATP 中的高能键，容易发生亲核取代。酰基辅酶 A 中的酰基容易转移给其他物质，所以实际上辅酶 A 只是酰基的载 体，例如： CH3COSCoAHOCH2CH2N(CH3)3CH3COCH2CH2N(CH3)3 O HSCoA + 酰基辅酶 A 的另一个特点是酰基中-H 的酸性。例如，脂肪酸生 物合成的第一步是乙酰辅酶 A 在 ATP 存在下与碳酸氢根的反应，生 成丙二酸单酰辅酶 A。此过程可能是 ATP 与 HCO3先生成混合酸 酐，然后，乙酰辅酶 A 的乙酰基中的-H 在酶作用下脱去，形成 -碳负离子，此-碳负离子与以上混合酸酐反应，生成丙二酸单 酰辅酶 A。 HCO3+ ATPOHO O P O O O + ADP CH2C O SCoA HOC O +