胞内游离ca的测定方法

Pluronic F-127 (F127)美国 Molecular Probes Inc.产品。 Ultima 型共聚焦激光扫描显微镜为美国 MERIDIAN Instruments Inc 产品。 1. 光源：Ultima 型 50Mw UV,200Mw Visible 2. 激发波长：351-364nm，488nm，514nm 3. 扫描系统：Ultima 为台阶扫描，精度 0.1um 目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化 原理：正常细胞内游离钙浓度Ca2i 为 0.1 umol/L,胞外钙离子浓度为 1.2- 1.3mmol/L,相差达 10000 倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰 或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系 列代谢紊乱,直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而 易见,测定Ca2i 在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。 Fluo-3/AM 等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM 酯）的形式导入细 胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用 下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。 100ug Fluo-3/AM 溶于 100ul DMSO 中，就是 1ug/ul,1mg/ml,1g/L 方法：1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将 Fluo-3/AM 配制为 1mmol/L(1g/L)原液,- 20oC 避光保存。F127 用 DMSO 配制成 20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养 液将 Fluo-3/AM 稀释成终浓度为 10umol/L，并加入 0.1的 Pluronic F-127 备 用。2.移去培养皿中的原培养液，用 PBS 液冲洗心肌细胞 2 遍，加入 10umol/L 染料液 1ml，置于 37oC 的 CO2 孵箱里避光温育 30min。 3.将染色后的心肌细胞用 PBS 液冲洗 3 遍，加入 1mlDMEM 液后置于 20 倍光学 显微镜观察区域及层面，用 LSCM 观察 Fluo-3 染色的细胞的某一层面的荧光图 像。 4.启动 LSCM，选择 488nm 氩离子激光，启动计算机，运行 lasersharp2000 软 件，选择 time-course 程序，设置扫描间隔时间（30sec） 、扫描次数（300 次） ， 开始扫描。 5.将数据输入 excel 进行整理、统计、分析。 一、细胞内游离一、细胞内游离 Ca2+浓度浓度(Ca2+i)的测定的测定 按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针 Fura-2/AM 或 Fluo-3/AM 来检测细 胞内Ca2+i。Fura-2 的结构类似于四羧酸的 Ca2+螯合剂 EGTA，能以 1：1 的比 例特异性地与 Ca2+结合，与 EGTA 不同的是 Fura-2 可发出荧光，并且结合 Ca2+ 后荧光特性有改变，Fura-2 及其与 Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为 380 nm 和 340 nm，这种变化可指示 Ca2+的存在及其浓度。Fura-2 为一极性很大 的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后 则成为 Fura-2/AM。后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随 后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为 Fura-2，与胞浆中的 游离 Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。并且，Fura-2 与 Ca2+解离容易，随着游离 Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。因此， Fura-2 的荧光强度与Ca2+i呈比例关系，据此可以测定Ca2+i及其变化 (Malgaroli, A., et al., 1987)。 Fluo-3/AM 是继 Fura-2/AM 等之后研制的新一代 Ca2+ 荧光指示剂，与 Fura-2/AM 类似，Fluo-3/AM 进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3 与细胞内游离 Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离 Ca2+ 的浓度。但优于 Fura- 2/AM 的是，Fluo-3 与 Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合 Ca2+ 的游离形式高 40 100 倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度 即可反映Ca2+i的变化。此外，Fluo-3 与 Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细 胞内 Ca2+ 的快速、微量变化。Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为 488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。Ca2+荧光探针用于 检测Ca2+i的基本原理如图 7.1 所示。 图 Ca2+荧光探针检测Ca2+i的基本原理 a， 代表一个细胞模型；b，Ca2+荧光探针的负载； c，Ca2+荧光探针去酯化；d，去酯化的 Ca2+荧光探针与细胞质内游离 Ca2+结合。 Fig. The mechanism for Ca2+i detection by fluorescent Ca2+ probe. Ca2+i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000)，并作适当的改进。具体过 程如下： 1 Ca2+荧光探针负载荧光探针负载 1. 以无菌 D-Hanks 液清洗各处理细胞三次，加入适量的 Fura-2/AM 或 Fluo-3/AM(终浓度为 4 M)和 Pluronic-F127(终浓度为 0.05%)，避光， 37恒温轻轻振荡，孵育 45 min。 2. 负载后的细胞以含 0.2%牛血清白蛋白的 Hanks 液清洗两次，Hanks 液 清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。 3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置 20 min，按实验设计作相应检测。 2 Ca2+荧光强度的测定荧光强度的测定 2.1 荧光双波长分光光度计测定荧光双波长分光光度计测定Ca2+i 1. Fura-2 的荧光强度测定用日立 F-3000 型荧光双波长分光光度计进行。 测定条件为：激发光光栅 5 nm，发射光光栅 10 nm，测定温度为(371)。 2. 取一定量(1106个细胞)负载 Fura-2/AM 的细胞悬液，加入到测量用荧 光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长 300 450 nm，发射光波长 500 nm 进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载 情况，以峰值在 340 nm 左右处为最佳负载状态。 3. 将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为 2 秒)，按以上 参数执行双波长测定。 4. 测定最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)：加破膜剂 Triton X- 100(终浓度为 0.1%)，使 Fura-2 和 Ca2+结合达饱和时，测得的 F340/F380 为 Rmax；加入高浓度的 Ca2+螯合剂 EGTA(终浓度为 5 mM, pH8.5)，以 充分螯合 Ca2+，使 Fura-2 游离，测得的 F340/F380为 Rmin。 2.2 激光共聚焦显微镜测定激光共聚焦显微镜测定Ca2+i 1. 对于 1 组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台 上，以 488 nm 的氩激光激发 Fluo-3 产生绿色荧光，观察各皿中细胞的 形态、细胞中 Ca2+ 的荧光强度及分布变化，拍照。 2. 对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态 扫描选定细胞内 Ca2+荧光强度的变化。激发波长为 488 nm，发射波长 为 515 nm，采样频率为 488 Hz, 每隔 20 sec 扫描一次。细胞内 Ca2+ 荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内 Ca2+ 变化 (相对荧光强度值)的时间 效应曲线，再转换为时间 Ca2+i曲线。 激光扫描参数在整个实验过程中不变。为保证实验结果具有良好的重现性， 每实验组先后重复 3 次，结果重复性良好。 2.3 Ca2+i的计算的计算 根据 Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离 Ca2+(Ca2+i) 的浓度。 Fura-2/AM 检测的Ca2+i计算公式为： Ca2+i = Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)(Fmin/Fmax) 其中，Kd为 Fura-2 与 Ca2+反应的解离常数，为 224 nM；R 为各测定点 F340/F380荧光强度比值；Rmax、Rmin分别为上述测定的最大和最小荧光比值； Fmin、Fmax分别代表 Ca2+为零及饱和时，在 380 nm 激发光下测得的 Fura-2 荧光 强度(F380)。实际计算由日立 F-3000 钙测定系统钙定量软件自动求出。 Fluo-3/AM 检测的Ca2+i计算公式为： Ca2+i = Kd(F-Fmin)/(Fmax-F) 其中，Kd为 Fluo-3 的解离常数，为 400 nM；F 为对样品检测得到的荧光强 度值，Fmax、Fmin分别为加 0. 程如下： 1 Ca2+荧光探针负载荧光探针负载 1. 以无菌 D-Hanks 液清洗各处理细胞三次，加入适量的 Fura-2/AM 或 Fluo-3/AM(终浓度为 4 M)和 Pluronic-F127(终浓度为 0.05%)，避光， 37恒温轻轻振荡，孵育 45 min。 2. 负载后的细胞以含 0.2%牛血清白蛋白的 Hanks 液清洗两次，Hanks 液 清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。 3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置 20 min，按实验设计作相应检测。 2 Ca2+荧光强度的测定荧光强度的测定 2.1 荧光双波长分光光度计测定荧光双波长分光光度计测定Ca2+i 5. Fura-2 的荧光强度测定用日立 F-3000 型荧光双波长分光光度计进行。 测定条件为：激发光光栅 5 nm，发射光光栅 10 nm，测定温度为(371)。 6. 取一定量(1106个细胞)负载 Fura-2/AM 的细胞悬液，加入到测量用荧 光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长 300 450 nm，发射光波长 500 nm 进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载 情况，以峰值在 340 nm 左右处为最佳负载状态。 7. 将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为 2 秒)，按以上 参数执行双波长测定。 8. 测定最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)：加破膜剂 Triton X- 100(终浓度为 0.1%)，使 Fura-2 和 Ca2+结合达饱和时，测得的 F340/F380 为 Rmax；加入高浓度的 Ca2+螯合剂 EGTA(终浓度为 5 mM, pH8.5)，以 充分螯合 Ca2+，使 Fura-2 游离，测得的 F340/F380为 Rmin。 2.2 激光共聚焦显微镜测定激光共聚焦显微镜测定Ca2+i 3. 对于 1 组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台 上，以 488 nm 的氩激光激发 Fluo-3 产生绿色荧光，观察各皿中细胞的 形态、细胞中 Ca2+ 的荧光强度及分布变化，拍照。 4. 对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态 扫描选定细胞内 Ca2+荧光强度的变化。激发波长为 488 nm，发射波长 为 515 nm，采样频率为 488 Hz, 每隔 20 sec 扫描一次。细胞内 Ca2+ 荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内 Ca2+ 变化 (相对荧光强度值)的时间 效应曲线，再转换为时间 Ca2+i曲线。 激光扫描参数在整个实验过程中不变。为保证实验结果具有良好的重现性， 每实验组先后重复 3 次，结果重复性良好。 2.3 Ca2+i的计算的计算 根据 Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离 Ca2+(Ca2+i) 的浓度。 Fura-2/AM 检测的Ca2+i计算公式为： Ca2+i = Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)(Fmin/Fmax) 其中，Kd为 Fura-2 与 Ca2+反应的解离常数，为 224 nM；R 为各测定点 F340/F380