rt-pcr检测外周血中肝癌细胞的研究进展(1)

RT-PCRRT-PCR 检测外周血中肝癌细胞的研究进检测外周血中肝癌细胞的研究进 展展(1)(1) 摘要:应用 RT-PCR 技术检测外周血中肝癌细胞是近年 发展起来的新方法，白蛋白 mRNA 和 AFPmRNA 为肝组织特异 表达，通过检测这二个转录子作为肝癌细胞存在于外周血 的标记，有助于判断肝癌的转移、复发。本文综述了近年 有关这方面的研究进展。 肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC.以下简称 肝癌）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在肝切除术后和 肝移植术后再发率仍达 50以上1。因此，多数学者认为 在手术之前患者外周血中已存在肿瘤细胞或已发生微转移 而影像学诊断又未发现；也有学者推测可能是手术过程导 致了肝癌的细胞播散。肝癌细胞的血源性播散是肝癌肝外 转移的主要方式，所以在治疗前检测外周血中是否存在肝 癌细胞可能是患者肿瘤复发、转移和预后的重要指标。近 年兴起的逆转录酶-聚合酶反应 （Reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RT- PCR）具有敏感性高、特异性强的优点，使检测外周血中的 少量癌细胞成为可能，国外学者已相继报道利用 RT-PCR 技 术在多种实体瘤患者外周血中成功地找到肿瘤细胞2。本 文集中对外周血中检测肝癌细胞的研究作一综述。 1 原理和方法 rT-PCR 技术是以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下， 由人工合成引物介导生成 cDNA 第一链，以此再作为聚合酶 链反应的模板，在 TaqdNA 聚合酶作用下，扩增产生大量特 异 DNA 片段。检测外周血中肿瘤细胞的依据是：由于血浆 中富有大量的 RNA 酶，一旦血浆中出现 RNA 即会被降解， 故血浆中不会有游离的 mRNA，因此通过 RT-PCR 技术检测到 的 mRNA 显然来自外周血中完整的循环细胞，选择恰当的靶 mRNA 是决定检测结果是否可靠的重要因素。目前，由于缺 乏肝癌特异表达的 mRNA，因此，肝组织特异性表达的白蛋 白 mRNA 和甲胎蛋白（-Fetoprotein,aFP）mRNA 被用于肝 癌细胞的检测。 rT-PCR 技术检测外周血肝癌细胞的一般步骤如下 3,4,5：静脉取血去除红细胞，收集有核细胞用于提取 总 RNA，或用淋巴分离液密度梯度离心纯化有核细胞，癌细 胞与单核细胞在同一密度层。异硫氰酸胍一步法提取细 胞总 RNA。RT-PCR 反应，分为一次 PCR 和套式 PCR。结 果检测，简单方法是电泳分离染色观察扩增带；为增加试 验的敏感性和特异性，更多学者采用分子杂交的方法确定 阳性结果。 2 外周血白蛋白 mRNA 的检测 Carr 等在 1991 年美国肝病研究协会第 42 届年会上首 次报告利用 RT-PCR 技术检测白蛋白 mRNA 以确定外周血中 的肝癌细胞，结果表明在 17 例晚期患者中 16 例阳性，其 中 6 例肝移植术后外周血白蛋白 mRNA 水平降低甚至消失， 而 2 例术后白蛋白 mRNA 水平不变的患者出现肿瘤复发。同 时检测的 6 例健康对照、10 例肝硬化患者及 10 例肝硬化行 肝移植术的病人均为阴性6。Hillaire 和黄智铭等也得到 相似的结果，统计学分析表明白蛋白 mRNA 阳性率与肝癌的 临床分期、肿瘤的转移、复发相关3,7。 随着更多实验室开展外周血白蛋白 mRNA 的研究，越来 越多的资料表明白蛋白 mRNA 作为肝癌患者外周血中癌细胞 的标志是不适宜的，其表现在三个方面：首先，在良性肝 病、健康对照人群发现不同程度的阳性检出率。Louha5、 Chou8、 Matsumura10、Muller9、Wong11、 Ng12等人的结果证实了这一点，他们分别在 5 例、6 例、 8 例、26 例、9 例、3 例健康对照的外周血中检测到白蛋白 mRNA；同时，Muller9的结果还表明在慢性肝病组织阳性 率为 88（22/25） ，急性肝病组织为（18/19） 。其次， 部分良性肝病患者切除术后外周血白蛋白 mRNA 呈阳性。 ijzermans13等对 5 例良性肝病患者切除前后分析表明， 术前外周血中均无白蛋白 mRNA 转录，而术后 24h 内均阳性， 作者认为白蛋白 mRNA 可能是由于手术操作导致正常肝细胞 释放进入血液循环造成的。其三，外周血白蛋白 mRNA 阳性 与肝癌患者临床资料不相关，无临床指导意义。Barbu14 等将 101 例肝病患者依是否外周血中转录白蛋白 mRNA 分为 二组，比较二组间肿瘤大小、个数、有无门静脉瘤栓及肝 外转移等各项临床资料，统计学分析表明二组间无显著差 异（注：二组患者的治疗方案无显著不同） ；随访一年两年 组间的存活期也无显著差异。 综上所述，利用蛋白 mRNA 作为外周血肝癌细胞存在的 标记是有争议的，一些学者指出这种差异可能是由于各实 验室所使用的方法及灵敏度不同造成的。我们比较了不同 文献的方法，其灵敏度在不同实验室也有较大差异，导致 在不同患者组中检出率也不相同，最后所得结论也就不可 避免是相反的。同时，我们也注意到各作者进行灵敏度分 析时所用的肝癌细胞（系）是不同的，这就更难精确比较 不同作者的结果。因此，我们认为将实验室结果的差异归 于灵敏度的不同值得进一步商讨。总结上述文献初步认为： 利用白蛋白 mRNA 作为肝癌细胞存在于外周血的标记是不适 宜的，因为在良性肝病和健康对照中检测到白蛋白 mRNA， 具体到是何种细胞转录了白蛋白 mRNA，目前尚无有效的方 法加以证明，较流行的看法有二种，其一认为可能是外周 血白细胞在某种生理状态下的不合理转录，另一种观点认 为可能来自肝细胞脱落进入外周血。 3 外周血 AFPmRNA 检测 AFP 基因是另一个肝组织特异表达的基因。Matsmura 等采用套式 RT-PCR 技术检测 AFPmRNA，发现 33 例肝癌患者 中 17 例阳性，其中肝外转移阳性率 100（6/6） ，无肝外 转移组（11/27） ，慢性肝病组（2/17） ，肝硬化组 （2/13） ，26 例健康对照无一例阳性；与临床资料比较表明， 外周血 AFPmRNA 的检出率与肿瘤大小、临床分期、血清 AFP 水平及有无转移密切相关10。Komeda4、Louha5和 Wang15等得到与此相近的结果，他们在肝癌组的阳性检 出率分别是 36（23/64） 、（28/84）和（28/47） ，而 在肝炎病人、继发性肝癌和健康对照组中均阴性。有区别 的是，Wang15认为外周血 AFPmRNA 阳性率与肿瘤分期、 大小、有无转移等之间无相关性。 在定性 PCR 的基础上，Wong11等以 HepG2 细胞作为 外参标准，对 AFPmRNA 和白蛋白 mRNA 进行半定量 PCR 研究， 结果表明 AFPmRNA 在 68 例肝癌患者中 13 例阳性， ，18 例健 康对照组中 2 例阳性；而白蛋白 mRNA 阳性分别是 44 例和 9 例。根据二者分辨率不同，确定正常值上限后，AFPmRNA 阳性例数分别是