药品无菌保证原理md32753ppt课件

* 药品无菌保证 基本原理 江苏 无锡 2006-09 邓海根 1 * 内 容 n微生物基础知识简介 n热力灭菌基本原理 n药典对最终灭菌产品的无菌标准 n注射剂常见灭菌方法 n灭菌工艺的验证 n常见灭菌设备介绍（示意） n容器密封可靠性验证 2 * 第一部分 微生物基础知识简介 3 * 一、微生物生存的环境 n人类生活的环境充斥着 大量微生物 n海拔100英里（约160公 里）以上 n海平面以下600英尺（约 182米）的地方都可以发 现微生物的踪迹 n1英里=5,280英尺或1.609 公里 4 * 一、常见微生物 种类类基本特点 细细菌 0.5 5 m，生长态时长态时 不耐热热，部分 能形成耐热热芽孢孢 真菌 5 m 50 m，形成芽孢孢随空气扩扩 散，不耐热热 病毒 小于0.1 m，一般不耐热热，0.22m 过滤过滤 不了 5 * 一、真菌和细菌 大小真菌 5 m 50 m细细菌 0.5 5 m 主要成员员酵母、霉菌细细菌 细细胞组组成酵母是单细单细 胞，其它为为多细细胞均为单细为单细 胞 细细胞质质 成份 遗传遗传 物质质(DNA)被双层层核膜包裹(真 核)，并且还还有如线线粒体、叶绿绿体及 高卡基体等被膜包裹的细细胞器。 遗传遗传 物质质(DNA)祼露并游离于细细胞质质 内(原核)，并且不含有其它有膜细细胞 器。 繁殖方式有性（如大型真菌或无性如酵母）， 霉菌则则二者兼有 无性（裂殖） 孢孢子 霉菌产产生分生孢孢子（生长长繁殖，类类 似 于植物的种子)，虽虽不耐热热，但会飘飘 浮于空气中而难难以消除。 酵母不会产产生孢孢子。 主要只有两个属产产生孢孢子（内生孢孢 子），又名芽孢孢： Bacillus-芽孢孢杆菌属和 Clostridium-梭菌属 ，细细菌芽孢孢属于 休眠体，一个细细菌细细胞产产生一个芽孢孢 生长长条件20-25oC, 3-5天30-35 oC, 1-2天 杀灭杀灭 程度 不耐热热，但难难用消毒剂剂消毒（因孢孢 子 处处于漂浮状态态） 生长态长态 菌不耐热热（极个别别除外），但 形成芽孢孢后耐热热。 6 * 一、微生物分布特点 微生物无处不在 气源性微生物革兰氏阳性菌较多 它们可形成芽孢，难以杀灭 因此，药品生产需要HVAC 水源性则革兰氏阳性菌居多 不会生成孢子 但会形成细菌内毒素 耐热性差 G+ G- 7 * 一、生长态菌及孢子 n将植物比喻微生物，不恰当而直观 n如玉米，发芽 生长 种子，前二种相当于微生物 的生长状态，到了种子，对环境的（水分、温度等 ）耐受性大大增强 n然而，微生物的芽孢，并不是繁殖的手段，而是休 眠体，植物没有这种相对应的东西 n革兰氏阳性菌：气源性，身体上部，呼吸道 n革兰氏阴性菌：则是水源性的，细胞结构不同 n生物指示剂均为革兰氏阳性菌，灭菌用BI为非致病 菌。 8 * 一、细菌芽胞（孢）的形成及其特性 成熟芽孢 孢子壁 母细胞 孢子壁的形成 生长态细胞 摘自 /microbes/spores.asp 内生孢子 产生于 Gram+ 细菌: 芽孢杆菌属Bacillus 梭菌属Clostridium 仅含核酸及少量萌发必需物 皮层含DPA和Ca2+复合物 能抵御各种恶劣环境 可休眠上百万年 真菌孢子因不具上述特性 而不耐热 DPA：吡啶二羧酸 9 * 一、生物指示剂（BI）的定义 n对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于 定量测定灭菌效力的微生物制剂（USP28 ） n特点 n用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的 耐受性、稳定性、易培养、及非致病性 n相用于被验证产品、灭菌工艺、生产工艺 n符合有关法规的要求 10 * 一、什么是芽孢？ n当某些细菌遇到不良生存环境条件时，为 保护自身，在细胞内形成一外壁厚而坚硬 的体眠体，该体眠体即称芽孢（Spore） 或孢子。 n由于其对不良环境的耐受性远高于生长态 细胞，常被用于挑战灭菌工艺，以确认被 灭菌物品无菌的可靠性。 11 * 一、芽孢的特性 n主要产生于Gram+ 细菌的两个属 n芽孢杆菌属 Bacillus n梭菌属 Clostridium n能抵御各种恶劣环境，可存活上百万年，因为它 n有厚的皮层结构 n仅含核酸及少量萌发必需物 n含水量极低 n休眠体，内生孢子，不可再生（每个细胞只产生一 个芽孢）；真菌孢子属于分生孢子，不具上述特性 。 12 * 芽孢的特点 n耐热 u80 下长期存活 u100 下有相当高的存活率 u100 以上死亡过程符合一级动力学方程 n影响芽孢耐热性的因素 n芽孢存在的介质 n受热时的湿度 13 * 生物指示剂（BI） n对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于 定量测定灭菌效力的微生物制剂（USP28 ） n特点 n芽孢 n用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的 耐受性、稳定性、易培养、及非致病性 14 * 第二部分 热力灭菌基本原理 15 * 热对微生物的作用 n当高温破坏了细胞中起生命作用的蛋白 质、酶及核酸时，细胞死亡。 n生命基本物质的破坏本质上是化学变化 n实验证明微生物受热死亡速度符合一级 动力学方程 16 * 一级动力学方程式 ndN/dtK(N0Nt) n N0为t0时，存活的微生物数； n Nt为t时被杀灭的微生物数； n N为t时存活的微生物数 n K为常数。 n对数规则 17 * 微生物存活数与灭菌时间关系图 半对数座标 Y轴：微生物取对数 X轴：时间为10进制普通座标 t lgN 102030 1 2 3 Y轴及X轴均为普通座标（示意） t N 102030 10 100 1000 18 * 芽孢的耐热参数：D值 n指一定温度下 将微生物杀灭 90 或下降一 个对数单位所 需要的时间。 lgN t 1 2 3 4 t1t2 D 19 * 灭菌温度对D值的影响 灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间就长 115 121125 lgN t lgN=1 D125D121D115 20 * F0值：达到同一灭菌效果的概念 F0值即标准灭菌时间 指产品在灭菌过程中获得的与标准参照条 件（121）相同灭菌效果的曝热时间 lgN t LgNo LgNt 121117 LgN FT Fo 21 * 不同灭菌温度下的灭菌率 灭灭菌温度 灭灭菌率L 1000.008 1050.025 1120.126 1150.251 1160.316 1180.501 1200.794 1211.000 1221.25 1231.59 n灭菌率：为达到与某一温 度下灭菌1分钟相同的灭菌 效果，在121下灭菌所需 要的灭菌时间 n100灭菌时1分钟，相当 于121 灭菌0.008分钟， 即Fo值为0.008分钟。 n105灭菌40分钟时，Fo 约为 1分钟，能使D值为1分 钟的芽孢数量下降1个对数 单位 22 * 第三部分 药典对最终灭菌产品的无菌标准 23 * 无菌检查的局限性 n历史的教训： n1962年，美国FDA颁布第一部GMP n1970-1975年，美国输液污染至败血症400多起 -有问题的产品全部通过了无菌检查 n无菌检查的风险（另稿有示例说明） 取样样量为为20瓶时污时污 染率与通过过无菌检查检查 概率的关系 批产产品污污染率5101520 通过过无菌检查检查 的概率361241 24 * 药典对无菌保证的定量标准 n1973年的英国药典和1980年USP增补版提到 了无菌的量化标准 nFo不小于8分钟 n经灭菌后，产品中污染菌存活的概率不大于 百万分之一。 n中国药典在2000版起，收载了此标准。 n无菌保证值：污染菌存活概率的负对数，经 灭菌后，产品的无菌保证值不小于6 25 lgN 2 3 4 5 -2 -3 -4 1 -5 -6 -1 0 12345 7 6891012分11 SAL F0/D lgN0 假定D121为1 无菌保证值与Fo、D值及带菌量的关系 过度杀灭示意 生产中Fo=8示意 26 * “无菌”的标准及概念 n“每批产品中，污染品概率不得超过一百万分 之一”，无菌的这一量化标准应当可以用试验 来证明的。用无菌检查法显然是不可能的。 n然而，每瓶产品微生物存活的概率却可计算的 。 n这就需要测试产品灭菌前微生物污染数、D值， 使用对数规则，并用生物指示剂试验来证实。 n量化指标 + 计算 + 试验，使无菌标准成为工 业界可执行的标准 27 * 产品灭菌完全的必要措施 从公式 SAL F0/D lgN0 看灭菌完全的必要措施 n足够的F0值 n产品灭菌前污染菌检测 需氧菌总计数（微生物污染水平） 污染菌耐热性 28 * 产品灭菌完全的必要措施-2 通常采用的中间控制手段： n对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好 的半成品取样检测。 样品须作需氧菌总计数 将检品液置于100下加热10分钟，检查是否有耐 热芽孢存活 n须对微生物学检测结果进行趋势分析。 29 * 产品灭菌完全的必要措施-3 FDA要求 “ 对于在灭菌前产品污染菌检测中所发 现的耐热孢子，必须与验证灭菌工艺所 用生物指示剂的耐热性进行对比” 30 * 产品灭菌完全的必要措施-4 具体要求： n如经热处理后检出的微生物是芽孢类微生物。需将 其培养并收集芽孢，测定其的耐热性，将之与验证 灭菌工艺用生物指示剂的耐热性进行对比。 n如果所分离的污染菌耐热性高于生物指示剂的耐热 性，则必须使用耐热性更强的生物指示剂对灭菌工 艺重新进行验证(可以使用生产中的分离菌)。 n如果在生产全过程中，对微生物污染严格控制，那 么，这种情况发生的概率是非常小的。 31 * 无菌保证水平举例 n假定灭菌开始时产品中的污染微生物总数（N0） 为100cfu/瓶，污染微生物的耐热参数（D）为1 分钟，要达到药典规定的SAL不小于6的标准， 灭菌F0值应达到多少？相当于121 和115 下 灭菌多少分钟？ n答：F0=（SALlgN0）D =（6+ lg100）1= 8 分钟，需在121下灭菌8分钟。 n换算成115 下的灭菌时间是：F0 /L115=8/0.25=32分钟。 32 * n某复方氨基酸注射液采用110，30分钟的灭 菌程序，起始污染微生物仍为100cfu/瓶，D值 为0.5分钟，请计算无菌保证值和残存微生物污 染的概率。 n答：其SAL为：SAL= F0/D - lgN0 = L110t /D - lg100 = 0.0830/0.5-2 = 2.8 n残存微生物的概率为10-2.80.158 n通过无菌检查的概率为(1-0.158)20=96.9%。 无菌保证水平举例二 33 * 第四部分 注射剂常见灭菌方法 34 * 湿热灭菌-1 n湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌 ，也包括过热水灭菌（水浴式或喷淋式 ） n实际上只要微生物处于达到水水蒸气 平衡状态下的灭菌过程，都是湿热灭菌 n例：实验室给微生物取样瓶灭菌时通常加入 1ml水并密封。 n水分的存在有利于灭菌 35 * 湿热灭菌特点 n蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活，从而 杀灭细胞 n 蒸汽热穿透性强 n 灭菌效率高 n温度相对较低 n灭菌时间相对短 n灭菌过程不产生任何化学物理污染 n灭菌设备控制参数少，运行稳定，方便管理 36 * 湿热灭菌工艺之一 n美国FDA规定的残存概率法 n灭菌过程8 F012 10-6 热稳热稳 定性好的产产品 以杀灭杀灭 微生物作为实现为实现 无菌的手段 残存概 率法 Fo8 10-6 热稳热稳 定性较较差产产品 工艺过艺过 程将防止产产品被耐热热菌污污染放在首位，而 不是仅仅依赖赖最终灭终灭 菌去消除污污染 流通蒸 汽法 不计计算Fo 0.1% 热热不稳稳定产产品 加热热是无菌生产产工艺艺（除菌过滤过滤 ）的补补充手段 除菌 过滤过滤 法 LRV7 0.1% 不能加热热的产产品 LRV=log reduction value 过滤对过滤对 数下降值值，一般 上游为为107下游为为1，则则LRV=7 由于后续续无菌操作较较多，最终产终产 品达到的无菌保 证证水平远远低于除菌过滤过滤 的本身的能力 41 * 干热灭菌机理 n干热灭菌与湿热灭菌的动力学特征相似 ，符合“ 对数规则” ，但灭菌的机理却 并不相同。 n干热灭菌为何需较高的温度？ n水份的影响：湿度低 n机理不同：干热灭菌是使微生物氧化而 不是使蛋白质变性 42 * 干热灭菌要点 干热灭菌的介质通常是热空气 n用对数规则描述微生物杀灭过程，准确 性较差 n温度高，200 以上，有可能到320 n用于玻璃容器、手术器械等 n无菌生产工艺中安瓿、西林瓶的灭菌和 去热源 43 * 干热灭菌与去热原的关系 n去热原的工艺条件比孢子杀灭程序要 苛刻得多，通常相当于标准干热灭菌 时间FH 的数十倍。 n如果干热法去热原工艺能使细菌内毒 素下降3个对数单位，就不必再进行微 生物的生物指示剂挑战性试验。 44 * 第五部分 灭菌工艺的验证 45 * 灭菌工艺的验证 n灭菌工艺验证资料是国外药品（注射剂）注册的必报材料 n灭菌工艺条件（灭菌介质、温度时间参数、装载方式等） n灭菌设备和灭菌工艺的验证（前者与后者不同） n灭菌工艺验证资料包括 n灭菌设备的安装确认 n灭菌设备的运行确认 n灭菌工艺的验证 n先对设备温度仪表和验证用仪表进行校准 n空载热分布找到灭菌过程中灭菌设备的最冷点 n不同装载形式、不同装量规格产品的热穿透试验产品获得的F0 n生物指示剂验证-微生物挑战性试验 46 * 灭菌过程的Fo 示意 47 * 热力灭菌常用生物指示剂 灭灭菌方式 微生物（孢孢子） D值值范围围（分 ） 湿 热热121 嗜热热脂肪芽孢孢杆菌 Bacillus stearothermophilus 1.5-3.0 枯草芽孢孢杆菌 Bacillus subtilis 0.3-0.7 凝结结芽孢孢杆菌 Bacillus coagulans 0.4-0.8 梭状芽孢孢杆菌 Clostridium sporogenes 0.4-0.8 干热热 150 枯草芽孢孢杆菌黑色变变种 Bacillus subtilis var. niger 1.0 资料来源：参数放行专题材料 48 * 第六部分 常见灭菌设备介绍 49 * 灭菌设备 1、混合蒸汽灭菌柜 2、下排式蒸汽灭菌柜 3、脉动真空蒸汽灭菌柜 4、旋转喷淋灭菌柜 5、隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图 50 * 混合蒸汽灭菌柜 SAM= steam air mixture 蒸汽空气混合灭菌柜 混合汽体灭菌柜 进蒸汽的管没画出 顶上用一风扇，使灭菌均匀 无风扇时，灭菌容易不均匀 热交换器控制冷却速度 51 * 下排式蒸汽灭菌柜 热蒸汽在上 冷空气在下 蒸汽挤空气 52 * 脉动真空蒸汽灭菌柜 有高真空及 脉动真空二种形式 第二种比较常见 抽99%，剩1% 3次真空，残存的空气 为0.1% 密封圈 53 * 旋转喷淋灭菌柜 纯化水或注射用水 作传热介质-过热水 灭菌 加热时开工业蒸汽 冷却时，可用冷冻 水或自来水冷却 产品转动，受热均匀 软袋灭菌时，用过热水 较多，但需加压缩空气 54 * 干热灭菌柜 常见程序：1802小时，细菌内毒素下降3对数单位 55 * 隧道式洗瓶灭菌柜工作原理图 瓶清洁 排水汽 预热 去热原 冷却 干热灭菌 层流 保护 洗瓶及灭菌、去热原为联动线 B区 56 * 冰浴 0.01 油浴 121 数据采集器 参照仪 验证仪校准 灭菌柜热分布验证试验图示灭菌柜热分布验证试验图示 57 * 第七部分 容器密封可靠性验证 58 * 密封系统完好性-物理法 待确认的密封口 WFI 支架 氯化钠溶液 容器 经灭菌后，氯化钠有否进入瓶内？ 59 * 密封系统完好性-挑战试验 待确认的密封口 培养基 支架 菌液 如108个菌/ml 容器 大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或粘质沙雷氏菌 60 * 产品存放期密封可靠性检查-1 微生物侵入试验 n往产品容器内灌入培养基并按常规方式压塞轧盖， 灭菌后冷却备用。 n将冷却后的容器倒置，并将瓶口完全浸没于高浓度 的运动性细菌溶液(如108个菌/ml)内，如有大肠埃希 氏菌、铜绿假单胞菌或粘质沙雷氏菌。 n将容器外表面消毒并培养，看容器内是否有挑战性 细菌生长。 61 * 产品存放期密封可靠性检查-2 n此试验条件比实际储存和运输时产品遭微生物 污染的条件要苛刻得多。 n另应多留一些装有培养基产品的容器，并置于 与稳定性样品相同的贮存条