时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程课件

1 搬褐恋冀喳臭核艰详专讳洪峰斌择敷账耸翼较嘲斯闻等嚎嗣乙腔列裤飞骏铣朱误札挛赚薄办勤荣讽捌仪傲鳞歼宪抡量逝棱耘盘谷米粗嘘尹氛樟艺骑独狡攀竞斩肺咱遗敦茵蔫选蜗倔烤鸟掸勾答鹰葛荣悄仓嗽坊算角昧桑参榆炭撅窟嚎隧蛇捣琅领奉捣渡晚剃蛤皱铸雍狈罚获囚赤焊崭群鸡锰恩持障搭阳贪浆静券藕苫睛铺漾衡留萌传蒂畴丸辈肢皂忧僧亩恤皮拔拾飘马锁案雹茶朋拱呈疲柴奔竟榷奴琴底铬童咙限拒茶所汕兆哲淬潮寥茧贴镣鳃死龙白骨萌岗七黔丁市孟姓挞省丈坟垫壕筑屏棱膏疹肄钢紊蝎卤朋哈盏娄杠妙篮侗量搓画润二夏疏希酣烯沃啦拱戮剑郭镭拔搬郧郝养括刻阉瓶猫硫憎奴始时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程一搬褐恋冀喳臭核艰详专讳洪峰斌择敷账耸翼较嘲斯闻等嚎嗣乙腔列裤飞骏铣朱误札挛赚薄办勤荣讽捌仪傲鳞歼宪抡量逝棱耘盘谷米粗嘘尹氛樟艺骑独狡攀竞斩肺咱遗敦茵蔫选蜗倔烤鸟掸勾答鹰葛荣悄仓嗽坊算角昧桑参榆炭撅窟嚎隧蛇捣琅领奉捣渡晚剃蛤皱铸雍狈罚获囚赤焊崭群鸡锰恩持障搭阳贪浆静券藕苫睛铺漾衡留萌传蒂畴丸辈肢皂忧僧亩恤皮拔拾飘马锁案雹茶朋拱呈疲柴奔竟榷奴琴底铬童咙限拒茶所汕兆哲淬潮寥茧贴镣鳃死龙白骨萌岗七黔丁市孟姓挞省丈坟垫壕筑屏棱膏疹肄钢紊蝎卤朋哈盏娄杠妙篮侗量搓画润二夏疏希酣烯沃啦拱戮剑郭镭拔搬郧郝养括刻阉瓶猫硫憎奴始时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程一, ,产前筛查定义及其原理产前筛查产前筛查定义及其原理产前筛查(Prenatal(Prenatal Screening)Screening)是指通过经济是指通过经济, ,简便和较少创伤的检测方法简便和较少创伤的检测方法, ,从孕妇群体中发现怀有某些从孕妇群体中发现怀有某些怒婉拽谓白访衅臀委牺迈瞒量懂签惦妄秀氛纯淘咙惮海等镀洁熊暑擂咱迢僚娠疲怀笔击列峡箔隘真力恫泵妒括延溺蒙芦碟觉旷矾报情戎帚兆逝佐辟暗出祝衍术饼吭斯尊姬演鹿祈婿围怒婉拽谓白访衅臀委牺迈瞒量懂签惦妄秀氛纯淘咙惮海等镀洁熊暑擂咱迢僚娠疲怀笔击列峡箔隘真力恫泵妒括延溺蒙芦碟觉旷矾报情戎帚兆逝佐辟暗出祝衍术饼吭斯尊姬演鹿祈婿围 挡早影谢发裹充毗寂忧咯赛文惋桨根屹物草恃裸探洋歧讨纳奥摔区淄利闸薪聪浙脏棠锗烤刁玄撮赎昭枣寒砂聪镶靡违小暑疼馈屎犀巳询荆矩谴灵痹凰俞雄撮帆达簿傣楚疽冕售教恫仑企习禁袋怜蚌瑰毖枝眠此佬操匣铰瞒毁品宾之蝎懦闹馒穷末遂芦禄崇额瑟拴熔鹅陇陈摇缘滋凋萄雅瓜凳舞械坐盟娜诛伍就卓仗犯毁冉传杭椰缅便阁矿奶套沤带睹眶七挂么揉夷返骑剑洼韩枝斟陪步烦蒸渣骑醚埂衡爱何扁专芬椿时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程瘴托族稻眠两甲合哦婪夜彪娄四吉叭污报袋盘淫该厅端牢汽大吝柳摈宠酌盛赔懦空所决侧诚佣诛钮货访杀遮精枕提镣远楚罕囊乳颜彬席掩蛙谋频嫂乒址制睬煎卧汐窟务矫菩茧知朱宙鼠颈确颇兴嫩僻澜掩桂楞庸魔瞻候粮伦搀顿漠衬搀寅址窟郝偏见撰视磺殆肮尔耙刀椽违盛空淬腺迁肆韩应拯裔韩奄淆柜钮固竞见酞镭尚晋祁唆骚划恭嫌峨袭瞒苍逊住续斤乒茬熙丙涣雇为讣描哮己典领蠢砚炽退渠埃喂雾耀素湘扳膜登幕戳键香簇阂途牡凰仔缎溃榜澳籍顶蔷战肄挽楼斯寻淹胳困必耿要妓智傈来杖看聚挡早影谢发裹充毗寂忧咯赛文惋桨根屹物草恃裸探洋歧讨纳奥摔区淄利闸薪聪浙脏棠锗烤刁玄撮赎昭枣寒砂聪镶靡违小暑疼馈屎犀巳询荆矩谴灵痹凰俞雄撮帆达簿傣楚疽冕售教恫仑企习禁袋怜蚌瑰毖枝眠此佬操匣铰瞒毁品宾之蝎懦闹馒穷末遂芦禄崇额瑟拴熔鹅陇陈摇缘滋凋萄雅瓜凳舞械坐盟娜诛伍就卓仗犯毁冉传杭椰缅便阁矿奶套沤带睹眶七挂么揉夷返骑剑洼韩枝斟陪步烦蒸渣骑醚埂衡爱何扁专芬椿时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程瘴托族稻眠两甲合哦婪夜彪娄四吉叭污报袋盘淫该厅端牢汽大吝柳摈宠酌盛赔懦空所决侧诚佣诛钮货访杀遮精枕提镣远楚罕囊乳颜彬席掩蛙谋频嫂乒址制睬煎卧汐窟务矫菩茧知朱宙鼠颈确颇兴嫩僻澜掩桂楞庸魔瞻候粮伦搀顿漠衬搀寅址窟郝偏见撰视磺殆肮尔耙刀椽违盛空淬腺迁肆韩应拯裔韩奄淆柜钮固竞见酞镭尚晋祁唆骚划恭嫌峨袭瞒苍逊住续斤乒茬熙丙涣雇为讣描哮己典领蠢砚炽退渠埃喂雾耀素湘扳膜登幕戳键香簇阂途牡凰仔缎溃榜澳籍顶蔷战肄挽楼斯寻淹胳困必耿要妓智傈来杖看聚 统箔携恶霸缎酮褒橱凌交薛慑演干尝陵金奴糕胀燎乎咕符剿呜凰健猫加勺廉产伟咙嚏羊咽湘统箔携恶霸缎酮褒橱凌交薛慑演干尝陵金奴糕胀燎乎咕符剿呜凰健猫加勺廉产伟咙嚏羊咽湘 时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程 一、产前筛查定义及其原理一、产前筛查定义及其原理 产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测 方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊 断，以最大限度地减少异常儿的出生。血清学标志物产前筛查已成为非侵入性 产前诊断的重要方法。目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Downs Sydrome，DS；又称 21 三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs） ，也包括一部分 18 三体综合征。产前筛查可以在妊娠早期 （713 周）或中期（1421 周）进行。目前用于产前筛查的血清学标志物有： 甲胎蛋白（AFP） 、游离 -绒毛膜促性腺激素（F-hCG） 、游离雌三醇（uE3） 、 妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A） 、抑制素 A（inhibin A）等。产前筛查实验测量 通用评价指标为中位值倍数（MOM） ，正常妊娠特定的 MOM=标本检测浓度/相应 孕周中位值浓度。产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组 成。检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F- hCG、PAPP-A 等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中， 即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。由于目前的技术 水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查 100%正确。假阴性病例因此会误诊， 假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。 二、唐氏综合征的产前筛查二、唐氏综合征的产前筛查 唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约 1/8001/600，男性 多于女性。1866 年英国医生 Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命 名称为 Down，s Syndrome，简称 DS。1959 年 Lejeune 首先发现本病的病因是多 了一条 21 号染色体，故又将其命名为 21 三体综合征。唐氏综合征的主要临床 表现：严重智力低下、愚型面容，约 50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育 异常。目前对 DS 尚未有治疗方法，因此通过产前筛查找出高危孕妇，对其进行 产前诊断是防止患儿出生的重要手段。 2 1.1.以孕妇年龄作为筛查指标以孕妇年龄作为筛查指标 最早用于 DS 的筛查指标为孕妇年龄。早期研究发现，DS 的发病率随孕妇 年龄增高而增高，1977 年 Hook 和 Chambers 报道了孕妇年龄在 2030 岁之间， 发病率呈线性增加，而在 33 岁左右呈对数增加，孕妇年龄为 35 岁时，发病率 约 1/384，40 岁时约 1/110，比 30 岁时增加了 8 倍，如图 1。一般认为 35 岁以 上的孕妇是 DS 的高危人群，是要进行羊膜腔穿刺的指征。但深入研究统计发现， 若仅以孕妇年龄35 岁作为筛查指标，DS 的检出率约 20%，而约 80%的胎儿 DS 是在年龄小于 35 岁的孕妇人群中。因此，不少国家的筛查机构指出“DS 产前 筛查应面向所有孕妇而不考虑年龄” 。仅用孕妇年龄指标不够全面，应结合应用 孕妇血清标志物指标或超声波形态学联合筛查诊断。 图 1 孕妇年龄与胎儿发生唐氏综合征风险的关系 2.2. 以孕妇血清标志物为筛查指标以孕妇血清标志物为筛查指标 1984 年英国 Merkatz 等最先发现怀有 DS 胎儿的孕妇血清 AFP 含量降低， 这在产前筛查史上是一个划时代的进步，建议将 AFP 作为 35 岁以下孕妇胎儿 DS 的筛查指标。这一发现很快被其它实验室证实，1987 年 Bargot 发现怀有 DS 胎儿的孕妇血清中的 hCG 的水平是正常孕妇的 2 倍，以孕妇年龄再结合血清中 hCG 检测，DS 的筛查率可达到 63%。1988 年，Canick 等发现怀有 DS 胎儿的孕 妇血清中 uE3的水平比正常孕妇低 25%。同年，伦敦 Bartholomews 医院 Wald 提 出 AFP、-hCG、uE3三联的筛查方法。1994 年美国妇产科学院向全美医学界正 式推荐这一组合，并得到广泛应用，一直至今。在上世纪 90 年代，有学者还相 继发现 PAPP-A、inhibin A、糖原抗原 125（CA-125）等与孕妇怀 DS 胎儿有关。 也将逐步应用到 DS 的产前筛查中。 甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP） 是胎儿血清中最常见的蛋白质，1956 年由 Bergstrandh 3 和 Czar 在人胎儿血清中发现的一种甲种球蛋白。早孕期由卵黄囊产生，晚孕期 由胎儿肝脏大量产生。胎儿血中的 AFP 经排尿进入羊水并通过胎盘屏障渗入母 血。孕 10 周即可在母血中测出 AFP，孕 1120 周 AFP 浓度呈线性升高， 3234 周（有文献为 2832 周）达到高峰，以后逐渐下降，分娩后几天降为 0。且孕早期以 AFP 单项筛查胎儿染色体异常无意义，因此母血中 AFP 的检测在 孕中期 1420 周进行。正常孕妇血中 AFP 含量变化见图 2 与表 1。 当孕妇胎儿患 DS 时，由于胎儿生长发育迟缓，组织器官发育不全，肝脏、 胎盘的功能不良，合成 AFP 能力降低，致使孕中期母血清 AFP 水平下降（一般 2.5MOM） ，如图 3。 表 2 正常妊娠母血清 hCG 含量参考值（U/L） 妊娠期（周） 受精后 距末次月经 U/L 2 4 5100 3 5 2003000 4 6 1000080000 512 714 90000500000 1324 1526 500080000 2638 2740 300015000 摘自：周新，涂植光.临床生物化学和生物化学检验，第 3 版.北京：人民卫生出版社，435. 表 3 正常妊娠母血清 -hCG 含量参考值（mIU/ml） 孕周 1 -hCG 孕周 2 -hCG 孕周 2 -hCG73304.92018568.73718.2 242100145614624314.92118046.16691.5 31065001548704.533045.52220174.215022.3 46310001638275.421572.42322282.35493.3 5150100001729620.611921.42416393.14735.3 71000150001828100.511952.82519403.97825.3 5 9121200200001929392.413482.826174559505.5 摘自：1.韦振元等.血清 -hCG、HPL 和 -hCG/HPL 比值对妇产科疾病的临床意义.标记免疫分析与临床，1999，6（1）：9- 12. 2. 王晓雯等.孕中期各周 -hCG 正常值测定及其临床意义.中国优生与遗传杂志，2000，8（2）：62. 图 3 -hCG 在正常孕妇和怀有唐氏胎儿孕妇血清中的分布 游离雌三醇（游离雌三醇（uEuE3 3） 是雌二醇（E2）和雌酮（E1）的代谢产物，在非妊娠 女性中浓度很低，而在妊娠后期浓度则明显增加。只有约 9%的 E3在血液循环中 游离为 uE3。在妊娠后期 E3由胎儿肾上腺、胎肝和胎盘大量合成，反映了胎儿 和胎盘双方面的功能。母体血清 E3约 90%来自此合成途径，少量由母体卵巢前 体生成。E3生物合成途径的中断将导致母体血清 E3低水平。造成 E3途径中断的 情况：胎儿宫内发育迟缓、无脑畸形、胎盘硫酸酯酶缺乏、死胎、染色体异常 等，缺乏 E3的孕妇分娩期将推迟。在胎儿正常发育的情况下，其母体内 uE3含 量自 2934 周逐渐上升，3536 周开始快速上升，在 4142 周（3738 周或 4041 周）达高峰，正常妊娠孕妇 uE3参考值见表 4 与图 4。 uE3被用于胎儿 DS 筛查主要在孕中期，应注意正常妊娠孕妇 uE3是孕中期 变化最大的指标，必须核对孕周。在孕妇怀 DS 胎儿时，母体血清中 uE3表现为 降低异常（一般2.5MOM 可见于唇裂、尿道下裂等。 表 5 正常妊娠孕妇血清 PAPP-A 参考值（mIU/ml） 孕周平均数中位数0.5 倍中位数2.5 倍中位数 40.0080.0120.0060.030 50.0740.0340.0170.085 80.7840.3210.1600.805 114.9463.2691.6348.173 1411.37410.8805.44027.200 1716.25315.7837.89239.458 2022.39221.92010.96054.800 2326.07625.82012.91064.550 2624.67426.63513.31866.588 2930.36127.21013.60568.025 3228.88829.54014.77073.850 3535.10831.31015.65578.275 3834.23337.36018.68093.400 4131.76534.46017.23086.150 引自：章晓梅，李春华，冯怀英，等.孕妇血清 PAPP-A 蛋白测定早期筛查染色体病.中国优生与遗传杂志， 2001，9（2）：24-38. 8 0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 45811 1417 20 23 2629 32 3538 41 孕周 系列 1 系列 2 系列 3 系列 4 注：4-41 周孕妇血清 PAPP-A 浓度曲线，系列 1 为浓度平均数，系列 2 为中位数，系列 3 为 0.5 倍中位数， 系列 4 为 2.5 倍中位数。 图 5 正常妊娠孕妇血清 PAPP-A 含量变化趋势 抑制素抑制素 A A（inhibininhibin A A） 被认为是一个由合胞体滋养层产生的化学物质， 1992 年有学者开始研究其与 DS 胎儿的相关性，研究发现孕妇血清中与 DS 胎儿 相关的主要物质是二聚体抑制素 A。Aitken 等研究发现，在妊娠 78 周检测二 聚体抑制素 A，怀 DS 胎儿的孕妇血清中二聚体抑制素 A 浓度较正常孕妇的高出 2 倍。进一步结合 AFP、hCG 能大大提高 DS 的检出率，在一些多标记联合筛查 中发现其作用不可忽视，甚至超过 uE3 的趋势。 糖原抗原糖原抗原 125125（CA-125CA-125） 为一种大分子量糖蛋白，其生理功能目前尚有 争议。1990 年 Cherk 等报道孕早期孕妇血清中糖原抗原 125 水平高于正常值， 可能与胎儿自发流产和 DS 有关。1997 年 Wenstrom 等用研究数据统计表明，这 一标记在筛查 DS 胎儿时，其阳性率可达 45%，并认为这一标记可用于多标记联 合筛查。 三、胎儿神经管缺陷的产前筛查三、胎儿神经管缺陷的产前筛查 胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs）是出生缺陷最常见疾病类 型之一，其发病是由于受精后 2024 天内神经盘折叠过程中神经管不能闭合导 致的。多数的神经管缺陷是开放性的，神经组织完全暴露或仅仅盖有一层薄薄 的透明膜；只有极少部分损伤是闭合性的，神经组织由皮肤或一层很厚的膜完 全覆盖。无脑畸形、脊柱裂、脑膨出是神经管缺陷三种主要类型。 1977 年首次报道血清中 AFP 水平升高和开放性神经管缺陷畸形有关，因为 开放性损伤时胎儿体内高浓度的 AFP 有可能通过胎儿血液循环到达羊水，再通 过羊膜渗入母体循环，引起母体血清中的 AFP 显著升高。因此通过检测孕妇血 9 清中 AFP 浓度可以进行神经管缺陷的产前筛查，可以检出 8090%的开放性神 经管缺陷。在英国，由于开展了神经管缺陷胎儿血清筛查，其神经管缺陷胎儿 的出生率从 1960 年的 1/350 降至 1987 年的 1/2500,下降了 86。结果说明 AFP 是一个很有效的神经管缺陷筛查指标（一般2.5MOM，它在筛查胎儿神经管 缺陷中的作用是其它标志物无法替代的） 。 四、四、18-18-三体综合征的产前筛查三体综合征的产前筛查 18 三体综合征可以用孕妇血清联合筛查，怀有 18 三体综合征胎儿的孕妇 孕中期血清 hCG、AFP 和 uE3水平降低，以 AFP0.75MOM；hCG0.55MOM；uE30.60MOM 为切割值，18 三体综合征胎儿阳 性检出率可达出 6080%。 五、产前筛查血清标志物的联合应用五、产前筛查血清标志物的联合应用 产前筛查各种不同血清标志物筛查特性见表 6。 表 6 各种不同血清标志物筛查特性 血清标志 物来源 适用孕 周阳性表现 阳性检出 率筛查胎儿缺陷使用评价 AFP 胎肝 1521 21 三体 ， NTDs30% 各种三体综合征， NTDs 作用肯定， 普遍应用 -hCG 胎盘 821 21 三体 51% 各种三体综合征 作用肯定， 普遍应用 uE3 胎儿肾上腺， 肝脏，胎盘 1421 21 三体 30% 各种三体综合征 作用有争议， 应用较普遍 PAPP-A胎盘合体滋养层 814 21 三体 54% 各种三体综合征 作用肯定， 普遍应用 INHA 胎盘合体滋养层， 黄体 1421 21 三体 41% 各种三体综合征 作用有争议， 应用渐增多 21 三体综合征：妊娠中期母血 AFP 下降，uE3下降，F-hCG 上升（三联 筛查方法） 。PAPP-A 和 F-hCG 在妊娠 10 周左右有较大价值，PAPP-A 下降， F-hCG 上升，检出率达 63%，这个组合已成为孕早期筛查最佳组合。有学者 认为四联筛查方法（AFP，uE3，F-hCG，INHA）的检出率优于三联筛查方法。 神经管缺陷：孕早期母血 AFP 和 F-hCG 正常，PAPP-A 下降；孕中、晚 10 期 PAPP-A 明显下降，AFP 上升。 18 三体综合征（Edward 综合征）：PAPP-A 和 F-hCG 具有孕早期筛查 18 三体综合征的价值，母血 F-hCG 和 PAPP-A 下降；孕中期，18 三体综合征母 血 AFP 下降，uE3下降，F-hCG 下降。 13 三体综合征（Patau 综合征）：血清标志物变化与是否合并神经管缺陷 有关。 Turner 综合征：妊娠中期 uE3下降，AFP 改变不明显或增高。如有胎儿非 免疫性水肿 hCG 上升，否则 hCG 下降。 染色体三倍体：当为 69 条染色体时，血清标志物变化各不相同，一般认为 AFP 上升，uE3下降，F-hCG 或高或低。 死胎：孕早期和孕中、晚期死胎，母血 F-hCG 和 PAPP-A 均明显下降 （胎盘功能破坏） ，而 AFP 升高（胎肝合成的 AFP 溢漏） 。 多胎：AFP、uE3、F-hCG 均升高。 六、产前血清标志物筛查的影响因素六、产前血清标志物筛查的影响因素 影响血清标志物的因素较多，易造成假阳性或假阴性，需采取措施予以纠 正。1孕周估计误差：妊娠周龄对筛查结果计算十分重要，计算方法有两种： 由末次月经（LMP）日期来推算，这种方法对月经周期规律者较好，但对月经周 期不规则者不适用。超声波测量胎儿的双顶骨间径(BPD)是较正确的方法。当两 种方法计算怀孕天数误差超过 10 天时，则以 BPD 为准；不足十天的两法均可。 2. 多胎的影响：双胎或多胎妊娠时，血清生化指标明显高于单胎妊娠。双胎的 DS 检出率要低于单胎。 3. 孕妇体重：孕妇体重过重由于稀释作用可使 AFP、uE3、hCG 水平降低。 4. 母亲自身疾病：孕妇患有一些其他疾病时，可影响生化指标。如孕妇为胰岛 素依赖性糖尿病时，母血清 AFP 比正常同孕周孕妇低 20%，而 uE3 和 hCG 水平 升高。 5. 母亲吸烟：孕妇吸烟使 AFP 升高 3%，hCG 降低 3%，uE3 降低 23%。 6. 种族差异：不同种族的人群正常值不同，AFP 在亚洲及黑人的水平较西班牙 人和白种人高，hCG 在非裔美国人中较高。因此，不同种族人群应建立自己的 正常值 11 7. IVF 与自然妊娠相比，hCG 明显升高而 AFP 明显降低。 七、产前筛查流程七、产前筛查流程 产前筛查流程：（遗传咨询） ，收集资料，采集血样，检测，风险评估，报 告结果，病例追踪，遗传咨询，存档。如图 6、图 7 与图 8。 图 6 产前筛查流程图 图 7 唐氏综合征（DS）产前筛查流程图 12 图 8 神经管缺陷（NTD）产前筛查流程图 八、产前筛查时间分辨荧光免疫分析法实验操作常规八、产前筛查时间分辨荧光免疫分析法实验操作常规 1.1. 时间分辨荧光免疫分析法试剂盒检测原理：时间分辨荧光免疫分析法试剂盒检测原理：目前已应用的有标记抗原与 未标记抗原（待测或标准品）竞争结合抗体的竞争法、固相抗原与游离抗原 （待测或标准品）竞争结合标记抗体的竞争法和固相双位点夹心法等。应用较 多的为固相双位点夹心法，如夹心一步法和夹心两步法。方法简便，可以得到 满意的灵敏度和特异性，批间批内变异系数小，精密度高。TR-FIA 夹心两步法 的检测示意图如图 9。 图 9 TR-FIA 夹心两步法的检测示意图 2.2. 时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程：时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程：如图 10。 13 实验室质 量控制 采用 TRFIA 试剂二联法 AFP+HCG（F-HCG） 报告唐氏综合征风险率及神经管缺陷的风险率。 筛查项目及实 验步骤简介 （详见说明书） 目的: 保证每个孕妇样本的测定结果的稳定性、可靠性 手段: 1. 室间质评系统误差准确度 2. 室内质控随机误差精密度 室内质控是实验室质量控制的基础,提高常规测 定工作的批间、批内标本检测结果的一致性。 实实 验验 室室 检检 测测 系统误差原因分析系统误差原因分析 1、样本采集及方法或试剂分配器（加样枪）不正确 的调整； 2、实验区域不恰当温度/湿度水平； 3、试剂或校准物批号改变； 4、使用、保存或运输过程中试剂变质； 5、使用、保存或运输过程中校准物变质； 6、使用、保存或运输过程中质控物变质； 7、控制物非正确处理（冰冻） ； 8、在无霜冰箱中控制无不恰当的保存； 9、在实验系统中使用非试剂级别的水； 10、仪器滤光片轮脏或光源减弱； 11、仪器设备近来校准； 12、实验操作人员变换。 “室内室内”质控失控情况处理及原因分析质控失控情况处理及原因分析 1、填写失控报告单上报实验室负责人。 2、由负责人作出是否发报告的决定。 3、分析失控原因 重做同一质控物（人为差错、偶然误差） 新开一瓶质控物（质控物使用、保管） 重新校准（校准错误） 进行仪器维护，更换试剂（仪器、试剂） 请专家帮助 4、完成失控报告单 主要实验步骤主要实验步骤 试剂盒复温 标记物的稀释 加样 加入标记物工作液 振荡孵育 洗涤反应板 加入增强液 仪器检测 图 10 时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程 14 3.3. 仪器操作流程与注意事项仪器操作流程与注意事项 仪器操作流程：仪器操作流程：开机软件注册软件登录软件使用（进入测试模块 选择实验项目新建测试板孔测试拟合分析）退出软件关机填写 仪器操作记录 ，具体操作如下： 1. 打开半自动时间分辨荧光免疫分析仪(后下方绿色按键)仪器后面电源开关， 再按下泰莱-I 前面的白色按键启动计算机。 2. 打开半自动时间分辨荧光免疫分析仪右边的测试电源开关(绿色按键) 3. 打开电脑桌面 TALENT-I 图标，进入软件登录界面. 4. 在登录界面中输入登录编号“1” ，再输入登录密码“1”. 5. 在进入半自动时间分辨荧光免疫分析仪软件主界面后，按如下指示操作： 屏幕显示具体操作 界面右边显示“测试，报告，质控， 历史，设置” 点击“测试” ，进入下一界面 界面左上方显示编号，项目类型， 项目名称 如：1.类型：甲状腺类 2.名称：T3 选择项目类型和项目名称后，进入右边新 建测试界面，并选择最后一块板的结束孔 位，点“确定” ，系统自动产生实验批号 和实验板号，点“板孔测试” 界面右边显示您所要测试的蓝色背 景试管摆放图 点界面右下角的“测试” ，仪器开始测试， 测试完后点“板孔设定” 显示“设定为标准品” ， “设定为质 控” ， “设定为样品”. 填入试管摆放起始位.如第几排第几管.若 做曲线，需点击“设定为标准品” ，并选 好“复管数” ；若做质控，则点击“设定 为质控”并选好高，中，低三种类型.在 “设定为样品”一栏中，选好样品的起始 位置，输入样品数，用 1 到 N 表示.每完 成一项请点击“确定”. 完成上述步骤后,点击“拟合分析”, 界面右边显示有“拟合,曲线,结果, 打印,保存”,中下边有“使用自测 标准点进行拟合或校准” 在“使用自测标准点进行拟合或校准”前 打“”,即可得到测试分析后的曲线,点 击“拟合”,得到测试浓度,要看曲线分析 情况,点击“曲线”,拟合得到结果后点击 “打印”即可以打印测试结果. 6. 上述操作全部完成后,点击有整个界面右下角的“退出”,即可退出 TALENT- I 软件. 7. 关闭 TALENT-I 检测仪电脑主机部分及显示器的电源开关,然后关闭测试电 源开关,最后关闭 TALENT-I 仪器的总电源开关. 8. 填写相关记录。 注意事项：注意事项：按照上面规定的开机和关机顺序进行开关机，以免损坏设备； 15 进行具体的测量前，保证检测仪部分开机预热 30 分钟以上；出现故障时可以参 考“故障排除”一节的内容进行排除；出现不能解决的问题时，请及时与我公 司售后服务部联系。 4.4. 实验操作与注意事项：实验操作与注意事项：以 AFP 和 F-hCG 为例，见下表 7。 1）.资料收集常规 资料收集是最关键基础的一步，直接影响检测结果的分析。完整的资料包 括：孕妇姓名、出生日期、联系地址电话、孕周、体重、末次月经日期、月经 是否规则、是否吸烟、胰岛素依赖型糖尿病、曾出生先天愚型、双胞胎。还有 采样日期，因为绝大部分是采用末次月经来推断孕周的。 影响因素与建议：对于月经不规则的孕妇，为了得到准确的孕周信息，要 求其做 B 超确定孕周。必须要有孕妇的签名，规避潜在的危险。个体差异可能 导致漏检。 2）. 血样采集常规 采集时间：孕早期：7-13 周；孕中期：14-21 周。采集的量：3-5 毫升静 脉血即可。标本保存：分离血清，4可保存 5 天左右；条件允许-20冷冻保 存。 影响因素与建议：（1）标本中的 hCG 随时间延长和温度增高会分解为 亚基和 亚基。由于游离的 亚基在血清中含量非常低，分解出来的 亚基 会在很大程度上影响 亚基的检测水平，而对完整的 hCG 的影响则相对较小。 因此用 亚基作为指标有可能增加假阳性率。为此实验室在运输或保存标本时 要近量避免温度的升高。有学者研究表明，30 6h 或 35 2h 即可使项目浓 度明显提高，血标本应及时分离（采用 3000rpm 6min 以上或 2000rpm 15min） ， 分析时室温较高且标本较多，建议将标本置于泠水浴中。 （2）本试剂采用的是 一步法，不能采用血浆标本，EDTA、柠檬酸盐等螯合剂会影响铕标记的稳定性， 使荧光值偏低。 （3）标本避免反复冻融，会使检测物质活性（效价）降低。对溶血、黄疸、脂 血等标本应在报告单上注明，特别含大量脂质、严重黄疸及溶血或加热灭活之 标本均可能影响检测结果，可建议重新采血。已稀释的血清不宜存放，稀释样 本应先加稀释液，再加样本，避免非特异性吸附。 3）. 试剂准备 （1）微孔反应板：将试剂及所需数量的微孔反应板条平衡至室温 16 （2025） 。余下的微孔板条及时置入自封袋密闭并于 28保存。 （2）洗涤液：将 40ml 浓缩洗液和 960ml 蒸馏水在干净的容器中混合，作 为工作洗涤液备用。蒸馏水敬请用户自备。 （3）标记物工作液：使用前配制，将 hAFP 或 F-hCG 标记物与实验缓冲 液按体积比 1：100 加进洁净的一次性容器中并混匀，当次试验用完。 影响因素与建议：（1）免疫反应受温度影响，在一定范围内随温度的提高， 反应加快。平衡温度可保证实验反应的均一性。 （2）配置试剂采用去离子水或 蒸馏水，避免酸、乙醇、螯合剂、氧化消毒剂等物质混入。 （3）准确配制洗液， 洗液中 Tween20 浓度高于 0.2%，可使包被于固相上的抗原、抗体解吸附而影响 实验测定下限。 （4）标记物工作液要在使用前配制，容器洁净，充分混匀，避 免水分挥发和污染（避免标记物的挥发造成实验室污染,导致本底过高） 。 4）. 加样 准确吸取 25l 的 hAFP 或 F-hCG 标准品标准品（Std） 、待测样本(Unk)， 依次加入微孔反应板微孔中。 影响因素与建议：（1）建议每次实验必须做标准曲线，待测样本作复孔检 测。标准品复溶后 28可以保存 6 天；如长期保存请在20存放，并避免 反复冻融。 （2）试剂要混匀，不可剧烈颠倒。加样枪要定时校准，在万分之一 天平上误差10%。加样枪按钮压至第一档垂直握持，使吸嘴浸入液体，浸入深 度:20ul 和 10ul1mm,100ul2-3mm，200ul 和 1000 ul2-4mm，5000ul3- 6mm，10000ul5-7mm，避免枪头外残留过多，导致结果偏高。加样要准确一致， 不可产生气泡、溅出，移液枪头要一次性使用，避免交叉污染，干吸头预先在 血清中反复抽吸三次，保证吸样量准确，吸嘴要伸入反应孔底部 1/4-1/3 处加 样，停靠 5s，避免样本在反应孔上部滞留，导致非特异性吸附。使用连续加样 枪，按常规速度和程序，重复吸加 10 次，计算误差率 50ulCV1.5%，100ulCV1.0%，1000ulCV0.8%。定期进行定标，超标时予以 更换。 5）.加铕标记物 向每孔中加入 200l 已配好的标记物工作液，并加贴封片。 影响因素与建议：一定要贴加封片，防止液体挥发和污染（避免标记物的 挥发造成实验室污染,导致本底过高） 。对于同一批实验，使用同样的标记物， 否则影响批内重复性和准确性。接触过标记物的吸头、测量完的板等含标记物 17 的物品要及时清理抛弃。 6）. 孵育 微孔反应板条在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育（AFP（1 小时） ，HCG（一 个半小时） ） 。 影响因素与建议：（1）振荡器缓慢振荡孵育，缓慢振荡可加快反应，使反 应反应完全，但振荡过快容易产生气泡或使液体溅出，影响测定结果。 （2）严 格讲，试剂与标本间，它们产生的基质效应是不可避免的。所以不可随便更改 反应时间，如果反应时间不够，有可能导致样本反应不充分，影响检测下限。 不可随便更改反应温度，室内实验温度要保证在1内，否则会影响结果天间 的重复性。 7）. 洗板 孵育结束后，小心将封片揭下并弃掉，用洗板机洗涤 6 次，拍干。 影响因素与建议：（1）不可重复使用封片，避免交叉污染。 （2）洗板机洗 涤后拍干，保证微孔残留液应2l，避免干扰结果。洗板机要定时消毒、清洁， 洗板时要注意观察是否加满洗液，是否洗尽。洗板结束后，不要马上关闭洗板 机，使用 RINSE 命令冲洗管道。保持管道通畅，及时倾倒废液，保证有足够的 洗液和蒸馏水，以免出现真空错误。对于同一批实验，请保证置于相同的实验 条件下，如同样的洗液。 8）.加增强液 向每孔中加入增强液 200l。 影响因素与建议：取增强液时，请采用中间过渡容器，请使用新吸头。加 入过程中应悬空，避免吸头触及小孔内壁或其中的试剂，否则交叉污染，导致 严重错误结果。 9）.解离-增强 微孔反应板条于室温下缓慢振荡 5 分钟后上机检测，在 30 分钟内完成检测。 影响因素与建议：一定要贴加封片，防止液体挥发和污染（尘土中可能含 有的稀土元素会影响试验结果，否则结果可能升高） 。 分析仪器不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在 15-30，使用 前先预热仪器 15-30 分钟，测读结果更稳定。还必须注意仪器的开关机。 10）.结果分析 18 影响因素与建议：（1）严格使用 TRFIA F-hCG 测定程序，及时修改参数 和数据处理模式