人类基因组学相关技术课件

第十五章 人类基因组学 相关技术 基因组 genome 一个细胞所有染色体的总和。 一个物种的所有DNA分子的总和. 基因组学 genomics 阐明整个基因组的结构、结构与功能的关 系以及基因之间相互作用的科学。 人类基因组计划 （ Human Genome Project，HGP） “认识你自己。” 铭刻在古希腊阿波罗神庙门楣 上的这句神谕，千百年来鼓舞 着人类对自我进行探索。 20世纪人类科技发展史上的三大创举 90年代人类基因组计划 40年代第一颗原子弹爆炸 60年代人类首次登上月球 （一）什么是人类基因组计划 nHGP：是个国际性研究项目，旨在阐明人类基 因组DNA的全部核苷酸序列，识别所有人类基 因并进行染色体定位及功能分析，同时了解 非编码区序列的位置和功能，即完成23对染 色体的全序列测定，及遗传图谱、物理图谱 、转录图谱和序列图谱的绘制。 n同时对模式生物（大肠杆菌、酵母、线虫、 果蝇和小鼠等）基因组进行研究。 Whats HGP? “ONE BASE ONE DOLLOR!” A TAXI Driver/A TAX Payer 人类基因组计划的研究概况 1986年 美国病毒学家R杜尔贝 科1986年3月7日在美国科 学杂志上发表了一篇题为 癌症研究的转折点人 类基因组的全序列分析的 文章，他指出：“人类DNA序 列是人类的真谛，这个世界 上发生的一切事情，都与这 一序列息息相关。”该文后 来被称为“人类基因组计划 ”的“标书”。 1988年 1988年美国能源部和国家卫生研究院率 先在美国开展人类基因组计划，并经国 会批准由政府给予资助。此后，成立了 一个国际间的合作机构人类基因组 织 (Human Genome Organization)，由 多个国家筹集资金和科研力量，积极参 加这一国际性研究计划。 1989年 美国国家卫生研究 院成立了人类基因 组研究国家中心（ NCHGR）,沃森出任 第一任主任。 1990年 1990年，美国国会批准了“人类基因组 计划”，并于10月1日正式启动，由多国 科学家参加、被称为“生命科学阿波罗 计划”的人类基因组计划正式启动。预 计用15年时间，投资至少30亿美元，完 成30亿对碱基的测序，并对所有基因进 行绘图和排序。美国承担了全部任务的 54%，英国33%，日本7%，法国2.8%，德 国2.2%。 中国于1999年9月加入人类基因组计划并 承担了1%的测序任务。 1998年 1998年，生产DNA测序仪的最大厂家 Perkin-Elmer(简称PE)公司与文特尔领 导的基因研究所合作成立了塞莱拉（ Celera）遗传信息公司，并宣布他们将 利用最新“全基因组鸟枪法”在3年内完 成人类基因组的测序工作，这使得该计 划处于一种公私竞争的状态，从而加快 了人类基因组的研究步伐。 2000年 2000年6月26日，美国国家人类基因组 研究所所长弗朗西斯柯林斯、塞莱拉 公司的董事长兼首席科学家克莱格文 特尔、美国总统克林顿、英国首相布莱 尔联合宣布人类基因组工作草图绘制成 功。此后，人类基因组研究进入绘制“ 完成图”的阶段。 二000年六月二十六日克林顿宣布 人类基因组草图绘制完成 2001年2月16日 人类基因组“精细图”完成，准确 率由90上升到99%。 2003年月14日，人类基因组序列图亦 称“完成图”（99.99%），提前绘制成 功。 2003年 2000年6月公共领域测序计划工作框架图 已经完成基因组测序的部分生物种属 物种名称 (species) 基因组大小 (genome size) 文献 （reference） 酿酒酵母Saccharomycescerevisiae 12,068,000bp Science 274:546,1996 大肠杆菌(Escherichia coli) 4,653,831bp 4283个结构基因 Science277:1453,1997 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 1,830,240bp Science269:496,1995 生殖器支原体（Mycoplasma genitalium） 600,000 bp Science270:397,1995 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori） 1,667,867 bp Nature388:539,1997 包柔氏螺旋体(病) 901,725bp (染色体)533,000(质 粒) Nature390:580,1997 结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis） 4,410,000 bp Welcome Trust资助英、法科学家于 Sanger中心完成,1997, 12宣布 梅毒螺旋体(treponema palliadccm) 1,138,000 bp Science281,375,1998 线虫（Caenorhabditiis elegans） 97Mb,19,000基因 Science 282:2012,1998 人 3109 bp Science291,1304,2001 拟南芥（Arabidopsis thaliana） 120Mb Nature408:796,2000 果蝇（Drosohila melanogaster） 180 Mb Science287,2185,2000 第一节 人类基因组计划的 主要研究内容 1.遗传图谱 2.物理图谱 3.序列图谱 4.基因图谱 遗传图谱转录图谱 0.7 cM 或 kb 序列图谱物理图谱 100 kb100 kb STS mapSTS map 一、遗传图谱 genetic map 指通过遗传重组所得到的基因线性排 列图也称为遗传连锁图(linkage map) 。 它是通过计算连锁的遗传标志之间的 重组频率，确定他们的相对距离， 一般用厘摩（cM，即每次减数分裂 的重组频率为1%）来表示。 构建遗传图谱的基本原理： 真核生物遗传过程中会发生减数分裂，此 过程中染色体要进行重组和交换，这种重 组和交换的概率会随着染色体上任意两点 间相对距离的远近而发生相应的变化。根 据这一点，人们就可以推断出同一条染色 体上两点间的相对距离和位置关系。 cM值越大，两者之间距离越远。人类基 因组的遗传大小已经确定为3600cM 理想的分子遗传标记应具备的特点 遗传多态性高; 检测手段简单快捷，易于实现自动化; 遗传共显性，即在分离群中能够分离出等位基因的3种 基因型。 标记遍布整个基因组； 准确性，能正确反映动物的真实遗传，即标记是经济性 状基因，还是与影响重要性的性状连锁。 实验重复性好（便于数据交换）； 开发成本和使用成本尽量低廉； 现代的DNA标记连锁图 RFLP（限制性酶切片段长度多态性） （restriction fragment length polymorphism ） STR（短串联重复序列，又称微卫星） (short tandem repeat) 基因组内含量丰 富、多态信息含量理想、可利用PCR 的 手段进行检测 SNP（单个核苷酸的多态性分析） （single nucleotide polymorphism） RFLP的原理 利用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大 小不等、数量不同的分子片段， 经电泳分离， 通过Southern印迹将DNA片段转移至支持膜 (尼龙膜或硝酸纤维素膜)上， 然后用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高 辛，荧光素)标记的探针与支持膜上的DNA片 段进行杂交。 不同基因组DNA酶切位点的改变，会使得 RFLP谱带表现出不同程度的多态性. 限制性内切酶的酶切原理： 限制性酶切长度多态性(RFLP) 微卫星遗传标记的原理 以微卫星DNA标记两侧特异性序列设计专 一引物，通过PCR技术扩增微卫星片段， 扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ，不同个体间因核心序列的重复次数不同 而产生DNA多态性。 短串联重复序列(STR) 微卫星遗传标记示意图 A B PCR扩增 凝胶电泳 1 2 3 AA AB BB 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs） 检测SNP的特异杂交 DNA芯片 二、物理图谱 physical map 物理图谱:是指以已知核苷酸序列的DNA片段(序列 标签位点，sequence-tagged site, STS)为“路标” ，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距 )的基因组图。 l序列标签的特点: 基因组中任何单拷贝长度为100500bp的已知序列 在染色体上的位置明确 可用PCR方法进行扩增的单一拷贝 连续克隆系图： 物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切 成片段，利用载体将所有的人类基因组 DNA分段克隆，然后将含有STS序列的对 应克隆相互重叠连接以明确其位置。 大片段克隆载体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosomes, YAC） 酵母 人工 染色 体载 体YAC 外源DNA的克隆过程 YAC的主要缺点 1存在高比例的嵌合体，即一个YAC克 隆含有两个本来不相连的独立片段； 2部分克隆子不稳定，在转代培养中可 能会发生缺失或重排； 3难与酵母染色体区分开，因为YAC与 酵母染色体具有相似的结构。 4操作时容易发生染色体机械切割。 以细 菌寄主系统为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低 ，转化效率高，又易于分离。科学家用“染色体建造“法用 F质粒及其调控基因构建细菌载体，克隆大片段DNA。该 质粒主要包括oriS， repE（控制F质粒复制）和parA、 parB（控制拷贝数）等成分。 细菌人工染色体（BAC） 三、序列图谱 以某一染色体DNA上所含的全部碱基序列 绘制图谱，包括： 转录序列 非转录序列 是转录序列、非转录序列、调节序列及功 能未知序列的总和。 人类染色体上3.16109个bp全部顺序 策略：经庞大的DNA分子分区克隆，并赋予一 定的标志（遗传图和物理图的标志），逐段进 行序列分析，再将序列根据标志拼接起来获得 一个完整的DNA分子的核苷酸排列顺序。 PCR技术 DNA自动测序技术 How many characters are in the “Heaven Book”? 3*10 9 10,000 books 1 book 100 pages 1 page 3,000 characters CCGGTCTCCCCGCCCGCGCGCGAAGTAAAGGCCCAGCGCAGCCCGCGCTC CTGCCCTGGGGCCTCGTCTTTCTCCAGGAAAACGTGGACCGCTCTCCGC CGACAGTCTCTTCCACAGACCCCTGTCGCCTTCGCCCCCCGGTCTCTTCC GGTTCTGTCTTTTCGCTGGCTCGATACGAACAAGGAAGTCGCCCCCAGCG AGCCCCGGCTCCCCCAGGCAGAGGCGGCCCCGGGGGCGGAGTCAACG GCGGAGGCACGCCCTCTGTGAAAGGGCGGGGCATGCAAATTCGAAATGA AAGCCCGGGAACGCCGAAGAAGCACGGGTGTAAGATTTCCCTTTTCAAAG GCGGGAGAATAAGAAATCAGCCCGAGAGTGTAAGGGCGTCAATAGCGCT GTGGACGAGACAGAGGGAATGGGGCAAGGAGCGAGGCTGGGGCTCTCA CCGCGACTTGAATGTGGATGAGAGTGGGACGGTGACGGCGGGCGCGAA GGCGAGCGCATCGCTTCTCGGCCTTTTGGCTAAGATCAAGTGTAGTATCT GTTCTTATCAGTTTAATATCTGATACGTCCTCTATCCGAGGACAATATATTA AATGGATTGATCAATCCGCTTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGACTACAGAC GGTGCCATCACGCCCAGCTCATTGTTGATTCCCGCCCCCTTGGTAGAGAC GGGATTCCGCTATATTGCCTGGGCTGGTGTCGAACTCATAGAACAAAGGA TCCTCCCTCCTGGGCCTGGGCGTGGGCTCGCAAAACGCTGGGATTCCCG GATTACAGGCGGGCGCACCACACCAGGAGCAAACACTTCCGGTTTTAAAA ATTCAGTTTGTGATTGGCTGTCATTCAGTATTATGCTAATTAAGCATGCCC GGTTTTAAACCTCTTAAAACAACTTTTAAAATTACCTTTCCACCTAAAACGT TAAAATTTGTCAAGTGATAATATTCGACAAGCTGTTATTGCCAAACTATTTT CCTATTTGTTTCCTAATGGCATCGGAACTAGCGAAAGTTTCTCGCCATCAG TTAAAAGTTTGCGGCAGATGTAGACCTAGCAGAGGTGTGCGAGGAGGCC GTTAAGACTATACTTTCAGGGATCATTTCTATAGTGTGTTACTAGAGAAGTT TCTCTGAACGTGTAGAGCACCGAAAACCACGAGGAAGAGAGGTAGCGTTT TCATCGGGTTACCTAAGTGCAGTGTCCCCCCTGGCGCGCAATTGGGAAC CCCACACGCGGTGTAGAAATATATTTTAAGGGCGCG (1250 characters) 关键是先要从一个个序列片段中得到这本天书 全基因组鸟枪法测序的主要步骤： 第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb 左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量， 即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基 因组5倍以上。 第二，高效、大规模的末端测序。对文库中 每一个克隆，进行两端测序，TIGR在完成流感 嗜血杆菌的基因组时，使用了14台测序仪，用 三个月时间完成了必需的28,463个测序反应， 测序总长度达6倍基因组。 第三，序列集合。TIGR发展了新的软件， 修改了序列集合规则以最大限度地排除错误的 连锁匹配。 第四，填补缺口。有两种待填补的缺口，一 是没有相应模板DNA的物理缺口，二是有模板 DNA但未测序的序列缺口。他们建立了插入片 段为15-20kb的文库以备缺口填补。 用鸟枪法完成流感嗜血杆菌基因组测序 DNA序列测定的意义 DNA的序列测定是分子生物学研究中 的一项非常重要的和关键的内容。如 在基因的分离、定位、基因结构与功 能的研究、基因工程中载体的组建、 基因表达与调控、基因片段的合成和 探针的制备、基因与疾病的关系等等 ，都要求对DNA一级结构的详细了解 。 四、基因图谱 转录图谱 利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱 被称为转录图谱。 通过从cDNA文库中随机挑取的克隆进行 测序所获得的部分cDNA的5或3端序列 称为表达序列标签（EST，expressed sequence tags ），一般长300-500bp左 右。 研究人类基因组计划所从事4张图谱的常规策略 第二节 人类基因组计划 在医学中的意义 一、基因结构与功能的研究 二、基因组信息与疾病易感性的研究 三、基因组与癌症研究 四、疾病的遗传学背景 五、药物基因组学 HGP将给人类带来的好处 1、将带动一场医学革命 用基因图谱看病 基因药物治病 基因检测预防隐患 基因治疗疾病 2、获取了操纵生命的工具 控制生命的孕育优生优育 延长人的寿命 选择最佳生活环境 3、得以进行精确的个体鉴定 基因身份证 生物考古 4、将带来巨大的商机 生物制药 器官培植 BRCA1基因 HGP 可能给人类带来的隐患 社会平等与基因歧视 科技进步与基因技术滥用 社会公正与基因成果利益的均等分配 技术的不确定性和基因安全 DNA Report 我这辈子没戏了！ 个人隐私！ 基因注定论？ 基因组相关的伦理学问题基因组相关的伦理学问题 要不是你的基因告了密， 我们本可以录用你。 第三节 人类基因组计划数据的利用 l基因数据库 美国国家生物技术信息中心和位于欧洲和日本 的姊妹组织储存着整个基因序列,其中包含已 知序列，假设基因和蛋白质。其他组织像加州 大学圣塔克鲁斯分校和ENSEMBL提供附加数 据，注释和观察和检索数据的有力工具。 基因组注释 l生物信息学 l 美国的核酸数据库GenBank Banson,D.A. et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26, 1-7从1979年开始建设，1982年 正式运行； l 欧洲分子生物学实验室的EMBL数据库 也于1982年开始服务； l 日本于1984年开始建立国家级的核酸数 据库DDBJ，并于1987年正式服务。 从那个时候以来，DNA序列的数据已经从 80年代初期的百把条序列，几十万碱基上 升至现在的110亿碱基！这就是说，在短 短的约18年间，数据量增长了近十万倍。 计算机运算速度: 18个月增长一倍; DNA序列数据: 14个月增长一倍; 什么是生物信息学？ Genome informatics is a scientific discipline that encompasses all aspects of genome information acquisition, processing, storage, distribution, analysis, and interpretation. 它是一个学科领域，包含着基因组信息的 获取、处理、存储、分配 、分析和解释的 所有方面。 一、NCBI基因组数据库的应用 提供大量信息 人的22条常染色体、X和Y染色体目前序 列分析的详细资料； 疾病和基因关系的教学用选择性病例； 其它生物基因组序列：线虫、病毒和细 菌等生物。 提供重要站点链接： BLAST，利用这一系统可以将你感兴趣 的DNA序列与基因组中的序列信息及基因 产物的序列加以比较； Cytogenetics，细胞遗传学数据库，提 供序列标签克隆和染色体原位杂交数据； dbSNP，单核苷酸多态性及其它遗传变 异的数据库； e-