医学课件基因诊断

李 凌 第一军医大学分子生物学研究所 第23 章 基因诊断 Gene Diagnosis References 医学分子生物学（七年制统编教材） 冯作化 主编 人民卫生出版社 医学分子细胞生物学（面向21世纪课 程教材） 邓耀祖 屈伸 主编 科学出版社，2002 基因变异致病 疾病基因变异： （1）内源基因的变异： 基因结构突变 基因表达异常 （2）外源基因的入侵 基因诊断 一、基因诊断概述 二、常用技术与方法 三、应用 概念 基本原理 诊断技术 诊断方法 诊断策略 一、基因诊断概述 (一) 基因诊断的概念与特点 (二) 基因诊断的基本原理与临床意义 (一)基因诊断的概念与特点 1概念： 指利用现代分子生物学和分子遗传学 方法，通过检测基因的结构或表达功能 的异常，对人体状态和疾病作出诊断的 方法和过程。 基因诊断以DNA和RNA为诊断材料， DNA诊断 RNA诊断 Molecular DiagnosisMolecular Diagnosis Targets DNA Gene diagnosis RNA Protein: enzyme, Ag, marker 2基因诊断的特点： （1）直接检测基因，属病因诊断，针对性 强； （2）特异性强、灵敏度高：由于基因诊断 采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等技 术； （3）适用范围广：其应用的范围已从原先 局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、 肿瘤、心血管疾病等领域。 基因诊断的评价 特异性 灵敏度 重复性 快速 经济 (二)基因诊断的基本原理与临床意义 1基本原理： 通过检测致病基因（包括内源基因与外源基因）的 存在、量的多少，结构变化与否及表达水平是否正常， 以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作 为疾病确诊的依据。 2临床意义: 对有表型出现的疾病作出明确诊断 早期快速诊断 确定个体对疾病的易感性 疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等 二、基因诊断的常用技术与方法 (一) 基因诊断的常用技术 (二) 基因诊断的基本方法 (一)基因诊断常用技术 核酸分子杂交 PCR（聚合酶链式反应） 限制性酶切分析 SSCP（单链构象多态性分析） DNA 测序 DNA 芯片技术 基因诊断技术分类 Molecular hybridization Southern, Northern, slot blot, FISH, ASO, microarray PCR PCR/ASO, PCR/SSCP, PCR/sequencing, PCR/RFLP Targets and Molecular Techniques DNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, microarray, restriction analysis, RFLP，SSCP RNA Northern blot, RT-PCR, microarrays Protein Western blot, Immuno-histochemistry, microarray Basic Principle Denature Hybridize Southern, Fish PCR Protein: Antigen-antibody interaction lDNA: denaturation and hybridization of the helix structure 1. 核酸分子杂交 Molecular hybridization Southern blotDNA Northern blotRNA Dot blot，Slot blot In Situ Hybridization, FISH 核酸分子杂交的流程示意图 待测核酸制备 滤膜上核酸固化 杂 交 去除未参与杂交的探针 检 测 杂 交 信 号 制备探针核酸片段 探 针 标 记 加入标记核酸探针 探针的种类 基因组DNA 探针 cDNA探针 寡核苷酸探针(Oligonucleotide probes) RNA 探针 探针的标记物 放射性标记物 v 32P，35S，125I，3H 非放射性标记物 v生物素，地高辛，荧光素， 酶， 金属 探针的标记方法 放射性同位素标记法 v缺口平移法(Nick translation) v随机引物延伸法(Random primer labelling) v末端标记法(End labelling) 非放射性标记法 v酶促标记法、化学标记法 Southern blot N N T T N T T Traditional Methods GAPDH - PAP- Southern blot Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 单基因检测，不易发现表达基因间的相互作用 2、 PCR PCR技术的优点 特异性强 灵敏度高 操作简单、省时 对待检原始材料质量要求低 高效率的基因扩增技术 PCR引物设计的一般原则 引物长度 G+C含量 碱基分布的随机性 引物自身 引物之间 引物的3端 引物的5端 引物的特异性 PCR的种类 通用引物PCR 多重PCR 套式PCR PCR结合寡核苷酸探针斑点杂交法 PCR-RFLP AP-PCR 原位PCR PCR扩增产物分析法 凝胶电泳 点杂交 微孔板夹心杂交法 PCR-ELISA法 3. DNA sequencing 4.DNA芯片技术 DNA chips or microarray 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将 大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面 ，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析， 得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） 由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术 如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相 支持物，所以称为DNA芯片技术 DNA芯片技术的概念 DNA芯片的分类 原位合成芯片 （In situ synthetic GeneChip） Affymetrix公 司 DNA微集阵列 （DNA microarray） 斯坦福大学 Patrick Brown研究小组 合成DNA芯片 Affymex Inc. 显微光蚀刻 寡聚核苷酸合成 * * Synthetic Chips 密度大于1000/cm2 Affymetrix Inc. 原位合成芯片 DNA微阵列 DNA微集芯片 Stanford Univ. Patrick Brown 显微打印头 单链DNA/cDNA片段 Microarray Printing DNA微集芯片. 两类DNA芯片的比较 内 容 原位合成芯片 DNA微集阵列 制备方式 光引导原位化学合成 收集探针、 显微打印 探针类型 寡核苷酸 cDNA、基因片段 、 寡核苷酸等 探针长度 短，小于30nt 较长 100nt500nt 或更长 最高集成度 10万40万点阵/ 1万10万点阵/ 平方厘米 平方厘米 专利保护 专利控制严格 无专利控制 * * DNA芯片技术原理 大规模集成的固相杂交 基本原理是核酸分子杂交，即依据 DNA双链碱基互补配对、变性和复 性的原理 以大量已知序列的寡核苷酸、 cDNA或基因片段作探针，检测 样品中哪些核酸序列与其互补， 然后通过定性、定量分析得出待 测样品的基因序列及表达的信息 DNA芯片技术流程 Biological Sample Analyze dataScanner microarray “Hybridize” arrayer Microarray fabrication Sample preparation Molecular hybridization Detection and analysis DNA芯片的基本应用 2.基因表达谱分析 基因突变检测及多态性分析 DNA序列分析 1.基因检测分析 生物战剂检测 临床疾病的 基因诊断 法医学鉴定 药物研究开发 动植物检疫 基因组研究 后基因组计划 生物信息学DNA芯片 DNA芯片技术的应用领域 Bio