分子生物学技术在中医药ppt课件

分子生物学技术在中医药 研究中的应用 1.临床研究 中国中医科学院广安门医院吴志奎教授通过大量的临 床研究发现，中医补肾生血方药对部分地中海贫血（一种 先天遗传性疾病）患者很有效。 问题：哪些患者有效？怎么起效的？ 从分子遗传的角度研究发现，-地中海贫血是由于基因 缺失所致，因此，患者病情重，中医药疗效差；而-地中 海贫血是由于基因突变所致，其中中医药对杂合子基因突 变型患者效果明显，对纯合子型或异源双重杂合子基因突 变型患者疗效不佳。进一步研究发现，中医药治疗机制并 非改变基因突变型，而是促进珠蛋白mRNA的表达。这从 基因调控水平上为中医药分型治疗提供了依据。 2.基础研究 复旦大学华山医院中西医结合研究所沈自尹院士开展的系 列“肾本质”研究，发现“肾阳虚证”与人体的几大内分泌轴“下丘 脑垂体肾上腺皮质轴（甲状腺轴、性腺轴）”密切相关， 于是将肾阳虚证定位到下丘脑。 问题：下丘脑是如何调控这些内分泌腺的？肾阳虚证有何 特点？ 在对下丘脑的基因表达调控研究方面，主要是应用分子生 物学技术来加以检测。例如，应用RT-PCR技术发现肾阳虚证 与下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）的mRNA 转录受抑有关。 另外，我国现任卫生部长陈竺院士开展的三氧化二砷治疗 急性早幼粒细胞性白血病的研究 3.针推方面的研究 针刺镇痛的机制研究已深入到分子基因水平，研究证明 电针可引起脑内阿片肽基因及其他一些基因表达的变化。韩 济生等用原位杂交和Northern blot观察到，注射吗啡6日内大 鼠脑内中枢八肽胆囊收缩素（CCK）基因转录逐渐加速，揭 示CCK的抗阿片作用是决定针刺镇痛和吗啡镇痛有效性的重 要因素。 4.中药研究 1）用于中药种质鉴定或评价，DNA指纹图谱分析。 2）应用分子生物学技术改良中药品质，提高药品质量， 中药生物工程，我校胡之壁院士领衔的课题组在这方面做了 大量的研究工作。 DNA RNA protein 5 5 1 2 3 4 4 1、转录；2、逆转录；3、翻译；4、调控；5、复制 生物学中心法则图 1中医药对基因组（DNA）作用的研究 人类基因组计划的人类基因测序工作已经完成。一 些实验动物、植物，包括中药植物的测序工作正在展开， 或计划展开。 在中医药研究中常用的研究领域为：中医证与基因 表型的关系（如SNP）、中医药预防基因突变、中药有效成 分相关基因的克隆、中药材的鉴定等。常用的分子生物学 技术有：Southern blot、PCR，以及常用的DNA指纹图谱分 析技术如ISSR（简单重复序列间区，inter-simple sequence reports）、RAPD（随机扩增的多态性，random amplified polymorphic DNA）、RFLP（限制性片段长度多态性RFLP ，Restriction Fragment Length Polymorphism）等。 2中医药对基因转录（mRNA）水平调整作用的研究 （1）中医药对某个已知基因转录（mRNA）水平调 整作用 大量的研究表明，中医药对某一个或一组特定基因 的作用是明确有效的，常用的方法有Northern blot、RTPCR 、实时荧光定量PCR、原位杂交等。 （2）中医药对基因转录组调整作用的研究 由于中医药是多途径、多靶点作用的特点，因此 ，近年来，越来越重视中医药基因转录组调控或中医相 关证候基因转录组表达特征的研究。常用的研究方法有 ：cDNA Array、基因芯片（Micro Array）、DDPCR、 EST检测等，以及RACEPCR、RNA干扰技术等后续研究 工作。 3中医药对蛋白表达水平的调整作用 （1）中医药对某一已知蛋白表达水平的 调整作用 比较常用的方法是ELISA技术、免疫组化 和Western blot等技术。还有单克隆抗体制备技术 。 （2）中医药对蛋白组表达水平的调整作 用 蛋白芯片技术，蛋白双向电泳及其后续的 质谱技术。 4分子生物学中常用的基本技术 （1）基因工程常用技术 （2）细胞培养技术 （3）DNA提取技术 （4）RNA提取技术 （5）蛋白提取技术 （6）分子生物学信息资源的利用 四本课程的教学安排 包括两个方面，而重在基本技术的操作和培训： 1）理论介绍性的：如实时荧光定量RTPCR， western blot；基因芯片（Micro Array）；PCR技术，免疫组 化，以及RNA干扰等技术，。 2）实验操作训练的：如重组质粒、转化宿主细菌 、筛选阳性克隆、扩增细菌、从细菌中制备已扩增了的 DNA、利用限制性内切酶切开重组插入的DNA片段和载体 、电泳分离插入DNA片段和载体、回收插入并放大的DNA 基因片段，以及Northern blot录像。 课次课堂讲授实验见习 第一次 6/14 绪 论；重组质粒的方法与原理;质粒转 化大肠杆菌的方法与原理 重组质粒;质粒转化大肠杆菌 第二次 6/21 阳性单菌落扩增与小量质粒DNA制备 的方法与原理 阳性单菌落扩增与小量质粒DNA制 备 第三次 6/28 酶切重组质粒及电泳分离所插入的 DNA、从凝胶中回收DNA的方法与原 理 酶切重组质粒及电泳分离所插入的 DNA、从凝胶中回收DNA 第四次 7/5 基因芯片、RNAi等分子生物学技术介 绍Northern blot录像 上课时间：第3、4、5、6、7、8、9节课 理论课教室：七号楼207室（7207） 实验课教室：四号楼111室（4111） 五推荐的参考书籍 有关分子生物学方法技术的书籍有许多，以下一些书 籍我们经常参考，因此推荐给读者。 （1）方肇勤主编分子生物学技术在中医药研究中 的应用，上海科学技术出版社，2008年9月，第2版 （2）方肇勤主编中医药研究常用分子生物学技术 ，人民卫生出版社，2008年12月，第1版 （3）黄培堂等译分子克隆实验指南，科学技术 出版社，2002年8月，第3版。 六、考核评分标准 依据：实验态度和动手能力（实验操作水平、实验结 果处理和分析能力）（20%）、实验报告（80%）。 1实验报告（80%） 评分依据主要有： （1）实验方法叙述准确、清楚、完整。 （2）实验结果表达客观、准确。 （3）讨论能够结合相关文献与资料对实验结果综合分析， 要求科学、客观、逻辑。 （4）讨论中对实验过程和实验结果中存在的问题要求进行 正确分析，提出纠正和控制误差的具体措施及其依据。 实验报告的