11 动物细胞培养与表达制备药用蛋白_ppt课件

第11章 动物细胞培养与表达制 备药用蛋白 下篇 动物细胞工程 本章主要内容 1. 动物细胞培养的概念、历史 2. 动物细胞培养的特点 3. 动物细胞培养工具与条件 4. 体外培养细胞生长与增殖过程 5. 细胞株与保存 6. 动物细胞小规模培养 7. 动物细胞大规模培养 8. 动物细胞培养生物反应器 9. 动物细胞大规模培养影响因素 10. 动物细胞表达制备药用蛋白 11-1 动物细胞培养概念与历史 1、动物细胞培养（Animal cell culture）：是模拟体内 生理环境使动物细胞在体外增殖、生存的一种技术。包括 ： 原代培养：动物细胞进行首次传代前的培养过程。 传代培养：将原代培养细胞继续转接培养的过程。 2、历史： 1907年,哈里森（Harrison）采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬 滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活了几周 时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培 养的先河。 法国学者卡雷尔（C（Carrell）设计的卡氏培养瓶1923年用于 培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大推动了动物细胞培养 技术的建立。 1951年，厄尔利（Earle）等人开发了动物细胞体外培养 的培养基。伴随着培养工具与培养基的不断完善，动物细 胞体外培养技术日益成熟。 11-2 动物细胞培养的特点 1、动物细胞无细胞壁，比微生物细胞大 2、动物细胞倍增时间长，生长缓慢 3、培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。 4、动物细胞间主要以聚集体形式存在。 5、原代细胞培养繁殖50代左右即退化死亡。 6、对营养需求更加苛刻，除常规营养外还需血清等。 7、对培养条件或环境极其敏感。 8、容易受污染。 9、大多需要贴附在固体或半固体表面 才能生长。 （一）动物细胞培养特点 体外生长的动物细胞一般具有贴附性、细胞接触 抑制性、密度抑制性的特点。 悬浮型细胞：与微生物、植物细胞不同，动物 细胞中只有极少数细胞体外生长可在培养液 中悬浮生长，培养密度高、效率高。血液白细 胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞 。P98 1、类型： 贴附型细胞：大多数哺乳动物细胞必须附着在 固体或半固体表面才能生长，另外也包括细胞间 相互接触。 （二）动物细胞培养类型与形态 接触抑制性 (Contact inhibition) 是指由 于动物细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象 （图）。由于这个特性，正常细胞并 不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。 密度抑制(Density inhibition) 细胞接触汇 合成片后，细胞仍能进行增殖分裂。 但是当细胞密度达到一定程度后， 营养相对缺乏，代谢产物增多，发生 密度抑制生长现象。 （3）游走型细胞 细胞呈分散生长，一般不连接成片，胞质 常伸出伪足和突起，呈活跃游走或变形运 动，方向不规则，在器皿上生长位置不固 定。此型细胞不稳定，外形不断变化，密 度大时难以和成纤维、上皮细胞相区别。 包括单核巨噬细胞系统：白细胞、淋巴 细胞、单核细胞、巨噬细胞等。 （4）多形型细胞 多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，包括细 长型胞突和多角形胞体。 多形型细胞不常见，体外培养呈现多形型细胞的 细胞最常见的是神经原和神经胶质细胞。 实际上，体外培养的动物细胞形态常受培养条件 影响，呈现过渡形态。 1、培养工具 多为玻璃或无毒塑料制成的： 培养瓶的形状主要是适合细胞贴壁生长 和显微镜观察的扁平形状。 培养皿 培养管 仪器包括：CO2培养箱、相差显微镜等。 目前大多采用微载体(多孔塑料培养板)作为介 质培养贴附型细胞生长，类似悬浮培养效果。 11-3 动物细胞培养工具与条件 另外，同微生物、植物细胞培养不同，动 物细胞培养的培养基与其他溶液不能经受 高温灭菌，多采用40nm过滤除菌（例如支 原体污染。 2、培养条件 温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为 37。细胞对低温耐受性更强， 40高温数小时可 使细胞死亡。 pH：哺乳动物细胞为7.27.4，耐酸不耐碱。 渗透压：细胞在高渗透压或低渗透压溶液中会发 生皱缩或肿胀，甚至破裂。 BSS溶液。 气体：细胞的生长代谢离不开O2和CO2 。 二氧化碳培养箱供应CO2 ，还可调节pH值 。 3、动物培养基 对于营养要求非常苛刻，包括必需氨基酸、维生素 、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子、 血清等。 分为：天然、合成、无血清培养基三种。 （1）天然培养基 常用动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液 、鸡胚胎汁等。 优点：营养价值高，培养效果好 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高 血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝 或去纤维蛋白法)的血浆。 血清的生物功能 1.提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机 物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必 须的物质。 2.提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺 皮质激素、类固醇激素（雌二醇、睾酮、 孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、 表皮生长因子、血小板生长因子等。 3.提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的 低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、 以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细 胞代谢过程中起重要作用。 4.对培养中的细胞起到某些保护作用： 提供促接触和伸展因子，使细胞贴壁免受机械损伤。 血清蛋白形成的粘度，可以保护细胞搅拌时免受机械损 伤。 血清中含有抗蛋白酶成分，可以使用血清来终止内皮 细胞、骨髓样细胞释放胰蛋白酶的消化作用。 血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起 重要作用，如硒等。 （2）合成培养基 优点：成分已知，便于对培养条件进行控制。 缺点：无法替代天然培养基中一些未知成分 解决途径合成培养基中添加小牛血清，彼此 互补 目前常用的合成培养基包括：MEM、DMEM、 RPMI1640、F12、M199等，具体配方参见本章附录 （P123） 例如 MEM培养基：厄尔利（Earle）于1951年开发成功 。含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的 无机盐，组成简单。 DMEM培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在 MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的 含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（ 4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型适 合生长较快、贴附性差的细胞（例如肿瘤细胞）培 养。 （3）无血清培养基 血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的 成分 血清培养基缺点： （1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用 .（2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过 程不易检测控制。 （3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养 产物的分离、提纯以及检测造成一定困难。 无血清培养基 无血清培养基(Serum free medium,SFM)是不含 血清的动物细胞培养基，由基础培养基和添加已知组 分组成。试图全部替代血清成分。 基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。 添加组分主要包括：生长因子、激素（胰岛素、胰 高血糖素等）、结合蛋白与转铁蛋白、细胞外基质 、酶抑制剂等。 4、动物细胞培养常用溶液 （1）平衡盐溶液（Balanced salt solution，BSS ） 主要由生理盐水和葡萄糖组成，具有维持细胞渗透压 、调控培养液酸、碱度平衡的功能。 例如：Hanks液、Earle液（缓冲能力强） 注：酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂： 中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。 （2）培养基pH调整液 动物细胞对酸碱度要求十分严格，大部分合成培养液都呈 微酸性，若灭菌前调整到标准值，灭菌后又会降低，因此 pH调整液应单独配制和灭菌，在培养液灭菌后再加入调整 pH值最好。 常用pH调整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES 液等。 注：HEPES （4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种非离子两性缓冲液 ，其在pH 7.2 - 7.4范围内具有较好的缓冲能力： （3）细胞消化液 使用目的：培养前让组织块消化解离成分散细胞， 或传代培养时使细胞脱离器皿表面并分散解离。 胰蛋白酶溶液：水解细胞间的蛋白质，使细胞分 散，使用浓度0.125或0.25%，用无 Ca2+、 Mg2+的 Hanks或PBS缓冲液配制，pH值6.8-7.2，2-10分钟消 化完后加血清终止反应。 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化液：非酶性解离 细胞，毒性小、经济、操作方便，使用浓度0.02% 。 注：若将两者结合使用，解离效果更好： EDTA：胰蛋白酶体积比=1：1或2：1 （4）抗生素溶液 作用：防止微生物污染。 常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉 菌素等。 通常是青霉素和链霉素联合使用：培养基内最 终使用浓度 为 青霉素100U/ml、链霉素100微 克/ml（双抗）。 1、动物细胞体外培养的一般过程 一般经过：组织获得与消化、接种、原代培养、传代培养几 个环节 11-4 动物细胞培养生长和增殖过程 原代培养期 传代期 衰退期 图11-8 动物细胞培养过程生长曲线 2、动物细胞原代培养 原代培养（Primary culture）：从体内取出组织 接种直接长出单层细胞到第一次传代培养前的阶 段（一般持续1-4周）。 特点：在这个阶段，细胞有分裂但不旺盛，细胞 多呈二倍体核型。这样的细胞称为原代细胞。 优点：细胞生物性状尚未发生很大变化，在一定程 度上能反映体内的形态学特征，是药物测试、研究 细胞分化等很好的实验材料。 2.1 组织块原代培养法 是比较常用早期简易的原代培养方法： （2）接种与培养：用吸管吸出组织块，放入培养瓶内，每小 块间隔0.5厘米，使其均匀贴在培养瓶的壁上（可涂血清）。 然后将贴有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞上瓶塞，将 培养瓶缓慢翻转使培养液覆盖组织块，倾斜置于37的CO2培 养箱内静置培养。 （3）生长周期：一般情况下，组织块贴壁后24小时细胞就从 组织块四周长出，24小时后可再补充培养液，3-5天即可形成 单层细胞再更换培养液即首次传代培养 ，若5-7天组织块中央 的组织细胞逐渐坏死脱落。 （1）组织块的分离：将组织块剪碎成1mm3大小，加Hanks缓冲 液，用吸管吸打，离心，收集沉淀即为组织块。也可用注射器 挤压，或用网筛分离得到细小的组织块。 2.2 组织消化原代培养法 （1）取材与消化酶解法制备单细胞 根据不同的组织对象采用适当的酶消化液获得动 物细胞团或单个细胞，然后进行培养。 最常用的有胰蛋白酶和胶原酶，此外链霉蛋白酶、粘 蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。 消化传代细胞常用EDTA与胰蛋白酶一起使用。 胰蛋白酶法 适用消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织 、羊膜、上皮、肝、肾等 胶原酶解：适用于结缔、上皮、癌组织等，使胶原酶最终浓度 为200u/ml，36.5，静置448小时，上面悬液经离心获得或纤维 细胞沉淀，沉淀重置于生理盐水，去掉未解向组织块后沉淀得到上 皮样细胞。 组织消化原代 培养示意图 1.检查细胞形态及活力：倒置显微镜下观察培养瓶中原 代细胞，生长良好者轮廓不清晰，较透明；生长不良者 反而轮廓清晰，形态不规则，胞内有空泡、颗粒等。 四唑氮蓝法(MTT)法可以检测细胞活力：活细胞的线粒 体脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨 （Formazan)并沉淀在细胞中。 2.培养液pH及污染检查：含血清的新鲜培养液呈桃红色， pH在7.27.4之间。CO2的积累使培养液pH下降， 当超出缓冲范围时，培养液变黄，需要34天更换 一次培养液。CO2培养箱能自动控制5%的CO2含量。 细菌污染时培养液变浑浊；支原体易透过滤器，污染 不易被发现。 （2）原代培养期检查 倒置显微镜：组成和普通显微镜 一样，只不过物镜与照明系统颠 倒，前者在载物台之下，后者在 载物台之上，用于观察培养的活 细胞，具有相差物镜。 3、动物细胞传代培养 传代培养（Passage culture/Subculturing）是指 将原代培养的细胞继续转接培养的过程，一般可传 代50代左右。传代培养期间的细胞称为细胞系。 注意：每进行一次分离再培养称为传一代，即从 细胞接种培养到分离再培养期间的一段时间。在 细胞的一代中，细胞约能倍增36次。 传代培养方法 悬浮生长的细胞可以采用加入新鲜培养基后直接 吹打分散传代，或者采用自然沉降法加入新鲜培 养基后再吹打分散进行传代。 贴壁生长的动物细胞，原代培养细胞分裂增 殖扩展成片后需要进行细胞分离重新接种培养。 一般采用酶消化法进行传代培养。 视频：动物细胞培养技术: /v_show/id_co00XOTE5MDQzMg=.html 酶消化传代过程 1、吸出或者倒掉培养瓶内的 旧培养液。 2、加入胰蛋白酶和EDTA混合 液盖满瓶底，轻轻摇动培 养瓶。 3、25分钟后检查，有细胞 间隙变大、细胞质回缩现 象时添加培养液终止消化 。 4、吸出消化液，加入Hanks 液轻轻转动，洗去残留消 化液。 5、加入培养液，用吸管轻轻 吹打瓶壁，使细胞脱落制 成悬液。 6、计数，接种进行传代培养。 动物细胞的传代培养 11-5 细胞株与保存 1.细胞系(Cell line) 是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细 胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群 体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。 不能连续培养的为有限细胞系(Finite cell line)， 能连续培养下去的为连续细胞系(Infinite cell line)。 2.细胞株(Cell strain) 是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分 离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的 细胞群，称细胞株。 细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细 胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。 3 动物细胞株类型 包括： 原代细胞、传代细胞 有限细胞系、无限细胞系（不具有接触抑制现象；理 想的药物生产细胞） 二倍体细胞、异倍体细胞 融合细胞、转化细胞、基因工程细胞 （1）原代细胞 常用有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、血液 淋巴细胞 1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎组织细胞 生产脊髓灰质灭活疫苗，开创了动物细胞培养进 行生物制药的先河。 缺点：具有需要大量动物组织、成本高、费时费力等。 药物筛选、药理研究。 （2）二倍体传代细胞 二倍体细胞具有正常细胞的特点：二倍体染色体、 具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。 有限细胞 系（传代次数一般都不超过50代）。 WI-38： 1961年Wister 38研究所从女性高加索人 的正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系WI- 38。培增时间24h；贴壁生长；第一批获得批准用 于生产的二倍体细胞有对病毒敏感，第一个用于疫 苗（脊髓灰质灭活疫苗）生产。 MRC-5：二倍体，成纤维，生长比WI-38快。 （3）融合细胞 如杂交瘤细胞：脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合细 胞。用于抗体药物生产。 将药用蛋白基因转化入动物细胞培养，用于大量生产 药物。 （4）基因工程细胞 （5）转化细胞 细胞转化是指细胞发生遗传改变而产生永生化， 即由限定性细胞系转化为连续性细胞系，可以在 体外进行无限传代和生长繁殖。 不同于癌细胞，没有致瘤性。 倍增时间短，对培养条件与生长因子要求低。 由于转化细胞常常由于染色体断裂而变成异倍体， 失去正常细胞的特点。转化细胞于20世纪80年代获 得批准用于生产。 转化方法 1.细胞自转化 体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象 在许多正常二倍体长期传代过程中出现。可能的 因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污 染等。 2.人工诱发转化 采用诱导剂使正常细胞发生转化。凡是可以改变 DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、 物理和病毒诱导剂。 CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)：从中国 仓鼠卵巢分离的细胞，亚二倍体，有多种突变株。 贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压 改变有较高的忍受能力。 CHO细胞能表达糖基化蛋白药物：组织纤维蛋白 溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator， tPA)、促红细胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、 乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis B virus surface antigen, HBsAg）、粒细胞集落刺激因 子（Granulocyte colony stimulating factor,G- CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。 比二倍体减少1条(2n-1)或几条染色体的细胞称亚二倍体 Vero细胞（Vero cell）:是1962年日本从非 洲绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体， 贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞 之一。 BHK-21细胞（Baby hamster kidney cell）：是 1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样， 异倍体。常用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白(例 如重组凝血因子VIII)。 （1）先酶消化分散成单个细胞，用冷冻保护液（含 10%血清的培养液+10%甘油或二甲基砜DMSO）冷却， 同时将细胞稀释成25*106个/ml。 （2）分装： 1ml /安瓶 （3）冷冻机内冷冻至-25 （4）液氮罐长期冷冻保存。 （5）细胞复苏： 37水浴快速融化 4 动物细胞冷冻保存 1、悬滴培养 是最早建立的体外培养技术，是组织和器官培养的 经典方法。 将培养液滴于盖玻片上并铺展开，将待培养的组 织或器官植块放于铺展开的培养液中央部位，然 后将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封后进行培养。 11-6 动物细胞小规模培养 2、灌注小室培养 是在悬滴法基础上的改进，实现营养液的循环供 应与流出。 3 培养瓶培养法 1923年，卡雷尔（Carrel）设计成功卡氏瓶，可 以保证动物细胞培养的无菌环境和生长空间。 培养瓶培养法是目前动物细胞小规模培养的主要 方法之一。 培养对象直接接种于培养瓶内再放入培养箱 4 培养板培养法 接种在培养板孔（48、96）内，然后置于CO2培养 箱培养。 目前常规方法之一。 5 转管培养法 1933-1934年，盖尔（Gey） 和刘易斯（Lewis）建立了旋 转管培养方法，将培养物接 种于一管状培养器皿中，再 将其固定在一可以旋转的装 置上旋转培养。 旋转管培养方法克服了静置 培养的不足，例如：细胞生 长环境不均匀、不利于营养 的吸收等，培养物可以交替 地接触培养液和气体环境， 利于细胞或组织生长。 6 转瓶培养法 将转管换成培养瓶，增加了培养液与 空气接触面积 1 悬浮培养 是指细胞在反应器培养液中自由悬浮生长。 主要用于非贴壁依赖型的少数细胞培养：杂交瘤细胞、 血液白细胞、淋巴细胞，某些肿瘤细胞等。 贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后 可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。 11-7 动物细胞大规模培养 优点：细胞呈单个游离态存在，传代时无需再消化分 散；增殖快，产量高，培养过程简单。 2. 微载体培养 微载体（Microcarrier）：是直径60-250m的 带正电荷微粒（葡聚糖聚合物），适于贴壁型细胞生长。 1967年，维茨尔（Van Wezel）开发了微载体系统。 微载体培养成既能满足动物细胞的贴壁要求，又能 使微珠悬浮起来，实现3D培养，摆脱了传统的培养 瓶（管）培养限制（面积有限，占用空间大，细胞 产率低，监控不便，劳动强度大） 。 2.1 微载体特点 1.良好的生物相容性、无毒无害 2.有好的黏附性，一般带正电荷 3.大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一 4.良好的传质性能 5.强的机械性能：重复利用、保护细胞 6.好的热稳定性：能高压灭菌 2.2 微载体分类 1.实心微载体 优点：易于细胞在表面贴壁，机械强度高， 容易接种操作 缺点：细胞浓度低；细胞容易受剪切力、搅 拌、碰撞等影响；细胞易老化脱落。 2.多孔微载体 优点：比表面积更大生长空间大；内部生长可使 细胞免受机械损伤；易固定化培养，可以 采用高的搅拌速度和通气量，强化传质。 缺点：容易产生营养传递障碍，积聚代谢副 产物。 2.3 微载体培养细胞方法 1、选择合适的微载体类型：细胞贴壁率高、细胞容纳量大等 。 2、浸泡水化及消毒：用含Ca2+、Mg2+的PBS浸泡微载体 3h，洗涤1次，高压灭菌。 3、接种：根据不同细胞类型决定接种浓度。 细胞在微载体表面的贴附是关键，主要取决于细胞与 微载体的接触概率和亲和性，也与培养基组成（血清提供促 接触和伸展因子）、要慢速搅拌等相关。多数细胞都可在24小时 内贴壁。 4、培养与观察、细胞计数：观察形态是否正常，并计 数控制密度。 1.游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。 2.吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数 细胞都可在24小时内贴壁。 3.繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。 随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片。出 现接触性抑制。 4.退化期：细胞长满载体表面，随着营养物的消耗和代 谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不 及时传代培养，细胞脱落死亡。 微载体细胞培养生长过程 2.3 微载体培养细胞方法 酶消化法：碳酸氢钠碱性溶液浸泡，贴壁性差，使细胞脱落； 用含EDTA的PBS缓冲液洗涤微球， 胰蛋白酶-EDTA 37浸泡搅动消化15min后，血清终止 5、消化与细胞回收：细胞贴壁率高、细胞容纳量大等。 6、细胞收获：离心沉降法(400r/min,2min)或100um过滤法。 7、传代培养：“球传球”传代培养技术。 球传球接种技术 将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细 胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技 术。 优点： （1）避免了细胞收获与微载体再生过程，方便、 高效。 （2）防止细胞调亡：通过定期更换微载体也能 为细胞的分裂生长提供了新的生长空间，在长期 培养过程中保持细胞活力，延长了细胞寿命，提 高了细胞分泌物的产量。 视频： /v_show/id_XNzA0NTc1NzI=.html 机械搅拌式：浆叶改造 充气搅拌式：需要改造 微载体培养：解决空间分布与贴壁，连续灌注培 养 中空纤维式：解决贴壁、营养气体有效吸收交换、 连续灌注培养 11-8 动物细胞培养生物反应器 细胞生长在由半透性的多孔膜制 成的中空纤维中外表面。 柱式中空纤维生物反应器 中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜。 主体是由微孔中空纤维管束制成的中空丝，纤维束 由外壳包裹，因此可分为中空内腔与中空外腔两部分， 每部分各有其进出口。新鲜培养液从中空内腔导入。气 体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体内 部。 无菌空气进出口 中空纤维反应器 板框式：平行排列的中空纤维床 中心灌流式 优点：克服了纤维轴向流动时营养供应与 产物积累存在的浓度梯度 多孔 通气 模拟细胞在体内生长的三维状态。 既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细 胞的培养。细胞如果是附壁性的，则附着在纤维 外壳表面，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其 消化冲出；若是非附壁性的，应采用微滤材料将 其截留在反应器内而让培养液排出。 优点：无剪切力影响，高密度培养，传质效 率高。 缺点：容易堵塞，价钱昂贵。 柱式中空纤维生物反应器评价 1、有毒物质或抑制因子产生 氨：来自培养基+代谢，积聚影响细胞生长和蛋白糖基化。 乳酸：来自细胞的糖代谢，抑制乳酸脱氢酶，抑制糖酵 解，能量产生减少，抑制细胞生长。 甲基乙二醛：脂类、氨基酸的代谢产物，对细胞有潜在 的损伤作用，改变有机物-NH3和-SH2。 CO2：毒害细胞或改变代谢水平、增大细胞渗透压。 11-9 动物细胞大规模培养的影响因素 原因：营养成分耗尽、有毒产物积累 如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦 发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞 在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为 脆弱，更容易发生凋亡。 渗透压：影响细胞生长、死亡速度，影响产物积累； 载体：空间大小、孔隙大小，贴壁性、细胞移动性 细胞死亡与凋亡：凋亡基因bcl-2 11-9 动物细胞大规模培养的影响因素 2、物理因素 参数控制：在线监控 pH、温度、氧气、搅拌等 灌注培养 1.减少细胞调亡 （1）可以去 除氨、乳酸、 甲基乙二醛等 代谢物质。 （2）保证营 养供给。 2.连续性收获 产品 采取怎样的工艺操作才可以消除 细胞凋亡，保证高的细胞浓度？ 11-10 动物细胞表达制备药用蛋白 大多数哺乳动物蛋白翻译后的修饰，例如：糖基 化、磷酸化和乙酰化等，是保持生物学活性、稳 定性及抗原性的前提。 转基因微生物在生产分子量较小、结构较为简单 的异源蛋白方面具有优越性，微生物表达系统合 成的复杂真核蛋白存在折叠方式不正确、缺乏翻 译后加工修饰等缺陷，动物细胞蛋白质表达系统 可以较好地解决这些问题。 1. 动物转基因方法 （1）物理法-电穿孔法 利用脉冲电场提高 细胞膜的通透性， 在细胞膜上形成纳 米级的微孔，达到 增加通透性的效果 ，从而使外源DNA 转移至细胞中。 简单、效率较高。 DEAE-萄聚糖法 早期使用转基因法，效率低。 原理：带负电的DNA吸附在带正电荷的DEAE（二乙氨乙基）表 面形成颗粒，通过胞饮作用进入胞内。 （2）化学方法 磷酸钙-DNA共沉法： 比前者高，但转基因效率还较低。 原理：形成磷酸钙-DNA沉淀颗粒，Ca2+能促使细胞膜脂裂开形 成孔隙，使DNA进入，也可通过胞饮作用进入胞内。 脂质体载体包埋法 将需转移的外源DNA或RNA 与脂质体混合，带负电的 DNA自动结合到带正电的 脂质体内形成DNA-阳离子 脂质体复合物。由于脂质 体具有磷脂双层结构，与 细胞膜类似，因此可以与 受体细胞膜融合，从而将 外源DNA转入宿主细胞。 效率高。 逆转录病毒法 逆转录病毒是一种整合型 的单链RNA病毒。 将目的基因重组到反转录 病毒载体上，感染细胞。 病毒进入细胞后，利用宿 主细胞编码出反转录酶，将病毒 RNA反转录成dsDNA，再自行和 复制，再整合到宿主细胞DNA上 ，但机制不明确。 如牛乳头瘤病毒BPV，载体容量 小（8KB）可表达干扰素、生长 素等基因。 （3）生物学方法 2. 转染细胞与筛选 需选用在体外能无限生长的细胞作为受体细胞。采 异用特性选择标记用于快速有效地筛选转染细胞。 例如： 胸腺嘧啶