肽核酸的研究进展及展望

肽核酸的研究进展及展望肽核酸的研究进展及展望 2004-11-04 肽核酸的研究进展及展望 刘娜 何蕴韶 中山大学达安基因诊断中心,广东 广州 510080 摘要 肽核酸 (PeptideNucleicAcids,PNAs),是 20 世纪 90 年代 初发现的新型DNA/RNA 同类物 ,是一类人工合成的用蛋白质骨架代 替核酸中的磷酸核糖骨架而形成的新型分子,由于它拥有诸多 DNA/RNA 不具备的优点，因此具有非常广泛的分子生物学效应，尤其 在疾病的诊断和基因治疗方面有着广泛的应用前景。本文就PNA 寡聚体的结构、与核酸杂交的特点及杂交模式，分子生物学效应，合 成以及应用等方面予以综述。 关键词 肽核酸 ;反义 ;基因诊断 自从 1991 年丹麦 Nielsen 设计并合成了肽核酸（PNA）以来，因 为其对核酸结合的高度特异性和高度亲和力而备受关注。成为继寡核 苷酸（ oligodeolynucleotides,ODNs）以来更为有效而稳定的反义， 抗基因靶向性制剂。在基因诊断、基因治疗、端粒酶活性的抑制等各 个分子生物学领域都得到了广泛的应用，在基因调节药物研究方面也 显示了强大的潜力。 1 PNA 寡聚物的结构和分子生物学特性 PNA 是以电中性的肽链酰胺2-氨乙基甘氨酸组成的多聚酰胺键取代 了 DNA 中的戊糖磷酸二酯键骨架而形成的类似核苷酸的物质，每个碱 基通过亚甲羰基接头（linker）与甘氨酸碳原子相连形成与靶核酸 杂交所需的序列 1。PNA 的书写方式是从5端至 3端,像传统 的 DNA 序列那样 ,PNA 寡聚体的氨基末端 (NH2)相当于 DNA 的 5 端,PNA 寡聚体的羧基末端 (COOH)相当于 DNA 的 3末端。尽管 PNA 单体也具有一个游离的氮末端和一个游离的碳末端，但严格说来 它既非肽又非酸，仅仅具有一个拟肽骨架，因而化学上和蛋白质（肽） 更为接近。它与DNA 的相同之处在于PNA 也携带 ATCG 四种碱基单 体，这就保证了PNA 能够按照碱基互补的原则识别相应的碱基序列。 与 DNA 不同的是它没有磷酸戊糖骨架，因在结构上与传统的寡核苷酸 有所不同 ,故其与寡核苷酸相比,PNA 寡聚体具有独特的特性:PNA 寡聚体具有较好的热稳定性、较高的结合亲合力及不依赖于盐浓度的 特殊性。它们不被目前已知的任何核酸酶或蛋白酶所降解2，3。 PNA 寡聚体的优越的特性还在于它们形成三链体的能力及诱导双链核 酸分子产生链置换的能力4。而且， PNA 与相应的 DNA、mRNA 的转录及翻译的启动位点结合后，可以抑制相应的转录及翻译过程。 这些特性使 PNA 在反义药物的研究设计上有潜在的应用价值。 2 PNA 与核酸杂交的特点及杂交模式 2.1 PNA 与核酸杂交特点 由于 PNA 的电中性骨架，其分子中不含磷酸基团，因此PNA 链更 容易和带有负电荷的互补序列的DNA 或 RNA 链结合 2。而且形成 的复合物分子较之DNA/DNA 双链或 DNA/RNA 杂交链更为稳定 1，3，4。有报道证实 4，在同样的杂交条件下，同样序列的 15mer 的 DNA/DNA 双链的 Tm 值是 53.3，DNA/RNA 为 50.6， 而相应的 PNA/DNA 的 Tm 值为 69.5，PNA/RNA 更高，为 72.3。 即 PNA/DNA，PNA/RNA 与同样序列的DNA/DNA，DNA/RAN 双链相比， 每增加一个碱基数，Tm 值增加 1。 PNA 与核酸杂交不仅具有很高的亲和性，还有很高的特异性。 PNA 对互补 DNA 的错配容忍程度比相应的DNA/DNA 更低，一个 15mer 的 PNA/DNA 分子在其中间段出现一个错配碱基，其Tm 值下 降 820，两个碱基错配则完全不能杂交4，5。 PNA 的一个独特性质是以平行或反平行的方式与核酸结合4。所 谓平行 ,就是 PNA 的氨基末端对着寡核苷酸5端,反平行 ,就是 PNA 的氨基末端对着寡核苷酸3端。 PNA 与 DNA(或 RNA)形成的 双螺旋倾向于反平行结合4,而形成的三螺旋倾向于平行结合 6。且两种结合方式都得到非常稳定的复合物4。当一个 PNA 分子侵入靶 DNA 序列时，一条DNA 链被置换 1.2,通过 Watson- Crick 碱基配对原则迅速而高度特异的与其互补DNA 结合 4。此 后，第二个 PNA 分子又与 PNA/DNA 双螺旋以 Hoogsteen 键形成非 常稳定的（ PNA）2/DNA 三链结构，留下未结合的链呈单链状态。 PNA 的这些特性引起了反义和杂交技术领域众多研究者的兴趣。 2.2 PNA 与 DNA、RNA 杂交模式 如前所述， PNA 单链可以通过碱基互补配对原则与相应的 DNA、RNA 单链形成稳定的双链结构4.7。同时， PNA 多聚同源嘧 啶单链在 dsDNA 双螺旋的外侧以Hoogsteen 键的方式与互补碱基 配对，形成 PNA-dsDNA 三链体。 2.2.1 常规的 PNA-dsDNA 三链体模式 PNA 多聚同源嘧啶单链在 dsDNA 的双链外侧，以Hoogteen 键的方式与互补的碱基配对，形成 PNA-dsDNA 三链体。当 PNA 富含胞嘧啶时，这种结合较为稳定。 2.2.2 三链侵袭（ Triplex invasion）模式 这种方式形成的复合 物相当稳定，而且可以有效的抑制转录活性，从而在反义核苷酸的研 究上具有非常重要的意义。这种模式通常发生在多聚同源嘧啶 PNA 和相应的多聚嘌呤dsDNA 靶序列之间。 Nielsen 等1在合成 PNA 之初就观察到他所合成的连续10 个胸腺嘧啶 PNA（PNA- T10）可以在 DNA 双螺旋内部，以Watson-Crick 方式替换原靶序 列 dsDNA 中的 dT10,与靶序列的 dA10 相结合，形成PNA-DAN-PNA 复合物的结构；另一条dT10 PNA 单链则在复合物外侧以 Hoogsteen 键的方式与复合物结合，从而形成稳定的四链体结构。预 计该反应机理是当 “DNA 呼吸 ”发生时， DNA 双螺旋结构在瞬间变 为单链结构， PNA 利用它和 DNA 链的超强结合作用侵入到DNA 双 螺旋的内部，以类似“拉链的方式 ”完成侵袭反应 1。这一利用 DNA 呼吸的原理在随后的实验中被证实，当dsDNA 存在负超螺旋 结构而使双链打开时，PNA 结合效率明显提高 8。而在转录过程 中由于转录泡的形成而导致双链暂时打开时，PNA 也更容易侵入 dsDNA 双螺旋内部 9。 2.2.3 双链侵袭（ Duplex Invasion）模式 这种结合方式常发生 在多聚同源嘌呤PNA 和 dsDNA 的同源嘧啶靶序列之间，PNA 侵入 到 dsDNA 双螺旋内部，以Watson-Crick 氢键的方式和靶序列结合， 形成 DNA-PNA-DNA 三体复合物。当PNA 中的腺嘌呤被二氨基嘌呤代 替时，复合物的稳定性进一步提高。每替换一个腺嘌呤，Tm 值提 高 2410。这种结合方式至少在某些负超螺旋DNA 靶序列 上是有效的。 2.2.4 双螺旋侵袭（ Double helix invasion）的模式 这种模式 是在上种模式的基础发展而来的。在这种模式中，dsDNA 两条链 上的某段序列同时作为靶片段，分别设计两条PNA 探针，也称 “假互补 PNA”（Pseudocomplementary PNA,pc PNA）。探针中的 腺嘌呤（ A）全部用二氨基嘌呤（D）取代，胸腺嘧啶（T）全部 用巯基尿嘧啶（ sU）取代。这样一来，当两条含有D、sU 的 pcPNA 与相应的 dsDNA 发生反应的时候， pcPNA 可同时与 dsDNA 两条链中相应的靶序列结合，形成稳定的PNAdsDNAPNA 复合 物。而 pcPNA 本身两条链间由于D 和 sU 立体结构的位阻作用却无 法结合，这就保证了pcPNA 在识别靶序列的同时不会自己互补。 Lohse 等11的实验结果证实这种结合特异而高效，估计80以 上的靶序列是考Watson-Crick 键的方式与 PNA 结合的。 Demidov 等12更是对这种模式的动力学过程和可能的机制进行了详尽的探讨。 与以上几种链侵袭的模式比较，这种模式显然更具有广泛的应用前景。 因为 PNA 不需要非得是多嘧啶不可，它可以设计成任何与靶序列互补 的碱基序列。 3 PNA 的合成 PNA 的合成目前采用固相肽核酸合成法合成PNA5。此法是使用 9-氟烯基甲氧碳酰 (Fmoc)肽合成技术。其中单体中的氨基主链被 Fmoc 保护起来 ,这种方法使 PNA 结合于肽以及象生物素或荧光染料 这样的标记物上，每一合成周期大约需要30 分钟，主要分为以下 几个步骤 :装柱。与常规的将被合成的C 末端氨基酸连接于固相 支持物的肽合成柱有所不同，PNA 合成柱仅含有聚苯乙烯固相支持 物。 洗涤。合成开始前，用二甲苯甲酰胺(DMF)洗涤 PNA 合成 柱。 去封闭。以六氢吡啶/DMF 去除 Fmoc 保护基团。 洗涤， 通过 DMF 洗涤去除过量试剂。活化和偶联。在存在二异丙基乙胺 和六氟代磷酸酯混合物的情况下,将新合成的 PNA 单体活化偶联到 固相树脂 (或者偶联到延伸的PNA 链上 )。洗涤。用 DMF 洗涤去 除过剩试剂。 加帽。通过溶于二甲基吡啶/DMF 中的乙酸酐将未 反应基因加帽。 洗涤。以 DNF 洗涤去除多余试剂。将 PNA 产 物与比例为 4:1 的三氟三酸及m-甲酚混合物共同温育以进行切割和 最终脱保护。这种切割和去保护的PNA 寡聚体在 260nm 波长下定 量,通过反向液相色谱和质谱进行纯度分析及PNA 产物定量。 260nm 下 OD 值为 1 时,PNA 产物含量相当于26g。 4 PNA 应用 4.1 PNA 在分子生物学技术上的应用 PNA 不带电荷，不会被核酸酶或蛋白酶降解,也不会与血清蛋白结 合，并且 PNA 与 DNA 或 RNA 连结能力强、特异性很高。PNA 具有 普通寡核苷酸所没有的众多特性，在分子生物学技术方面应用广泛。 分析 DNA 中的点突变： PNA 与 DNA 或 RNA 链结合形成的 PNA/DNA 和 PNA/RNA 热稳定性高且对碱基错配敏感，一个碱基的错 配可使值大幅度下降，利用PNA 此特点可以不用测序就能分析 DNA 序列中的点突变。zerny 等13发明了一种 PNA 定向 PCR 钳技术，它不需要测序，仅用简单的一步就能发现点突变的存在。这 种技术主要用来探测DNA 片段中某种已知的点突变，在zerny 设计的 PCR 反应体系中含有待扩增的模板DNA 以及一个 PNA 片段 和两条 DNA 引物。其中 , PNA 与野生型 DNA 的 5端互补 , DNA 引 物中一条与 DNA 突变型的 5端互补而另一条则是两者共有的 3端引物。如果待扩增的DNA 模板中没有发生点突变,则 PNA 片 段与 DNA 模板相连 , PCR 反应被终止 ;反之 ,则 DNA 引物与 DNA 模 板相连 , PCR 反应得以进行。通过改变相应DNA 引物和 PNA 片段 , 不同的点突变可以用这种方法检测出来。扩增较长序列的DNA: PCR 技术由于可以特异性扩增极微量的DNA 片段 ,而在法医学、亲 子鉴定和分子生物学研究中得到广泛的应用。但是,被扩增的 DNA 片段中可能含有多个不规则重复序列。这些含重复序列的基因可 以在退火时发生模板链内或链间杂交从而妨碍较长序列DNA 的扩 增。 PNA 的出现解决了这个问题。在PCR 反应体系中 ,加入与 DNA 模板中间重复序列互补的PNA 片段 ,该 PNA 片段与 DNA 模板退火杂 交,从而封闭已变性的DNA 模板中的重复序列。PNA 与 DNA 模板退 火杂交温度一般较高(78),在此温度下 ,模板中间的重复序列彼此 不会杂交 ,当 PNA 封闭已变性的DNA 模板中的重复序列后,降低温 度使 PCR 引物与变性的DNA 模板两端杂交 (温度一般为 60),然 后升高温度 (72)以完成 PCR 反应的延伸过程 ,与此同时将 PNA 与模板分离。用此方法可以扩增出较长序列的DNA 片段 14。 特异性切割 DNA:同源嘧啶组成的PNA 可以与含有一段同源嘌呤的 模板牢固结合 , PNA 这个特性可以使限制性内切酶只对个别位点进 行特异性切割。 eselkov 等15合成了一段由同源嘧啶组成的 PNA,然后用它去封闭DNA 上一段同源嘌呤组成的序列。在未被封闭 的 DNA 的其它部分甲基化后,再去掉 PNA 片段。因为 DNA 模板中 的同源嘌呤部分受到了PNA 的保护 ,所以只有此段避免了被甲基化, 因此也只有此段能被限制性内切酶有效的切割。另外, PNA 可以 用来从复杂的混合物中捕获特异性DNA 和 RNA 片段 ,并且在捕获的 效率和特异性方面比使用DNA 更好。 offa 等16用生物素标记 的 PNA 先与染色体中互补DNA 片段结合 ,再与磁性亲和素微球连接 后将含 CAG 重复序列的转录基因从染色体中分离出来。DNA 杂交 实验亦证实用该法提取的基因特异性高,信息量完整。 4.2 PNA 在疾病诊断领域的应用 4.2.1 PNA 用于荧光原位杂交（FISH）分析 这是目前为止发展较 为成熟的一种技术，这项技术可以针对病原微生物的分子化石 rRNA 的序列来设计PNA 探针，利用该探针结合FISH 的方法来 分离，鉴定，计数病原微生物。这项技术也可以利用卫星重复序列来 设计针对人类染色体的特异性PNA 探针，用于染色体异常性疾病的 诊断。还可以设计出端粒酶PNA 探针用于检测癌症及衰老问题。 4.2.2 PNA 用于 “PCR 夹”的研究 这是利用 PNA 与 DNA 的高亲和 力及高特异性，结合PCR 技术检测目的核酸序列中的单碱基突变。 由于 PNA 无法被 Tag 酶所识别，因此尚无法作为PCR 引物。利用 这一特性，可以针对目的碱基设计出一对单个碱基差异的寡聚 PNA 和 DNA 加入反应体系中，其中PNA 仅能和野生型目的碱基配对， DNA 引物则与突变型目的碱基配对。当模板是野生型时，PNA 利 用它与 DNA 的高度亲和力竞争性彻底抑制了PCR 反应的进行，使 反应无任何产物生成。而当模板是突变型时，DNA 引物即可以结 合到模板上，经过足够多的循环数，扩增出目的条带。该技术已经被 广泛应用于各种基因点突变的检测17。 4.3 基因组切割和图谱分析 嘧啶同聚体 PNA 与 dsDNA 结合形成的 D-环结构为单股DNA，它对 S1 酶和绿豆核酸酶敏感1,因此可以用 S1 酶对基因组 DNA 进行 定点切割和基因克隆。但这样切割的DNA 有片段缺失。采用PNA 对，即一分子PNA 与基因的模板链结合，另一分子PNA 与非模板 链结合，如此形成的P-环能限制 S1 酶的切割范围 1.18。S1 酶 定点切割 dsDNA 虽然简单、有效，且不需要甲基化的步骤，但它不 能产生粘性末端，也不能进行基因组DNA 酶切图谱的分析。 PNA 与 dsDNA 结合后，可以保护重叠区内或距结合区23 个核苷 酸以远的核酸限制性内切酶位点不被甲基化酶所甲基化，也不被限制 酶所切割 19。PNA 与染色体或大片段DNA 结合后，用甲基化酶处 理， PNA 结合区以外的甲基化酶识别位点被甲基化，不会被匹配限制 酶所切割。当PNA 从 dsDNA 链上洗脱下来后， PNA 结合区内的限 制酶位点因未被甲基化而可被特异的限制酶切开，从而达到对染色体 和大基因组片段进行定点切割的目的。 4.4 基因表达调控 从基因到蛋白质要经过转录形成mRNA,再以 mRNA 为模板译成蛋白 质的过程。 PNA 通过与 dsDNA 或 RNA 结合而影响转录和翻译的过程。 用 T3、T7 及哺乳动物细胞pol所做的实验表明 20.21，PNA 与 dsDNA 中的模板链结合能抑制转录的延伸。这种抑制效率与 PNA 组成有关，一般1015 聚体 PNA 即可有效抑制。 T10 同聚 PNA 导致的转录在PNA 的第一位碱基， T5C1T4PNA 在第 2 或第 3 位碱基上。 T2C1T2C1T4PNA 则在最后的 3 位碱基上。 PNA 抑制转 录延伸的作用比寡核苷酸强，且不需要进行修饰。实验证明同聚嘧啶 PNA 与 dsDNA 进行结合形成的P-环可以作为转录的启动子，与 DNA 自身启动子竞争转录系统22。启动反义 RNA 链的合成，这 是很有意思的结果。如果PNA 将来能作为基因打靶的药物，它可从 反基因（ antigene）和反义 mRNA（antisense）两个环节阻断基因 表达。 PNA 与 RNA 结合能阻断逆转录合成cDNA,与寡核苷酸不同，这种阻 断是直接的。在转染了SV40 大 T 抗原的细胞内注射PNA，发现大 T 抗原的表达从PNA 靶序列处剪短，而对-半乳糖苷酶蛋白则能 完整表达，说明这种阻断作用是特异的，与用细胞浆提取物所做的实 验结果一致，说明PNA 在细胞内至少能从RNA 水平上发挥基因靶 向药物的作用 20，一般 15 聚体 PNA 即可。 4.5 PNA 在基因治疗上的应用 基因治疗是指制备正常基因代替遗传缺陷基因或关闭、抑制异常基因。 基因原位修复是最理想途径,但目前在技术上很难做到。由于肽核 酸具有广泛生物学效应,作为基因治疗药物有很大潜能。 4.5.1 PNA 作为反义药物 PNA 的反义性质是指PNA 与 mRNA 结合 , 从而阻断翻译 ,使蛋白质的合成不能进行。理论上,PNA 是最有前 途的反义药物。 PNA 不受血清及体液中的核酸酶及蛋白酶降解, 是作为反义药物的重要前提。与的结合力强,特 异性高 ,因而抑制特定基因表达所需的剂量很小。PNA 与单链 RNA 结合 ,同时也与其相应单链DNA 结合 ,而且 PNA/RNA 复合物的 稳定性远较 PNA/DNA 的稳定性为高。 PNA 可特异地阻遏翻译过程, 形成双螺旋的PNA 如果与起始密码子区域互补,可阻遏翻译 ,并表 现出剂量依赖型；如果与编码区互补则无阻遏作用；而形成三螺旋的 PNA 在两种区域均可阻遏翻译23。 4.5.2 PNA 反基因药物 反基因策略的作用靶是DNA,通过在每个基 因组中形成 PNA/DNA 复合物 ,理论上就可抑制转录。当作用靶是 mRNA 时,PNA 必须与细胞中大量RNA 结合才可抑制翻译 ,所以反 基因策略更有吸引力。PNA 能与双链 DNA 结合形成很稳定的链取代 复合物 ,因此它们是很好的反基因试剂。已有实验证实这种 PNA2/ds DNA 复合物在体外能阻断原核及真核RNA 聚合酶的延伸 24。其中的一个实验研究了PNA 对噬菌体 RNA 聚合酶 3 及 7 参与的转录的影响 ,靶序列位于 bluescript +质粒上 3 或 7 启动子的下游。实验发现,结合于模板链针对高嘌呤位点 的 10 聚 PNA 可阻止转录 ,而非结合于模板链的PNA 则不能阻止转 录。 Nielsen 等25进行引物延伸实验发现在PNA 结合的位点 , Tag DNA 聚合酶和 Ecoli DNA 聚合酶大片段受到抑制。同样PNA 可抑制 RNA 聚合酶 ,终止基因的转录。另外,PNA 除了阻止 RNA、RNA 聚合酶外 ,针对 DNA 结合蛋白识别基因控制区的PNA 也 可能下调基因复制和转录。 5 PNA 展望 根据 PNA 的代谢稳定性，主要将其用于抑制基因表达的反义药物研究 领域，国外几家制药及生物技术公司，ISIS、PE 等公司均投入大 量精力从事开发研究；根据其与DNA 优良的杂交稳定性，PNA 又 被广泛用于 DNA 分子识别和操纵。 PNA 可以广泛用于病原体、遗传 病检测的分子杂交、原位杂交、突变分析、抗癌、抗病毒反义核酸研 究和应用。尤其是PNA 可以取代寡核苷酸用于基因芯片的制备，将 比普通基因芯片更稳定，特异性也更好，被认为是基因芯片的升级产 品，相信在临床诊断芯片的开发方面。PNA 也可用于定量PCR， 可以用于实时检测PCR 的扩增反应；也可将其做成PNA Beacon，用于实时监测细胞内的RNA 表达。随着 PNA 基础研究的 不断深入 和新技术的不断出现，PNA 将显示出无比优越的性能和更 为广阔的 应用前景。 参考文献 1 Nielsen PE et al. Science, 1991; 254:1497. 2 Peffer NJ et al . Proc Natl Acad Sci USA ,1993;90(22):10648. 3 Ecker DJ et al . Natl Biotechonl,1998;16:332. 4 Egholm M et al. Nature, 1993; 365: 566. 5 ScarfiS,GA et al.BiochemBio- physResCommun,1997；236(2):323-326. 6 Nielsen PE,EgholmM,BuchardtO.BioconjugateChem,1994,5:3. 7 Wittung P et al. N