上海生科院实验生物学酶工程20121129ppt课件

酶工程 杨 晟 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 中国科学院合成生物学重点实验室 中国科学院上海生命科学研究院工业生物技术研究中心 中国科学院上海生命科学研究院研究生课程 实验生物学 2012年11月29日 上海生科院实验生物学课程 酶工程 个人简历 n19911995 浙江大学化工系本科生 n19952000 上海生物化学研究所(酶工程组) 研究生 n20002002 生化细胞所(酶工程组) 助理研究员 n20022006 植生生态所 (微生物代谢调控与酶工程组)副研究员 n2006 植生生态所/工业生物技术研究中心 研究员 上海生科院湖州工业生物技术中心 n2008 中科院合成生物学重点实验室研究员 上海工业生物技术研发中心 研究方向： 发展和运用改造蛋白质、细胞代谢与运输途径和基因组 的新方法，开发和优化基于重组DNA的生物产品和制备 过程。 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶工程定义 将酶所具有的生物催化功能,借助工程手段应用于社 会生活的一门科学技术； 利用酶催化的作用,在一定的生物反应器中,将相应 的原料转化为所需要的产品； 利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当 的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊 目的的一门技术科学。(大唐搜索) 上海生科院实验生物学课程 酶工程 “工程”的定义(Webster) “酶工程”的定义 运用酶学知识结合数学和/或其他系统性知识设计有 实用价值的新酶 (生物催化剂，固定化生物催化剂，生物催化反应体 系, 生物催化反应器。) 超越常规实践技巧运用数学或系统性知识设 计有实用价值的复杂体系 上海生科院实验生物学课程 酶工程 教学目标 在具备生物化学/酶学/微生物学等基本知 识的前提下 了解蛋白质重组表达和改造的基本概念， 方法 在文献调研基础上能独立设计蛋白质重组 表达和改造的实验技术路线。 上海生科院实验生物学课程 酶工程 课程基础 n张惠展重组DNA技术与基因工程 n钟扬 基因组学与生物信息学 n丁建平蛋白质结构技术 生物化学(氨基酸，酶学) 蛋白质化学(蛋白质纯化，蛋白质结构) 微生物学 上海生科院实验生物学课程 酶工程 参考资料 nColin Ratledge Basic Biotechnology 2001 nMartin Chaplin Enzyme Technology1990 http:/www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.html nAndreas S. Bommarius Biocatalysis2004 上海生科院实验生物学课程 酶工程 内容安排 (约45分钟休息10分钟) 复习与简介 复习酶的基本概念 酶工程发展概况 基础 学习酶的生产方法 重组表达 酶的分离提取 酶的固定化技术 酶反应器 提高 酶的改造提问？ 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶学知识复习 王镜岩 生物化学 第3版 第8章 酶通论 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶是什么？ n有催化活力的蛋白质 蛋白质一般不稳定, 反应条件温和 催化能力高效性,专一性 化学选择性，区域选择性，立体选择性 The Mechanism of Enzyme Catalysis 酶与过渡态中间物的紧密结合，稳定了底物的过渡态结构，从而降低了底物 形成其过渡态所需克服的能垒，提高了反应的速度 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶学相关定义 nU 酶活力单位 1分钟内转化1umol底物所需酶量 nVmax 最大反应速度 酶分子所有的活性部位都被底物占据时的反应速度 nKm 米氏常数 反应速度达到Vmax一半时的底物浓度 nKcat 酶转换数 以每分钟每酶分子形成的产物的分子数表示的Vmax n米氏方程 上海生科院实验生物学课程 酶工程 How An Enzymes EC Number Is Assigned First E.C. Number Second E.C. Number Means: Third E.C. Number Means: 1: Oxidoreductases Indicates the H+ or e donor that undergoes oxidation Indicates the acceptor 2: Transferases Indicates the group transferred Further information on the group transferred 3: Hydrolases Indicates the nature of the bond hydrolysed Indicates the nature of the substrate 4: Lyases Indicates the nature of the broken bond Further information on the eliminated group 5: Isomerases Indicates the type of isomerism Indicates the type of substrates 6: Ligases Indicates the type of bond formed Only used in CN ligases In all cases, the fourth EC number is specific to a particular reaction. 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶的命名 EC编号规则 第一位第二位第三位 氧化还原酶 氧化反应的供体是 H+ 还是 e 受体类型 转移酶发生转移的基团种类发生转移的基团细分 水解酶 水解的化学键种类天然底物类型 裂合酶断裂的化学键种类脱去的基团种类 异构酶同分异构体的种类 底物类型 连接酶 形成的化学键种类仅限于CN 化学键连接 E.C.number 第四位取决于具体的反应过程 国际酶学委员会 Enzyme Commission (EC) 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶的命名 氧、转、水、裂、异、合(连) 1.Oxidoreductases 氧化还原酶 2.Transferases 转移酶 3.Hydrolases 水解酶 4.Lyases 裂合酶 5.Isomerases 异构酶 6.Ligases 连接酶 ATP水解偶联 国际酶学委员会 Enzyme Commission (EC) 上海生科院实验生物学课程 酶工程 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶知识复习小结 n酶是有催化活力的蛋白质 n酶与过渡态中间物的紧密结合，稳定了底物 的过渡态结构，从而降低了底物形成其过渡 态所需克服的能垒，提高了反应的速度 n酶分为6大类，酶的命名可以在 上查询 上海生科院实验生物学课程 酶工程 基础篇 学习酶的生产方法 重组表达系统 酶的分离提取 酶的固定化技术 酶反应器 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶工程的历史 酶的历史 在麦芽中发现淀粉酶18 33 在胃中发现消化酶胃蛋白酶18 36 18 73 从小牛胃提取凝乳酶用于制酪 Enzyme定名意为“在酵母中“ 18 78 钥匙锁理论提出18 94 以米曲霉生产淀粉酶作为消化酶 中间产物学说米氏方程19 13 获得脲酶结晶酶是蛋白质19 26 19 49 液体深层发酵生产细菌淀粉酶 固定化酶19 53 操纵子学说酶生物合成机制19 60 19 69 固定化氨基酰化酶生产L氨基酸 19 73 基因工程技术 19 78 定点突变技术 19 84 TyrRS的蛋白质工程 19 86 重组酶生产 19 93 定向进化 19 94 DNA shuffling 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶的生产 上海生科院实验生物学课程 酶工程 植物来源 来源酶应用 刀豆脲酶诊断 木瓜木瓜蛋白酶烘焙，制酪，制革， 嫩肉粉，啤酒澄清 无花果无花果蛋白酶嫩肉粉 菠萝菠萝蛋白酶烘焙 辣根辣根过氧化物酶诊断 柠檬糖苷酶科研 小麦酯酶酯水解与合成 大麦淀粉酶烘焙，麦芽糖浆 大豆淀粉酶烘焙，麦芽糖浆 上海生科院实验生物学课程 酶工程 动物来源的工业用酶 来源酶工业用途 肝过氧化氢酶食品 胰腺胰凝乳蛋白酶制革 胰腺脂肪酶食品 皱胃凝乳酶制酪 胰腺胰蛋白酶皮革 上海生科院实验生物学课程 酶工程 微生物来源的工业用酶 EnzymeEC numberSourceIntra/extracellular Scale of productionIndustrial use Bacterial enzymes aAmylaseBacillusE+Starch bAmylaseBacillusE+Starch AsparaginaseEscherichia coliIHealth Glucose isomeraseBacillusI+Fructose syrup Penicillin amidase1BacillusEPharmaceutical Protease4BacillusE+Detergent Pullulanase1KlebsiellaEStarch Fungal enzymes aAmylaseAspergillusE+Baking Aminoacylase4AspergillusIPharmaceutical GlucoamylaseAspergillusE+Starch CatalaseAspergillusIFood CellulaseTrichodermaEWaste Dextranase1PenicilliumEFood Glucose oxidaseAspergillusIFood Lactase3AspergillusEDairy LipaseRhizopusEFood RennetMucor mieheiE+Cheese Pectinase5AspergillusE+Drinks Pectin lyase0AspergillusEDrinks ProteaseAspergillusE+Baking Raffinase2MortierellaIFood Yeast enzymes Invertase6SaccharomycesI/E Confectionery Lactase3KluyveromycesI/EDairy LipaseCandidaEFood Raffinase2SaccharomycesIFood 上海生科院实验生物学课程 酶工程 微生物酶生产率提高的手段 n菌种选育 诱变育种 n发酵工艺优化发酵工程 n重组表达 基因工程 在张惠展教授课程基础上 进一步提高 上海生科院实验生物学课程 酶工程 分子生物学知识复习 n理论 中心法则 操纵子理论 n工具 PCR 限制性内切酶 连接酶 上海生科院实验生物学课程 酶工程 分子生物学知识复习 中心法则 操纵子理论 重组蛋白质表达载体必需元件 选择标记 启动子 核糖体结合位点 转录终止信号 复制起点 (自主复制质粒必需) 编码(c)DNA 上海生科院实验生物学课程 酶工程 重组蛋白质的表达 n获取基因 n选择表达系统 n选择表达载体 n基因克隆至表达载体 n转化至表达宿主细胞 n筛选转化子 n生长表达蛋白质 上海生科院实验生物学课程 酶工程 克隆酶基因 n已知序列 1.从文库中亚克隆 2.(RT)PCR直接扩增 3.化学合成 n未知序列 1.联配同类酶的已发表序列，根据保守氨基酸序列设计简并引物扩 增基因 2.纯化酶，测定部分氨基酸序列，设计简并引物扩增基因 3.以方法1，2设计DNA探针进行southern杂交和/或菌落杂交，筛选 文库 4.建立表达文库 利用能表达酶活性的宿主菌的表型不同进行筛选 纯化酶，制备抗体，用免疫印迹的方法筛选阳性克隆 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Model PCR products showing combinations of protein expression motifs relative to the cloning sites used to insert the gene into an expression vector. a)PCR product encoding a protein with a C-terminal epitope (for antibody detection or purification) or tag (for purification). b)PCR product encoding a protein with an upstream protease site (for removal of an N-terminal tag derived from the expression vector) and a C-terminal epitope or tag. c)PCR product encoding a protein secretion signal and a C-terminal epitope or tag. d)PCR product encoding a protein without a stop codon, so that a variety of C-terminal tags can be added by the expression vector. e)PCR product encoding a protein that requires the expression vector to supply both the translation start and stop (i.e. the protein will have extra amino acids from the expression vector at both the N and C termini). Kz, Kozak; SD, ShineDalgarno sequence. Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:359366 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Typical combinations of protein expression elements in expression vectors. All expression vectors supply a promoter upstream of the N-terminal cloning site, which may or may not be controllable. The N- and C-terminal cloning sites can be a single site. (a) Provides a C-terminal epitope tag. (b) Provides an N-terminal translation start and affinity tag. (c) A vector similar to (b) but with the presence of a toxic gene between the cloning sites for selection against empty vector molecules (i.e. vectors that do not contain the gene of interest). (d) Vector containing a C-terminal fluorescent protein tag (e.g. green fluorescent protein) for making fluorescent fusion proteins. drugR, drug resistance gene; ori, origin of replication. Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:359366 上海生科院实验生物学课程 酶工程 重组表达系统 nE. coli (T7, tac/trc, T5, ara ) nBacillus nPichia pastoris (aox1, gap) nAspergillus niger n nBaculovirus nCHO n体外翻译系统 n蛋白质产量 n翻译后修饰加工， 折叠 (二硫键)和糖基化 n蛋白质纯化 n经济性 n可用设备 表达系统选择 考虑因素: 上海生科院实验生物学课程 酶工程 首选重组蛋白质表达系统大肠杆菌 生长最快 实验操作最方便 可高密度发酵 遗传背景清楚 容易获得各种载体和宿主 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Factors influencing recombinant protein production in E.coli Mergulhao etal Journal Microbiol Biotechnology 2004 上海生科院实验生物学课程 酶工程 E.coli表达系统可用启动子列表 上海生科院实验生物学课程 酶工程 常用大肠杆菌表达系统 utrc启动子 pTrcHIS(Invitrogen) pKK223, pTrc99(Pharmacia) uT7启动子 pET(Novagen) pRSET, pCRT7(Invitrogen) uaraBAD启动子 pBAD(Invitrogen) uT5启动子 pQE系列(Qiagen) 上海生科院实验生物学课程 酶工程 首选中的首选- pET系统 上海生科院实验生物学课程 酶工程 T7表达系统工作原理 上海生科院实验生物学课程 酶工程 pET表达流程 上海生科院实验生物学课程 酶工程 pET Vector Characteristics Table 上海生科院实验生物学课程 酶工程 以pET24开始 上海生科院实验生物学课程 酶工程 利用增溶标签 进行蛋白质 重组表达和纯化 上海生科院实验生物学课程 酶工程 MBP作为增溶标签的优越性 1.Kataeva I, Chang J, Xu H, Luan CH, Zhou J, Uversky VN, Lin D, Horanyi P, Liu ZJ, Ljungdahl LG et al.: Improving solubility of Shewanella oneidensis MR1 and Clostridium thermocellum JW20 proteins expressed into Escherichia coli. J Proteome Res 2005, 4:19421951. Results from a highthroughput structural genomics project comparing MBP, GST, NusA and His6 solubility tags. The study of 152 proteins from mesophilic and thermophilic bacteria suggested that MBP was the best tag for making soluble fusions, and also showed the positive effect of lowered expression temperature on solubility. The authors discuss algorithmsfor predicting the solubility of proteins. 2.Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, McCafferty J: Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC Biotechnol 2004, 4:32. The authors chose 30 diverse human genes and compared expression with six different N terminal and eight different Cterminal solubility fusions. Results showed that MBP and Trx were the best tags and that MBP also worked as a Cterminal fusion, contrary to previous results. The authors nicely highlight the protein features that seem to correlate with solubility: molecular weight, number of hydrophobic residues, and low complexity regions. 3.Busso D, DelagoutteBusso B, Moras D: Construction of a set gatewaybased destination vectors for highthroughput cloning and expression screening in Escherichia coli. Anal Biochem 2005, 343:313321. This article describes the construction of 10 recombinational cloning vectors and their use for comparing expression and solubility of a small number of genes from Bacillus subtilis. Methods for generating and testing new vectors are clearly discussed and the results of the solubility analysis suggest that MBP and NusA are much better than GST or Trx in the case of these partner proteins. 上海生科院实验生物学课程 酶工程 大肠杆菌表达实验策略 n首选pET系统, 如pET24/BL21(DE3) n1mM IPTG诱导 n无表达?融合表达，T5, pBAD系统 n包涵体？ 1.IPTG浓度 (1uM, 10uM, 100uM)，降温低至18 2.LBTB培养基 3.与MBP融合表达 4.共表达分子伴侣改善可溶性 5.定向进化 上海生科院实验生物学课程 酶工程 重组表达制备有功能的蛋白质 1.参考文献报道 2.改变诱导条件（温度，诱导剂的量） 3.增溶标签（MBP) 4.改换表达载体，如不同的启动子 5.分子伴侣 6.根据基因来源，考虑所使用的表达宿主及载体 7.包涵体纯化 8.定向进化 上海生科院实验生物学课程 酶工程 大肠杆菌表达系统小结 n优点 最方便，最有效 n缺点 分泌表达能力弱 二硫键形成困难 无翻译后修饰 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酵母表达系统 (Invitrogen) 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Pichia Expression Kits 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Pichia pastoris 简介 Budding Pichia pastoris 醇氧化酶的催化场所 过氧化物酶体可占到细胞 总体积的80% 无快速碳源 而含有甲醇 ，产生醇氧 化酶能占到 细胞总蛋白 的30% 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Pichia pastoris表达体系的优点 n外源基因稳定整合 n醇氧化酶基因的启动子强，且可 用甲醇严格调控表达 n重组蛋白质可以以胞内或胞 外形式表达 n含有真核表达系统共有的翻译后 修饰功能 n有商品化宿主/载体，操作简便 n放大方便，发酵密度极高 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Typical Pichia pastoris expression vector n5AOX1: AOX1 5 region including promoter nMCS: Multiple cloning site nTT: AOX1 terminator nHIS4: histidinol dehydrogenase n3AOX1: AOX1 3 region nAmp: Ampicillin-resistance marker nfi ori: f1 bacteriophage origin. nSig: signal sequences nSacI, SalI, StuI and BglII cutting site are used to linearize the vector before transformation 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Promotor naox1启动子： 强启动子 甲醇诱导 葡萄糖，甘油等快速碳源阻遏 表达调控技术较成熟 ngap启动子 组成型强启动子 葡萄糖 强启动子 甘油中等强启动子 甲醇弱启动子 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Pichia pastoris strains StrainGenotypeApplication X33Wild-typeSelection of Zeocin-resistant expression vectors GS115his4Selection of HIS4 expression vectors KM71his4, aox1:ARG4;arg4 Selection of HIS4 expression vectors to generate strains with MutS phenotype KM71Haox1:ARG4;arg4Selection of Zeocin-resistant expression vectors to generate strains with MutS phenotype SMD1165his4prB1Selection of HIS4 expression vectors to generate strains without protein B activity SMD1168his4pep4Selection of HIS4 expression vectors to generate strains without protease A activity SMD1163his4pep4prB1Selection of HIS4 expression vectors to generate strains without protease A and protease B activity SMD1168Hpep4Selection of Zeocin-resistant expression vectors to generate strains without protease A 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Pichia pastoris表达实验流程 电转化GS115 初筛(50ml离心管) 有表达 复筛(250ml摇瓶)发酵罐 无表达 以pPIC3.5K尝试胞内表达 外源基因克隆到pPIC9的alpha信号肽序列之后 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Pichia pastoris表达系统小结 n优点 有商品化宿主/载体，操作简便 真核表达系统 重组蛋白质可以以胞内或胞外形式表达 高密度发酵方便 有翻译后加工 n缺点 翻译后加工形式有独特性 上海生科院实验生物学课程 酶工程 重组酶表达小结 首选文献报道表达系统 次选大肠杆菌 大肠杆菌中无活性选用酵母系统 根据基因来源定表达系统 芽孢杆菌 放线菌 酵母 霉菌 基因加亲和标签便于纯化 酶制备流程图 上海生科院实验生物学课程 酶工程 细胞破碎手段 n超声波 目前只用于实验室或小规模 n高压匀浆机(high pressure homogenizer) n珠磨机(bead mills) nfreezepresses 小规模 n渗透压冲击法 n自发分解 (yeast, Bacillus) n酶裂解 (溶菌酶，Lyticase, Zymolase,蜗牛酶) 上海生科院实验生物学课程 酶工程 细胞破碎需考虑因素 Heat All mechanical methods require a large input of energy, generating heat. Cooling is essential for most enzymes. The presence of substrates, substrate analogues or polyols may also help stabilise the enzyme. Shear Shear forces are needed to disrupt cells and may damage enzymes, particularly in the presence of heavy metal ions and/or an air interface. Proteases Disruption of cells will inevitably release degradative enzymes which may cause serious loss of enzyme activity. Such action may be minimised by increased speed of processing with as much cooling as possible. This may be improved by the presence of an excess of alternative substrates (e.g. inexpensive protein) or inhibitors in the extraction medium. pH Buffered solutions may be necessary. The presence of substrates, substrate analogues or polyols may also help stabilise the enzyme. Chemical Some enzymes may suffer conformational changes in the presence of detergent and/or solvents. Polyphenolics derived from plants are potent inhibitors of enzymes. This problem may be overcome by the use of adsorbents, such as polyvinylpyrrolidone, and by the use of ascorbic acid to reduce polyphenol oxidase action. Oxidation Reducing agents (e.g. ascorbic acid, mercaptoethanol and dithiothreitol) may be necessary. Foaming The gasliquid phase interfaces present in foams may disrupt enzyme conformation. Heavymetal toxicity Heavy metal ions (e.g. iron, copper and nickel) may be introduced by leaching from the homogenisation apparatus. Enzymes may be protected from irreversible inactivation by the use of chelating reagents, such as EDTA. 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Manton-Gaulin匀浆机 上海生科院实验生物学课程 酶工程 从澄清液中提取酶 n超滤 n硫酸铵沉淀 n有机溶剂沉淀 n热处理 浓缩 去不耐热的杂蛋白 上海生科院实验生物学课程 酶工程 胞内酶纯化去除核酸 n非特异性硫酸铵沉淀 n特异性带正电荷材料 (与核酸带负电的磷酸基团作用形 成复合物) 聚乙烯亚胺，阴离子洗涤剂十六烷 基三乙基溴化铵，硫酸链霉素，硫 酸鱼精蛋白 牛胰核酸酶 上海生科院实验生物学课程 酶工程 色谱 （层析） n离子交换色谱 吸附色谱 n亲和色谱 疏水色谱 n凝胶排阻色谱 （分子筛） 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶制剂 n使用添加剂 n共价修饰 n固定化 上海生科院实验生物学课程 酶工程 小结 n酶的来源很多，但主要来源于微生物发酵 n酶的工业化应用取决于他们的效果，成本和安全性 n离心一般用于收集含酶固体 过滤更多用于液体酶回收 双水相体系将会在酶回收操作中得到更多应用 n制备工业用酶需尽量压缩分离提取步骤 n酶制剂必须稳定，使用安全 上海生科院实验生物学课程 酶工程 固定化酶优点 n便于从反应体系中分离 从而易于控制反应时间，减少酶失活 n可反复使用 降低用酶成本 n提高酶稳定性 缺点 传质限制 动力学性质发生变化 固定化增加额外成本 a. 吸附 b. 共价连接 c. 包埋 d. 膜限制 酶的固定化方法 多点作用使酶稳定化 上海生科院实验生物学课程 酶工程 固定化酶方法比较 Characteristics Adsorption Covalent binding Entrapment Membrane confinement Preparation Simple Difficult Difficult Simple Cost Low High Moderate High Binding force VariableStrong Weak Strong Enzyme leakage Yes No Yes No Applicability Wide Selective Wide Very wide Running Problems High Low High High Matrix effects Yes Yes Yes No Large diffusional barriers No No Yes Yes Microbial protection No No Yes Yes 上海生科院实验生物学课程 酶工程 固定化载体 Eupergit C Sepabeads series 上海生科院实验生物学课程 酶工程 新型固定化方法无载体固定化 The different approaches to the production of carrier-free immobilised enzymes: (a) crystallization; (b) aggregation; (c) spray-drying; (d) direct cross-linking. AGG, aggregates; CRY, crystals; SDE, spray-dried enzyme. 上海生科院实验生物学课程 酶工程 固定化酶小结 n酶的固定化使得它们能高效和连续使用 n酶的固定化形式有4种 n酶的固定化影响动力学性质 n酶的固定化一般可提高其使用的经济性 n酶的固定化新技术无载体固定化 酶反应器图解 上海生科院实验生物学课程 酶工程 基础篇小结 n重组微生物是酶的最重要来源 n工业用酶的分离提取对成本敏感 n固定化酶是工业用酶制剂的重要形式 n酶反应器对于发挥酶的催化作用也很重要 提高篇 酶的改造 上海生科院实验生物学课程 酶工程 获得新酶的途径 n自然界中获取 n有理设计新酶 n随机方法筛选新酶 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶的设计方法 无理设计 天然设计 有理设计 上海生科院实验生物学课程 酶工程 基于功能-生物多样性与新酶的发现 n嗜热菌（Thermophiles) n嗜冷菌（Phyphophiles) n嗜酸菌（Acidophiles) n嗜碱菌（Alkaliphiles) n嗜盐菌（Halophiles) n嗜压菌（Barophiles) 极端微生物的特殊生长环境及代谢产物，使 酶在“恶劣”环境下能够发挥高效催化作用。 上海生科院实验生物学课程 酶工程 基于序列- 目前已经有无数的基因组被测序 /sites/genome S I Distribution for penicillin G acylase PGA precursor structure 上海生科院实验生物学课程 酶工程 天然酶 化学 - 转化天然底物 物理 - 耐受差 生物 - 代谢调控和高转换数 环境不同 要求不同 n自然进化中 天然酶的结构功能对应于其活细胞的生 理功能而进化的 n天然酶往往不适用于生物技术应用 上海生科院实验生物学课程 酶工程 改造目的 高专一性 只催化所需反应 减少甚至没有副产物 高活性 高生产率 不易受抑制 高稳定性 存放时间长 操作稳定性高 生物催化剂应用依赖于天然酶改造或重新设计方法 上海生科院实验生物学课程 酶工程 酶的改造 n蛋白质工程理性设计 通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究获取关于 蛋白质物理、化学等方面的信息，在此基础上对编码该蛋 白的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段 将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。 基因工程，结构生物学和生物信息学 n化学修饰 n固定化 n诱变筛选无理设计 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Timeline | 20 years of protein engineering James A. Brannigan and Anthony J. Wilkinson. Protein engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2002, 3, 964-70 CDR, complementarity-determining regions: TyrRS, tyrosyl-tRNA synthetase 上海生科院实验生物学课程 酶工程 分子生物学知识复习 中心法则 蛋白质功能f(蛋白质序列) 改变序列影响蛋白质功能 (c)DNA序列蛋白质序列立体结构功能 上海生科院实验生物学课程 酶工程 蛋白质序列空间 a表示最小蛋白质的氨基酸残基数，b表示最大蛋白质的氨基酸残基数。 n个氨基酸残基组成的线性长链的序列空间为20n 所有蛋白质都可以表示为这个b维空间的唯一一点，比如枯草芽孢杆菌蛋 白酶 BPN坐标为（A,Q,S,V,P,Y,G,V,S,Q,I,K,A, A,Q,0,0,0,0）。 小至100个氨基酸残基组成的酶的序列空间也大至20100 序列空间蛋白质特性 序列空间距离近蛋白质性质接近 上海生科院实验生物学课程 酶工程 PAM250氨基酸相对突变率矩阵 和 基本氨基酸性质关系venn图 上海生科院实验生物学课程 酶工程 有理设计 根据详尽的结构功能关系知识 结构 一级结构氨基酸顺序 二级结构a-螺旋, b-折叠, 转角, 无规卷曲 三级结构3D 折叠 (结晶，NMR) 功能 活性位点氨基酸残基和辅因子 催化机理, 特异性和动力学 调节竞争性抑制和变构控制 怎么获得这些信息？ 上海生科院实验生物学课程 酶工程 经典途径 n纯化目标酶，分析氨基酸序列 n分离基因并重组表达 n结晶目标酶，X射线分析 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Copyright restrictions may apply. Chang, A. et al. Nucl. Acids Res. 2009 37:D588-D592; doi:10.1093/nar/gkn820 Input data and their source databases used for the co-occurence based text-mining approach that generates the BRENDA supplements FRENDA and AMENDA 上海生科院实验生物学课程 酶工程 序列与结构分析 n多重联配序列保守性信息 n结晶/同源模建获得立体结构 n三维结构分析分子图像分析 上海生科院实验生物学课程 酶工程 多重联配 ClustalW 上海生科院实验生物学课程 酶工程 Crystals: 18% PEG6K, 0.1 M Bicine, pH 8.5, 0.01 M CdCl2. Struc