糖尿病视网膜病变发病gf研究进展

糖尿病视网膜病变发病机制中 VEGF 与 PEDF 的研究进展 【摘要】 糖尿病视网膜病变（diabeic retinopathy, DR）是糖尿病最常见和最严重微 血管并发症之一，其基本病理改变是血视网膜屏障(blood retinal barrier, BRB)破坏，新生 血管形成。后期新生血管膜收缩牵拉视网膜脱离。DR 的发病机制十分复杂，至今尚未完 全阐明。任何病理改变在本质上均是体内动态平衡的失调，新生血管的形成亦然，血管刺 激因素增强和（或）抑制因素减少使两者平衡失调即所谓的“血管生成开关” 。血管内皮生 长因子（vascuar endothelial growth factor, VEGF）和色素上皮衍生因子（pigment epithelium - derived factor, PEDF）作为血管生成因子与血管抑制因子的一对典型代表，在糖尿病视网 膜病变中的作用已逐渐被人们认识。本文就二者在糖尿病视网膜病变中作用的研究进展做 一综述。并为 DR 的相关药物治疗提供思路。 【关键词】 糖尿病视网膜病变 ；VEGF ； PEDF Perspectives on VEGF and PEDF in the pathogenesis of diabetic retinopathy Xiao-Juan Fan, Xiao-Ling Zhang Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710061, Shaanxi Province, China Abstract Diabetic retinopathy is one of the most frequently and the most severe micrangium complications of diabetes mellitus, the fundamental pathology characteristic of DR is breakdown of the blood-retinal barrier and neovascularization . In the later stage of DR, the formation of the epiretinal membrane, which may tractates the retina and produce detachment of the retina, results in progressive deterioration of vision. The pathogenesis is very complex and has not been elucidated completely. Retinal neovascularization results from both increasing of vascular stimulating factor and reducing of vascular inhibiting factor. As the classic represents of vascular stimulating and inhibiting factor, the function of vascular endothelial growth factor(VEGF) and pigment epithelium-derived factor(PEDF) in pathogenesis of DR has been recognized gradually. This article summarized the function of both VEGF and PEDF and provided ideas for medicine therapeutic to DR. KEYWORDS:diabetic retinopathy; VEGF; PEDF 0 引言 糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病最常见和最严重微血管并发症 之一，它已成为大多数发达国家工作年龄人群致盲的首要原因。在中国，目前有超过 5 000 万糖尿病患者，并以每年 10%的速度增加，因 DR 而致盲者已达 7 万多人。 DR 的患病率 随糖尿病病程的延长而增加，5a 内 DR 患病率为 44.4%，7a 后为 56%1，世界范围内糖尿 病患者人数的增加提示糖尿病视网膜病变将来依然是视力丧失和视功能损害的主要原因。 近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的深入研究，细胞因子在 DR 中的作用已被学 者们广泛关注和研究。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ,VEGF）及色 素上皮衍生因子（pigment epitheliumderived factor, PEDF）作为与 DR 联系最为紧密的细 胞因子之一，逐渐为人们所重视，现将此方面研究成果综述如下。 1 VEGF 的生物学特性及其与糖尿病视网膜病变的关系 1.1 VEGF 的生物学特性 VEGF 是血管内皮细胞特异的促有丝分裂素，对视网膜色素 上皮细胞也有促有丝分裂作用。但是与其他内皮细胞促有丝分裂素如成纤维细胞生长因子 （fibroblast growth factor,FGF）不同的是，VEGF 可以增加血管渗透性。1983 年，研究肿 瘤生长微环境时，研究者发现了一种肿瘤血管渗透因子（tumor vascular permeability factor,VPF）2。1989 年，Ferrara 和 Henze 从牛垂体滤泡细胞培养液中分离出一种内皮细 胞特异的促有丝分裂素，把它命名为 VEGF3，此后用逆转录脱氧核糖核酸 (complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)克隆技术证明，VPF 和 VEGF 是同一种物质。 在生理性血管生成过程中 VEGF 代表了一个关键的限速步骤，在过去的数十年里，VEGF 在调节血管形成中的作用成为研究的目标，并取得了重大进展。VEGF 基因位于 6b21.3， 有 8 个外显子和 7 个内含子构成，由于单基因剪切的位置不同，VEGF 有 4 种亚型： 121，165，189，206。VEGF165 是主要亚型。VEGF 的生物学效应是通过与其特异性受体 结合而发挥作用的。VEGF 受体主要有 fms-样酪氨酸激酶（fms-like tyrosine kinase, Flt-1） 和含激酶插入区受体（kinase insert domain containing receptor, KDR） 。它们与细胞表面相 应受体,VEGFR-1（Flt-1）,VEGFR-2（KDR/Flt-1）和 VEGFR-3（Flt-4）结合后，受体被激 活接着引发靶细胞的细胞内信号转导，细胞增殖、迁移或改变基因表达。VEGF 广泛分布 于人和动物体内的脑、肾、肝、眼等多种组织，正常情况下。在眼部视网膜的周细胞、视 网膜色素上皮细胞和内皮细胞均可产生较低水平 VEGF，生理状态下，VEGF 在眼部呈低 表达状态，这对维持眼部血管的完整是必要的。然而过度表达将促进血管的增殖。 1.2 VEGF 与糖尿病视网膜病变的关系 糖尿病最终导致 DR 的确切病理机制尚未完全 明了，造成视网膜血管渗漏和新生血管生成的始动因素是缺氧，而缺氧通过多途径、多步 骤引起 VEGFmRNA 表达增强，临床及动物实验均已证实 DR 个体眼内特别是视网膜局部 存在高水平的 VEGF。DR 动物模型显示视网膜局部组织末端糖基化产物（advanced glycation end products,AGE）堆积，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAs） 系统活化、蛋白激酶 C（protein kinase C, PKC）激活。而其导致 DR 发生、发展均是通过 VEGF-VEGFR 系统实现的4-6。AGE 可增加牛视网膜内皮细胞（bovine retinal endothelial cell, BRECs）中的 PKC 活性和 VEGF 基因启动子与核因子 B（nuclear factor kappa B, NF-B）的连接活性， 既而 VEGF 表达增加4。血管紧张素（angiotesin, A）刺激 周细胞分泌 VEGF，上调内皮细胞 VEGFR2 的表达从而促进血管内皮细胞的增殖7-8。视 网膜局部高水平的 VEGF 作为一种内皮细胞特异的血管生成与渗漏因子。首先，它参与了 糖尿病视网膜病变中视网膜微血管渗透性的改变，造成血视网膜屏障(blood retinal barrier, BRB)的破坏，引起视网膜渗出、出血，及水肿（糖尿病性黄斑水肿）9，血管内大分子物 质如纤维蛋白进入细胞外基质中形成纤维蛋白凝胶，允许和支持新生血管和基质细胞的内 向生长。它对血管的这种渗透增强作用的完成是通过一种所谓的内皮微小松弛因子的作用 而产生的。在研究 VEGF 引发微血管渗漏的机制中，PKC 途径逐渐明朗，玻璃体腔内注射 VEGF 可使 PKC PKC PKC 亚型发生膜转位，造成视网膜血管渗漏，而 PKC 抑制 剂可减弱此作用10。再者，VEGF 作为血管内皮细胞特异的促有丝分裂素，与细胞表面相 应受体结合后，激活细胞内的一系列信号转导途径，造成内皮细胞增殖、迁移、最终形成 新生血管腔。Funatsu 等用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA） 方法检测出增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy, PDR）稳定与恶化 的患者玻璃体液中 VEGF 差异有统计学意义，而两者血清中的差异无统计学意义，玻璃体 中 VEGF 水平与视网膜新生血管密度显著相关11。提示 VEGF 是与 PDR 新生血管形成关 系最为紧密的一个因子。其次，VEGF 上调视网膜局部细胞间黏附分子-1（intercellar adhesion molecule-1, ICAM1）的基因表达增加视网膜血管 ICAM-1 的 mRNA 和蛋白质水平， 从而造成视网膜白细胞的淤滞和 BRB 破坏，VEGF 的同构体中 VEGF164(165)诱导 ICAM- 1 表达升高的潜能至少是 VEGF120 的两倍。VEGF 抑制剂抑制视网膜 ICAM-1 的表达、白 细胞淤滞和 BRB 的破坏，从而减少视网膜微血管渗漏12-14。临床试验更加证实，糖尿病 视网膜病变患者特别是 PDR 患者视网膜组织、及眼内液中 VEGF 水平增高。活动期 DR 病 例 VEGF 水平高于静止期 DR 病例15-17。由此可见，VEGF 是 DR 发生发展过程中一个 关键性的调节因子，它的作用涉及 DR 发病的多步骤、多途径，人们广泛认为，抑制 VEGF 表达，VEGF 与受体结合，及 VEGF 下游信号途径如 PKC 抑制剂，均可作为治疗 DR 的靶方向。 VEGF 发挥其生物学作用是通过与细胞表面 VEGFR 结合而实现的，高糖条件下分别 培养视网膜血管内皮细胞和大脑来源的血管内皮细胞，结果显示，二者表达相同水平及类 型的 VEGF，而视网膜血管内皮细胞表面 VEGFR 的表达却明显高于大脑来源的血管内皮 细胞，说明视网膜微循环对 VEGF 更加敏感18。推测这与视网膜特殊的微环境有关。 Konopatskaya 等19新近动物实验表明，VEGF 基因由于不同的剪接（羧基末端的氨基酸顺 序不同）而表现出两种类型：促血管生成家族 VEGFxxx 和抗血管生成家族 EGFXXXb。促 血管生成家族可促成眼内新生血管生成。抗血管生成家族在糖尿病视网膜病变患者体内下 调，其中第一个被分离出来的成员就是 VEGF165b，而且证明眼内注射重组人 VEGF165b 可显著减少动物模型的视网膜前新生血管，但不影响生理性血管的形成。由此推测，维持 VEGF 此种亚型的平衡可以作为糖尿病视网膜病变的一种新策略。但 DR 患者眼局部 VEGF 这两种亚型的表达及分布尚需进一步的研究。 2 PEDF 的生物学特性及其与糖尿病视网膜病变的关系 2.1 PEDF 的生物学特性 PEDF 是含 418 个氨基酸，分子量约为 50kDa 的糖蛋白，位 于染色体 17p13，它属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，但无抑制蛋白水解酶的活性作用20。 PEDF 最早由 Tombran-Tink 等从人胎儿视网膜色素上皮细胞培养调理液中纯化分离出来， 能诱导培养 Y79 视网膜母细胞瘤细胞的神经元分化，具有神经营养作用。PEDF 由视网膜 色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)旁分泌至视网膜感光细胞间基质，对视网膜 的分化起重要作用。胎儿和年轻人的 RPE 有较高的 PEDF 基因表达，而衰老的 RPE 细胞 中 PEDF 基因表达下调。在视网膜内核层、神经节细胞层、脉络膜、睫状体、角膜内皮细 胞和上皮细胞及光感受器均有 PEDF 存在。Dawson 等21,221999 年首次发现 PEDF 还具 有很强的抑制血管作用，正常人的房水、玻璃体腔中有较高浓度的 PEDF，可能是维持角 膜玻璃体等眼内组织无血管结构的主要原因。认为 PEDF 是一种双重作用的因子，不仅具 有神经营养作用，还具有抗血管生成的作用。 2.2 PEDF 与糖尿病视网膜病变的关系 随着 DR 发病机理的多方向及深入研究，血管 抑制因子的作用已被研究者所重视。PEDF 被认为是最有效的天然血管抑制因子，近年来 人们对其进行了较为广泛的研究，并且一致认为，在 DR 中 PEDF 是一个保护性因子。抽 掉玻璃体中的 PEDF，抗血管生成的活性消失，表现出刺激血管生成的活性增强。DR 的最 早病理改变为视网膜微血管周细胞丧失及功能障碍，细胞培养证明，AGEs 损伤培养的周 细胞， PEDF 可保护周细胞免受 AGEs 的损伤，这一过程是通过 PEDF 的抗氧化特性来实 现的。AGEs 或活性氧族（reactive oxygen species,ROS）可抑制视网膜周细胞内 PEDFmRNA 的表达，造成 PEDF 水平下降，而 PEDF 水平的下降可使氧化应激诱导的周细 胞凋亡及功能障碍进一步加剧23,从而促使 DR 的进展，微血管瘤形成，血管渗漏，内皮 细胞增殖、移行、新生血管形成。也有研究显示，PEDF 参与了调节 PDR 患者视网膜前新 生血管膜的形成24，这说明，PEDF 的作用贯穿与 DR 病程的全过程。大量临床实验表明 DR 患者房水及玻璃体中 PEDF 水平低于正常对照组，PDR 患者的这种趋势更加明显 15,16,25。造成 DR 患者眼局部 PEDF 水平下降的原因尚未完全明确：体外细胞培养提示， 高葡萄糖可直接下调 RPE 细胞的 PEDF 表达。学者们对 PEDF 抑制血管生成的机制进行了 大量的研究，动物实验表明，静脉注射 PEDF 可抑制 AGE 介导的 VEGF 所引发的血管渗 漏26，全身及玻璃体腔注射人重组 PEDF 可明显抑制高浓度氧或缺血诱导的视网膜新生 血管形成。细胞培养亦证明，PEDF 可抑制 VEGF 诱导的血管内皮细胞增殖与迁移27,28。 这些研究明确了在 DR 的早、中、晚期 PEDF 的保护性作用持续存在，糖尿病视网膜局部 PEDF 水平的减少削弱了这种保护性作用，为 DR 发生创造条件或促使 DR 发生、发展及恶 化。 PEDF 不仅可以抑制新生血管的形成，还可逆转已经形成的新生血管。Mori 等29用 VEGF 转基因鼠模型及激光损伤所致的 CNV 模型进行实验，2wk 后玻璃体内或视网膜下注 射腺病毒载体介导的 PEDF（AdPEDF）对照组用(AdNull),结果显示，PEDF 组新生血管显 著退行，内皮细胞显著凋亡。更有意义的是 PEDF 的这种抑制血管生成的作用是具有选择 性的，它可以抑制生成病理性新生血管，但不影响生理性血管的形成。基因转染的鼠模型 表明，高于生理浓度 3.5 倍的内源性 PEDF 对新生鼠视网膜血管形成和分化不会造成明显 或持久的影响30。因此， PEDF 治疗视网膜新生血管性疾病有广阔前景。 3 VEGF 与 PEDF 在 DR 中的相互作用及影响 血管的发生是由血管刺激因子和血管抑制因子的平衡所控制，正常组织中，血管抑制 因子影响占据优势，因此不会发生新生血管，病理状态下如：PDR，肿瘤发生时，血管刺 激因子增强或/ 和抑制因子减弱，导致新生血管产生。Zhang 等31的实验证明，作为主要 血管刺激因子的 VEGF 和潜在的血管抑制因子 PEDF 之间的平衡对调节血管渗漏与新生血 管的形成是至关重要的。现已证明，VEGF 与 PEDF 之间存在一种互逆的调节，PEDF 可以 大大下调视网膜血管内皮细胞和 Mller 细胞 VEGF 的表达,在 Mller 细胞中，用 siRNA 使 PEDF 基因沉没，可以造成 VEGF 在