五年制分子生物学ppt课件

史上最复杂串息 周 次 12 期39.29 星 期 一二 三 四 五 六日一二三 四 五 六 日 上 午 中秋节 五 理 五 理 下 午 五 理 五 理 五 理 五 理 五 理 五 理 自我介绍 万 敏单向收费） QQ:1040163877 第四篇 分子医学专题 分子医学时代：分子生物学将现代医学带入分子时代 生物化学遗传学 分子生物学 第四篇 分子医学专题 分子医学时代：分子生物学将现代医学带入分子时代 里程碑式成就： 1956年：镰状细胞贫血病因是一个氨基酸发生了改变 1976年：src癌基因（导致鸡肉瘤Sarcoma）的发现 1978年：对镰状细胞贫血进行了产前基因诊断 1982年：基因重组产品人胰岛素问世 1990年：第一例基因治疗实施 镰状细胞贫血病因是一个氨基酸发生了改变 珠蛋白的第6位谷氨酸变为缬氨酸 第四篇 分子医学专题 分子医学时代：分子生物学将现代医学带入分子时代 里程碑式成就： 1956年：镰状细胞贫血病因是一个氨基酸发生了改变 1976年：src癌基因（导致鸡肉瘤Sarcoma）的发现 1978年：对镰状细胞贫血进行了产前基因诊断 1982年：基因重组产品人胰岛素问世 1990年：第一例基因治疗实施 第四篇 分子医学专题 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 第二节 PCR技术的原理与应用 第三节 基因文库 第四节 生物芯片技术 第五节 生物大分子相互作用研究技术 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （一）印迹技术 （二）探针技术 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交 （一）印迹技术 （二）探针技术 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交（提问） 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交： 具有互补序列的两条核酸单链 ，在一定条 件下，按碱基互补配对的原则形成双链的过程 。 磷酸 O P -O O- O CH2 5 O OHH 4 32 1 碱基 脱氧核糖 脱氧核糖核苷酸的结构示意图： H2O H O P O O O O P O O O O P O O O CH2 5 O H 4 32 1 OH OH CH2 5 O H 4 32 1 O P O O O 5 O P O O O 5 CH2 5 O H 4 32 1 O P O O O CH2 5 O H 4 32 1 OH 3,5-磷酸二酯键 脱氧核糖核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接起 来，形成多核苷酸长链。 *15 DNA：基本结构 由四种脱氧核糖核苷酸(dNTP) 通过3-5磷酸 二酯键连接而成的长链大分子。 A-G-C-T- A G C T 磷酸二酯键 脱氧腺嘌呤核苷酸 (dAMP) 脱氧鸟嘌呤核苷酸 (dGMP) 脱氧胞嘧啶核苷酸 (dCMP) 脱氧胸腺嘧啶核苷酸 (dTMP) DNA：双螺旋结构 DNA分子是由两条相互平行的脱氧 核糖核苷酸长链盘绕而成 DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连 接排在外侧，构成基本骨架，碱基 排列在内侧。 两条链上的碱基通过氢键相结合， 形成碱基对（碱基互补配对原则） 。 A TG C 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交： 具有互补序列的两条核酸单链 ，在一定条 件下，按碱基互补配对的原则形成双链的过程 。 DNA RNA RNA DNA （复）分子杂交： 具有互补序列的两条核酸单链在一定条件 下按碱基互补配对的原则形成双链的过程。 （复）分子杂交：DNA变性与复性 DNA变性：加热、强碱和有机溶剂作用下 氢键断裂，两条单链分开 磷酸二酯键不受影响，碱基排列顺序保持不变 DNA的复性：去除变性条件 单链DNA在溶液中随机碰撞 互补单链通过碱基配对形成氢键 两条重新缠绕在一起的互补链不一定是原来的两条链 （复）分子杂交：DNA变性与复性 具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按碱基 互补配对的原则形成双链的过程。 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交 （一）印迹技术： 将样品转移到固相载体上，再利用相应的 检测反应来检测样品的一种方法。 Edwin Mellor Southern 埃德温 迈勒 萨瑟恩 1975年，英国人Southern建 立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（ NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检 测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。 人们用类似的方法，对RNA和 蛋白质进行印迹分析，对RNA的印 迹分析称为Northern印迹法，对 单向电泳后的蛋白质分子的印迹 分析称为Western印迹法，对双向 电泳后蛋白质分子的印迹分析称 为Eastern印迹法。 （一）印迹技术 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交 （一）印迹技术:毛细管虹吸法 （一）印迹技术:毛细管虹吸法 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （一）印迹技术 电转移印迹技术 真空吸引转移印迹技术 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交 （一）印迹技术:转膜技术 （二）探针技术 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子 放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要 在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关 系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链。 其中一条单链由于被标记上可检测的信号而 称为探针。 将已知序列的核酸片段 (单链RNA或DNA) 进行标记,使之带有特殊可检测信号，作为探 针，与未知DNA或RNA单链进行分子杂交,检测 未知DNA或RNA单链中，是否存在与探针序列 互补的特定序列。 （二）探针技术 Detect Hybrids denature Hybridize 2. 加入变性的探针DNA 1. 变性 3. 杂交 4. 检测杂交体 （二）探针技术 1、探针类型 DNA 探针：外显子区 cDNA 探针：特异性高 RNA 探针：特异性高，本底低 寡核苷酸探针：人工合成，检测突变 2、探针标记 同位素标记： 32P， 35S，3H 非同位素标记：生物素、地高辛、荧光素 （二）探针技术 2、探针标记 （1）DNA酶I：随机切割DNA单链 （2）DNA聚合酶I： 1）5 3 外切酶 2）5 3聚合酶 2、探针标记 3 5 3 3 5 5 5 DNA Pol I 3XdNTPs+3XdNTPs+labled-dATPlabled-dATP DNase I 3 3 5 5 5 3 缺口平移法标记探针：缺口平移法标记探针： DNaseI DNaseI 在在dsDNAdsDNA上切割上切割3 3 -5-5磷酸二酯键。磷酸二酯键。 DNA PolI DNA PolI 延着延着5 5 -3-3 方向切旧链，然后再合成新链。方向切旧链，然后再合成新链。 ds-DNA template Mg 2+ Detect Hybrids denature Hybridize 2. 加入变性的探针DNA 1. 变性 3. 杂交 4. 检测杂交体 （二）探针技术 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交：不同单链形成杂交双链 （一）印迹技术：转膜技术 （二）探针技术：标记已知单链 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 （复）分子杂交：不同单链形成杂交双链 （一）印迹技术：转膜技术 （二）探针技术：标记已知单链 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹 （二）RNA印迹 （三）蛋白质印迹 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹（Southern blotting） Edwin Mellor Southern （一）DNA印迹(Southern blotting) 将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段 转移到一定的固相支持物上，然后与标记的 核酸探针进行杂交的过程。 基本程序： 1、电泳分离DNA片段 2、DNA的转膜 3、DNA与探针杂交 4、检测杂交信号 将内切酶消 化的DNA片 段进行电泳 . 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹（Southern blotting） 胶中的DNA经变性及中和后, 转膜 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹（Southern blotting） 标记的探针与DNA的杂交 检测杂交信号 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹（Southern blotting） 放 射 自 显 影 照 片 （一）DNA印迹 将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段 转移到一定的固相支持物上，然后与标记的 核酸探针进行杂交的过程。 基本程序： 1、电泳分离DNA片段 2、DNA的转膜 3、DNA与探针杂交 4、检测杂交信号 提取基因组DNA 限制性内切酶消化 电泳分离 Southern blot (卫星DNA探针) 身份确认 人类DNA指纹图 亲子鉴定 A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女 。 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹:DNA定性和定量分析 （二）RNA印迹 （三）蛋白质印迹 （二）RNA印迹（Northern blotting） 将电泳分离的待测RNA转移到一定的固 相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂 交的过程。 基本程序： 1、电泳分离RNA 2、RNA的转膜 3、RNA与探针杂交 4、检测杂交信号 其序列与DNA的模板链互补。 是蛋白质生物合成的模板蛋白质生物合成的模板， 因此，mRNA的碱基序列决定 蛋白质的氨基酸顺序。 mRNA中的三个碱基为一个密 码子，负责编码一个氨基酸 。 RNA NorthernNorthern印迹特点印迹特点 ： 1.1.检测检测RNARNA 2.2.电泳前无需酶切电泳前无需酶切 3.3.电泳后无需变性电泳后无需变性 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹:DNA定性和定量分析 （二）RNA印迹:RNA定性和定量分析 （三）蛋白质印迹 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 二、印迹技术的类别及应用 （三）蛋白质印迹： 在电场的作用下将电泳分离的蛋白质从凝 胶转移至一种固相支持物，然后用这种蛋白质 的特异抗体来检测。 （三）蛋白质印迹 ： 在电场的作用 下将电泳分离的蛋 白质从凝胶转移至 一种固相支持物， 然后用这种蛋白质 的特异抗体来检测 。 （三）蛋白质印迹 基本程序： 1、电泳分离蛋白质 2、蛋白质的转膜 3、蛋白与抗体结合 4、检测抗体信号 1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳： q不连续的电泳缓冲体系。 qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋 白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质 分子量的大小。 （三）蛋白质印迹 （三）蛋白质印迹： 2、电转移 （三）蛋白质印迹： 3、抗原抗体反应 （三）蛋白质印迹 ： 4、显色反应 化学显色法 : 同位素法 : 化学发光法 : 荧光底物法： 第二十章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 分子杂交与印迹技术 一、分子杂交和印迹技术的原理 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA