cd8+t淋巴细胞在慢性支气管炎与肺气肿大鼠肺血管炎症中作用的实验研究(1)

CD8+TCD8+T 淋巴细胞在慢性支气管炎与肺气淋巴细胞在慢性支气管炎与肺气 肿大鼠肺血管炎症中作用的实验研究肿大鼠肺血管炎症中作用的实验研究(1)(1) 【摘要】 目的:探讨 CD8+T 淋巴细胞在慢性支气管炎 （CB）与肺气肿大鼠肺血管炎症中的分布、作用以及红霉 素（EM）对 CD8+T 细胞的影响。方法:将 21 只健康雄性 Wistar 大鼠用完全随机设计随机分成 3 组:A 组（正常对照 组,n=7）,B 组（慢性支气管炎与肺气肿组,n=7）,C 组（红 霉素治疗组,n=7） 。采用 2 次气管内注入脂多糖（LPS）及 烟熏 4 周的混合刺激方法制作 CB 与肺气肿大鼠模型,C 组同 时使用红霉素治疗 4 周。4 周后对大鼠肺脏进行病理形态学 检测。结果:B 组各大鼠 CD8+T 淋巴细胞浸润血管比例增多, 肺腺泡内血管外膜 CD8+T 淋巴细胞浸润增多,与 A 组比较有 统计学意义（P 【关键词】 慢性支气管炎肺气肿肺血 管 CD8+T 淋巴细胞红霉素 我们近期的研究1表明慢性支气管炎 （Cronicbronchitis,CB）与肺气肿大鼠在非低氧血症期已 出现较明显的肺血管重塑,在肺腺泡内各型血管外膜可观察 到大量的炎症细胞浸润,以淋巴细胞为主,本实验在此基础 上进一步观察 T 淋巴细胞亚群在 CB 与肺气肿大鼠肺血管炎 症中的分布特征、与肺血管重建的相关性,并使用红霉素治 疗观察其对气道、肺血管浸润的炎症细胞的干预作用。 1 材料和方法 材料及动物模型的建立 健康雄性 Wistar 大鼠 21 只 （鼠龄 12 周,体质量 200210g）, 购自广西医科大学动 物实验中心。大鼠随机分为 A、B、C3 组,即正常对照组、 CB 与肺气肿组、红霉素治疗组2 。A 组标准饲养 4 周,大 鼠可自由进食、饮水。第 1、14 天气管内每次注入 9mL/L 生理盐水（NS）mL,每天放入 m3 有机玻璃（mmm）舱内 2h,但不予吸烟。B 组第 1、14 天气管内每次注入脂多糖 （LPS）mL,每天在 m3 有机玻璃舱内烟熏 2h,连续 4 周。用 YHL1 智能测氧仪（中国航天科技集团公司七三研究所） 监测舱内氧浓度使其保持在 210mL/L,玻璃舱有小孔与外界 相通,保持常压状态,舱内放置无水氯化钙及钠石灰吸收水 分和二氧化碳,大鼠可自由进食,饮水。C 组第 1 天起用 EM（桂林集崎制药厂）灌胃治疗 50mg/（kgd）直至动物 处死,共 4 周,余条件同 B 组。羊抗鼠单克隆 CD8 抗体购自 SantaCruz 公司;鼠抗鼠单克隆 CD4 抗体购自 Chemicon 公司; SP 试剂盒、DAB 购自迈新生物技术公司。 方法 动物血气分析 所有 Wistar 大鼠在模型制备完成 24h 内用 10mL/L 戊巴比妥（3050mL/kg）腹腔麻醉后抽取左 颈总动脉血 mL,置于 4冰箱内保存,2h 内测定。 肺组织标本制备及处理 右肺下叶以 100mL/L 中性甲 醛固定 24h,于右肺下叶距肺门 23mm 处取材,连续切片,分 别行维多利亚蓝VG 染色、HE 染色;另外制备防脱切片做 免疫组化染色。 气道炎症病变观察及评分方法 在 HE 染色下,根据 Cosio 等3设计的小气道病变评估方法和标准加以改进。 选取直径在 7001200m（管腔最短径/最长径）的膜性 细支气管。病理评分方法:无病变（0 分）;1/2 为重度异常 （3 分） 。炎症细胞浸润:无病变（0 分）;20 个/Hp 为重度 异常（3 分） 。累加每一指标得分,将累加分占该标本内所有 被检的膜性细支气管可能得到的最高分的百分数,作为该标 本膜性细支气管这一指标的病理积分,把 9 项指标的病理积 分相加,即可得到每一标本膜性细支气管的病理得分（每项 病理指标的最大得分为 100 分,9 项指标最大病理总分为 900 分） 。 肺气肿评分 按照柴秀娟等4介绍的方法计算每例大 鼠平均肺泡面积（m2） 。对每一例大鼠边缘肺组织任选 5 个 20镜下视野一定视场面积（m2）,计数每个视场面积 肺泡数目（n）,平均肺泡面积视场总面积（5）/肺泡 总数（n1+n2+n3+n4+n5） 。 肺腺泡内肌化型血管外膜浸润炎症细胞计数 在 HE 染 色下,用 DMR+Q550 病理图像分析仪（德国）及 LeicaQwin 分析软件在 40高倍镜下测量肺腺泡内肌化型动脉外膜面 积（血管外弹力膜至致密结缔组织边缘）,在油镜下计算其 外膜炎性细胞总数及分类,以每 mm2 血管外膜面积中各炎性 细胞的数量作为肺血管炎症的定量指标。 肺腺泡内病理图像分析 在维多利亚蓝VG 染色下弹 力纤维呈蓝黑色,平滑肌显色为棕黄色或棕红色,胶原纤维 显色为红色。用 DMR+Q550 病理图像分析仪及 LeicaQwin 分 析软件分析大鼠整个切片肺腺泡内小动脉（包括呼吸性细 支气管、肺泡管及肺泡水平上的小动脉）,根据肺腺泡内动 脉显微结构特点将其分为三型:肌型动脉:具有完整的内外 弹力层及完整的平滑肌层;部分肌型动脉:具有完整的外弹 力层,但平滑肌层和内弹力层不完整;非肌型血管仅有一层 弹力层而无明显的平滑肌层。在 40高倍镜下对 50m 免疫组化 采用链菌素亲生物素过氧化酶（SP）法染色。 石蜡切片常规脱蜡至水,高压热修复 90s,30g/L 过氧化氢室 温孵育 10min,以消除内源性过氧化物酶活性,蒸馏水冲洗, PBS 浸泡 5min,正常山羊血清室温孵育 10min 以封闭非特异 性反应。滴加 1100 稀释的羊抗鼠单克隆 CD8 抗体或 1100 稀释的鼠抗鼠单克隆 CD4 抗体 4过夜,随后加入即 用型生物素标记的二抗,PBS 冲洗后,加入即用型链霉素抗生 素蛋白过氧化酶溶液,均各室温孵育 10min 后,使用 DAB 显色,苏木素复染,1mL/L 盐酸酒精分化,PBS 冲洗返蓝。以 PBS 代替一抗为阴性对照。显示阳性反应为胞质呈棕褐色。 使用病理图像分析仪观察气道和肺腺泡内动脉外膜 CD8+T 淋巴细胞及 CD4+T 淋巴细胞浸润的肺血管。 统计学分析 使用统计学软件进行数据分析,实验数据 以 xs 表示,3 组间差异比较采用单因素方差分析 （OneWayANOVA）,遵循正态分布、方差齐者组间两两比 较采用 LSD 法分析,方差不齐者采用 GamesHowell 法。分 析相关性采用直线相关分析。 2 结果 气道病理炎症观察和评分 B 组大鼠气管、支气管纤毛 黏连、倒伏、缺失,上皮细胞变性坏死糜烂脱落,气道管壁 黏膜充血水肿;管壁伴有淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞 等炎症细胞浸润,使用红霉素治疗后,气道病理积分下降 （表 1,图 1） 。 表 1 气道炎症病理积分（略） aP 平均肺泡面积 B 组肺泡腔不规则扩大,部分充 血水肿增厚,部分肺泡间隔变薄、断裂,相互融合形成肺大 泡。平均肺泡面积 m2。与 A 组面积 m2,C 组面积 m2 比较差异均有统计学意义（P 血气分析 B 组的氧分压、 血氧饱和度比 A 组轻度降低,B 组的二氧化碳分压与 A 组比 较轻度升高（P 表 2 动脉血气分析结果（略） bP 肺腺泡内动脉炎症反应 H