fas诱导细胞凋亡与糖尿病心肌病变的研究(1)

FasFas 诱导细胞凋亡与糖尿病心肌病变的诱导细胞凋亡与糖尿病心肌病变的 研究研究(1)(1) 【摘要】目的：探讨 Fas 诱导细胞凋亡对糖尿病心肌 病变的影响，为进一步研究糖尿病发病机制提供实验依据。 方法：按体重将动物随机分为正常对照组和实验组,各组大 鼠禁食 12h 后,实验组大鼠以 60mg/kg 的剂量一次性腹腔注 射 STZ 溶液,正常对照组大鼠注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。 观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。1 周后,采尾血测 血糖,以血糖浓度/L,饮水量40ml/d,尿糖强阳性的大鼠作 为糖尿病大鼠。6 周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进 行免疫组织化学实验观察。利用 HPIASXX 图像分析系统 测定 Fas 在以上两组中表达的平均光密度和平均阳性面积 率。结果：糖尿病对照组心肌细胞胞浆内可见极少量棕黄 色颗粒，Fas 表达弱；实验组心肌细胞胞浆内可见较多棕黄 色颗粒，Fas 呈强阳性表达。图像分析结果显示对照组与实 验组之间 Fas 的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性 意义。结论：糖尿病心肌病变过程中存在心肌细胞凋亡,心 肌细胞凋亡可能是导致糖尿病心脏功能障碍的重要原因之 一。 【关键词】糖尿病;心肌;Fas;大鼠 糖尿病是威胁人类健康的重大疾病之一，并呈持续增 长，对人们的身体健康造成极大威胁。我国 2 型糖尿病发 病率的上升速度远远快于世界水平，预计 XX 年我国 2 型糖 尿病发病率将达到 12%。大量临床资料和流行病调查均显示 心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病心肌病 的概念于 1974 年 Hamby1等首次提出，经过多年研究之 后，学者们证实，糖尿病心肌病系由代谢紊乱触发，引起 心肌学改变，从而出现亚临床的心功能异常，而后进展为 心肌小血管病变、微循环障碍及心脏自主神经病变，导致 心功能不全2 ，是一种独立的疾病。细胞调亡是细胞主 动发生的自然死亡过程,是生物体借以拮抗有丝分裂所致的 细胞增殖、调节细胞群体数目相对恒定的重要方式。调亡 就象秋天枯萎的树叶一样慢慢地、悄无声息地从树干上飘 零下来。细胞凋亡不仅是认识细胞死亡过程的基础,而且对 胚胎发育、造血、免疫乃至肿瘤的研究都有极为重要的意 义。细胞凋亡是细胞内死亡程序活化而导致的细胞自杀过 程。凋亡大多发生在生理情况下,某些病理性刺激也可诱导 细胞凋亡。Fas 又称作 APO1，属于肿瘤坏死因子受体 （tumornecrosisfactorreceptor,TNFR）和神经生长因子 受体（nervegrowthfactorreceptor,NGFR）家族成员。它 是广泛分布于多种细胞表面的一种跨膜糖蛋，如活化的 L、J 淋巴细胞、单核细胞、维细胞、内皮细胞、肝胆细胞、 肾小球系细胞及子宫内膜细胞等。研究表明 Fas 还可以通 过神经鞘磷脂（sphingomyeline,SM）途径介导细胞凋亡信 号的传导，即 Fas 被激活后，胞内鞘磷脂酶活化，水解 SM 产生神经酰胺（ceramide,CM） ，CM 作为第二信使，传递凋 亡信号3 。目前关于糖尿病心肌病变过程中心肌细胞凋 亡作用的研究报道甚少。本实验以链脲佐菌素建立糖尿病 大鼠模型,观察糖尿病大鼠心肌细胞凋亡,从而揭示心肌细 胞凋亡在糖尿病心肌病变发生发展中的作用。 1 材料与方法 11 材料 111 实验动物昆明种 SD 大鼠 30 只,雄性,体重 180200g,武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养 1 周后进行实验。 12 方法 121 动物模型建立及分组按体重随机分为正常对照 组和实验组,各组大鼠禁食 12h 后,实验组大鼠以 60mg/kg 的剂量一次性腹腔注射 STZ 溶液,正常对照组大鼠注射等体 积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等 情况。注射后第 2、7d 采尾血测血糖,以后每 2 周测一次血 糖、尿糖,将血糖浓度16.7mmol/L,饮水量40ml/d,尿糖强 阳性的大鼠定为糖尿病模型。6 周后将各组大鼠处死,切取 心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。 122 主要试剂浓缩型鼠抗人 Fas 单克隆抗体（美国 SantaCruz 公司） ；超敏即用型 SP 通用型免疫组织化学试 剂盒（福州迈新生物有限公司） ；显色试盒及多聚赖氨酸 （北京中山生物技术有限公司） 。 123 主要仪器 YWY781 型医用微波仪；家用高压锅。 124 免疫组织化学 SP 法检测 Fas 相关抗原主要 步骤：组织切片 5m，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；3% 过氧化氢 37孵育 10min 以抑制内源性过氧化物酶活性， PBS 洗 45min；Fas 采用微波抗原修复（3 档，10min） ， PBS 洗 45min；正常羊血清 37孵育 10min 以减少非特 异性反应；一抗（Fas，1:100)37孵育 1h，PBS 洗 45min；生物素标记的二抗，37孵育 10min，PBS 洗 45min；链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物 37 孵育 10min，PBS 洗 45min；DAB 显色液显色，自来水 冲洗终止反应；苏木精复染，脱水，透明，封片。用 PBS 代替一抗作为阴性对照。 13 免疫组织化学结果判断 Fas 以胞浆出现棕黄色颗 粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无 棕黄色反应物。采用 HPIASXX 高清晰度彩色病理图文报 告管理系统（同济千屏影像公司）对 Fas 的表达进行定量 分析，每张切片随机选取 5 个完整而不重叠的高倍镜视野 （400） ，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性 反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率（阳性面积 率单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面 积100） 。以每例 5 个视野的平均光密度、阳性面积率 的平均值作为该例的测量值。 14 统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的 平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和 SNKq 检验， 检验水准 为。 2 结果 对照组心肌细胞胞浆内极少棕黄色颗粒，Fas 表达弱； 糖尿病组心肌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒，Fas 呈强阳 性表达。图像分析结果显示：对照组和糖尿病组平均光密 度分别为、，对照组和糖尿病组阳