细菌简单染色和革兰染色

实验二 细菌的简单染色和革兰染色 一、实验目的一、实验目的 1、学习无菌操作技术，掌握细菌涂片的制作方法。 2、掌握细菌简单染色法和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。 3、巩固显微镜油镜的使用方法。 二、实验原理二、实验原理 细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性 染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细 菌所带正电荷增加易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。 简单染色法就是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。 革兰氏染色法（Gram Staining）由丹麦病理学家 Christian Gram 于 1884 年创立， 是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别分类为革兰氏阳 性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）这两种类型。 革兰氏染色法之所以能够将细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G- ）两大类，是因为这两类菌的细胞壁结构和成分不同。一般认为革兰阴性细菌的肽聚 糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细 胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色，再经蕃 红复染就染成了红色；革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作 用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色。 虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的 结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。 三、实验器材三、实验器材 1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、待鉴定的未知菌 S1 和 S3。 2、仪器及其他用品：显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、盖玻片、擦镜纸、 擦镜液、吸水纸、镜油、无菌牙签。 3、简单染液：草酸铵甲紫染液、番红染液。 4、革兰染液：草酸铵甲紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液 四、实验步骤四、实验步骤 （一）简单染色（一）简单染色 1、载玻片的处理：从乙醇溶液中取出洗干净的载玻片，用吸水纸擦干，将要涂菌 的部位在酒精灯火焰上烤一下，去除油脂，冷却待用。 2、涂片: 左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上灼烧待冷却后，用接种环从试 管枯草芽孢杆菌培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆 圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻 片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。注意在拔或塞试管塞时，应将试管口在火焰处略 加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 3、干燥：涂片后室温下自然干燥。 4、固定：手持载玻片一端使标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动 23 次，要求玻片温度不超过 60，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后 染色。固定的目的是杀死微生物，固定其细胞结构，保证菌体能牢固地粘附在载玻片 上，以免水洗时被水冲掉。 5、染色：在固定好的涂片标记处滴加 1 滴草酸铵甲紫染液，染色 1min。 6、水洗：缓慢冲洗染液，吸干。 7、实验搭档改用大肠杆菌培养液和番红染液，同时操作以上步骤。 8、镜检：观察两个标本，区分辨别染成的紫色和红色。 （二）革兰染色（二）革兰染色 1、制片：分别取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、未知菌 S1 和 S3 的菌液制成涂片，干燥，固定。 2、初染：滴加 1 滴草酸铵甲紫染液，染色 1min，水洗，吸干。 3、媒染：再加 1 滴碘液覆盖涂片 1min，水洗。 4、脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加 95%的乙醇脱色，轻轻摇动 玻片直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 5、复染：滴加蕃红染液复染 3min，水洗。 6、镜检：吸干水后，盖上盖玻片观察标本，观察时注意细菌形态、大小、排列和 颜色。 （三）选做实验（三）选做实验 在干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂 片后，进行革兰氏染色后观察。 五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论 1 1、革兰染色照片结果（见下一页）、革兰染色照片结果（见下一页） （1）枯草杆菌 图图 1 枯草杆菌革兰氏染色结果，枯草杆菌革兰氏染色结果，10100 如上图所示，枯草杆菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（如上图所示，枯草杆菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+） 。 注：图中红色箭头所指的特殊结构注：图中红色箭头所指的特殊结构芽孢。芽孢。 （2）酵母菌 图图 2 酵母菌革兰氏染色结果酵母菌革兰氏染色结果,10100 如上图所示，酵母菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（如上图所示，酵母菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+） 。 注：图中红色箭头所示为出芽现象。注：图中红色箭头所示为出芽现象。 （3）金黄色葡萄球菌 图图 3 金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,10100 如上图所示，金黄色葡萄球菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（如上图所示，金黄色葡萄球菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+） 。 注：从图中可以清晰地观察到葡萄球状的细菌形态。注：从图中可以清晰地观察到葡萄球状的细菌形态。 （4）大肠杆菌 图图 4 大肠杆菌革兰氏染色结果大肠杆菌革兰氏染色结果,10100 如上图所示，大肠杆菌染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（如上图所示，大肠杆菌染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G ） ） 。 （5）未知菌液 S1 图图 5 未知菌液未知菌液 S1 涂片革兰氏染色结果涂片革兰氏染色结果,10100 如上图所示，菌液中有两种主要的细菌。如上图所示，菌液中有两种主要的细菌。 注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+） ，由细菌形态推，由细菌形态推 测为一种杆菌；蓝色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（测为一种杆菌；蓝色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G ） ） ， 由细菌形态推测为一种球菌。由细菌形态推测为一种球菌。 （6）未知菌液 S3 图图 6 未知菌液未知菌液 S3 涂片革兰氏染色结果涂片革兰氏染色结果,10100 如上图所示，菌液中只有一种主要的细菌。如上图所示，菌液中只有一种主要的细菌。 注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G G ） ） ，由细菌形态，由细菌形态 推测为一种球菌或葡萄球菌。推测为一种球菌或葡萄球菌。 （7）牙垢 图图 6 牙垢涂片中微生物染色结果，牙垢涂片中微生物染色结果，10100 牙垢中含有多种细菌，多数染色为紫色，是革兰氏阳性菌（牙垢中含有多种细菌，多数染色为紫色，是革兰氏阳性菌（G G+ +） ，如红色箭头所示为革，如红色箭头所示为革 兰氏阳性杆菌。兰氏阳性杆菌。 2 2、革兰染色观察结果列表、革兰染色观察结果列表 菌种菌种鉴定结果鉴定结果细菌颜色细菌颜色细菌形状（形状和聚集状态）细菌形状（形状和聚集状态） 枯草芽孢杆菌G+（阳性）紫色杆状菌，较分散，偶有成链状 酵母菌G+（阳性）紫色球状菌，双球状或团状聚集 金黄色葡萄球菌G+（阳性）紫色球状菌，葡萄球状聚集 大肠杆菌G-（阴性）红色球杆状菌，分散排列 S1 未知菌种 1G+（阳性）紫色链杆状菌，较分散 S1 未知菌种 2G-（阴性）红色球状菌，分散排列 S3 未知菌种G-（阴性）红色 球状菌，密集排列，有葡萄球状聚 集 3 3、思考题、思考题 （1）分析影响某一微生物革兰染色结果的因素。 答：菌龄：菌龄：染色所用的细菌最好是出于对数生长期的细菌。因为此时细菌生长旺盛， 个体数目较多，便于观察。若菌龄过大，细菌大量死亡或部分菌自然溶解，造成细胞 壁通透，阳性菌出现假阴性，使得染色结果受到干扰，不准确。 载玻片清洁载玻片清洁：载玻片应清洁无油脂，可以在酒精等火燃上烤一下以去除油脂。 涂片厚度：涂片厚度：涂片厚度太薄，会使细菌过于稀少，但也不宜太厚，因为过厚会使菌体 堆积，影响观察，同时染色时可能会残留结晶紫染料，易出现假阳性。 干燥温度：干燥温度：最好让细菌涂片自然干燥。如果在火焰上略加灼烧令其干燥，温度不能 超过 60 度，若温度太高则菌体变形。 热固定温度：热固定温度：将已干燥的涂片在火焰上通过 3-4 次，温度不超过 60 度，以手背接触 不烫为宜。温度低则菌体固定不牢，水洗时易被冲去；温度高菌体发生变形。 染色：染色：初染色时间应控制在 30s1min 为宜。如果染色时间过短, 不利于初染液结晶 紫与细胞结合,造成阳性菌呈阴性结果。而染色时间过长, 不易脱色，易使阴性菌呈假 阳性。 乙醇脱色乙醇脱色：脱色时间最好在 1020s，以恰好洗脱液物色为准，如果时间过长, 革兰 阳性菌也有可能被脱色, 结果呈假阴性。而若脱色时间不足, 革兰阴性菌细胞壁的部 分类脂质未被乙醇溶解,使结晶紫-碘的复合物不能被洗脱出来,结果呈假阳性。 （2）思考一下，我们平常使用的甲紫药水杀菌机理。 答：龙胆紫为碱性阳离子染料,其阳离子能与细菌蛋白质的羧基结合，从而影响其代谢， 对革兰氏阳性菌有选择性抑制作用，因而产生杀菌作用。一般医用的紫药水是龙胆紫 的 12水溶液或酒精溶液，是常用的外用药。对革兰氏阳性菌、绿脓杆菌、及真 菌（如念珠菌以及皮肤癣菌等）有较强杀菌作用，对革兰氏