医学ppt课件大全体液蛋白质检验

体 液 蛋 白 质 检 验 医学检验系 临床生物化学检验教研室 n本章内容概要： 第二节 体液蛋白质测定 第一节 概述 第一节 概述 血浆蛋白质的研究在以下几个领域进展迅速： 1. 各种血浆蛋白质的合成、降解、转换更新和代谢调节 2. 各种血浆蛋白质生理功能的进一步研究。 3. 血浆蛋白质的遗传变异，通过它了解人群与家族遗传特征 。 4. 以新技术对血浆蛋白质进行微量和特异检测分析。 5. 在进化与个体发育的生化研究中，发现不少正常胎儿期蛋 白可以在恶性肿瘤病人重新出现。 6. 血浆蛋白质在实际工作中广泛用于组织与细胞培养。 7. 在动脉粥样硬化及肿瘤等发病学研究中对血浆蛋白质有广 泛涉及。 一 血浆蛋白质的组成、功能及分类 （一）组成 （二）功能 可概括为： 1营养作用 2 维持血浆胶体渗透压 3维持血浆正常pH值 4运输作用 5免疫与防御功能 6催化作用 7代谢调控 8凝血、抗凝血及纤溶作用等。 （三）分类 盐析法：白蛋白和球蛋白 电泳 ：白蛋白、1、2、球蛋白 正常参考值： 白蛋白：57-68% 1球蛋白：1.0-5.7% 2球蛋白：4.9-11.2% 球蛋白：7-13% 球蛋白：9.8-18.2% 1球蛋白： 2球蛋白： 2 p 球蛋白： 3， 2 -m Fg 球蛋白： Ig(IgM,IgA,IgG) CRP 功能分类: 二、个别血浆蛋白质的理化性质、功能与临床意义 (一)前白蛋白(prealbumin PA) 来源：肝细胞合成。 理化性质：MW5.4万，因pH 8.6时电泳位于白蛋白之 前而得名，半寿期12h。 临床意义：了解蛋白质营养不良和肝功不全的指标 。 营养不良：200-400mg/L为正常；35g/L为正常；34g/L为缺乏； 21g/L为严重缺乏。 2. 影响许多配体血循环存在形式。 3. 监测脱水的一项指标。 4. 低白蛋白血症为临床常见。 5. 白蛋白遗传性变异。 (三)1-抗胰蛋白酶(1-antitrypsin 1AT) 理化性质：MW5.5万，是1区带中主要成分，含糖10-12%。 功能：具有蛋白酶抑制作用，占血清中抑制蛋白酶活力的 90%左右，主要是对抗由多形核白细胞吞噬作用时释 放的溶酶体蛋白水解酶，其作用具明显pH依赖性，中 性/弱碱性环境中活力大，pH4.5时活性基本丧失，属 APR。 遗传分型： 分离鉴定33种等位基因，最多见PiMM型，另有PiZZ、 PiSS、PiSZ、PiMZ、PiMS等。 临床意义： 低血浆AAT见于胎儿呼吸窘迫综合征； M型AAT缺陷时，蛋白水解酶的过度作用损伤组织 弹性纤维，可导致肺气肿，肝硬化等。 (四)1-酸性糖蛋白 (1-acid glycoprtein AAG) 理化性质：MW近4万，含糖45% ，PI 2.73.5。 来源：肝及某些肿瘤组织；脓毒症时粒/单核细胞。 功能：APR，急性炎症时显著升高，与免疫防御有关 。 临床意义：作为急性时相反应指标，炎症、风湿病、 恶性肿瘤心肌梗死等上升；营养不良，严重肝损害等 下降。 (五) 甲胎蛋白(1-fetoprotein AFP) 来源：胎儿肝 理化性质：MW6.9万，胎儿期占血浆蛋白总量1/3，出生时为 5mg/L，周岁接近成人水平(低于10g/L)。 临床意义： 1. 产妇羊水或母体血浆AFP用于胎儿产前监测：高于正常提 示可能有开放性神经管缺陷、无脑儿、脐膨出、先天性 食管闭锁等。 2. 成人AFP用于肝癌，生殖细胞癌等监测(返祖现象)， 是原发性肝癌最灵敏特异的肿瘤标志物。 (六) 结合珠蛋白 （haptoglotin Hp） 理化性质：电泳中属2 区带球蛋白，分子为22 两对肽链四聚体。 遗传分型：链有1和2两型，1又有1F和1S 两种遗传分型，由1F、1S、2三种等位基因编码 形成聚合体使个体存在多种遗传表现型，又决 定了不同遗传表现型个体血浆中Hp性质上差异。 功能： 1.与红细胞中释出的自由形式存在的血红蛋白不可 逆结合，Hp-Hb转运至肝降解，重新利用氨基酸 和铁，可防止Hb从肾丢失，为机体有效保留铁。 2. 属APR。 临床意义： 监测急性时相反应和溶血是否处于进行状态，溶血 时因血红蛋白大量释出，Hp下降。 (七) 2-巨球蛋白 (2-macroglobin 2MG) 来源：肝细胞和单核吞噬细胞系统合成。 理化性质：MW62.5-80万,含糖8%，血浆蛋白中分子量最大, 由4个亚基单位组成。 功能：可与多种分子与离子结合，与许多蛋白水解酶结合而 影响酶活性，是血浆中主要的蛋白酶抑制剂。 临床意义：在低白蛋白血症、 妊娠期及口服避孕药 等情况下可见升高。 (八) 铜蓝蛋白(ceruloplasmin CER) 理化性质：主要由肝细胞合成，分子量12-16万，含铜而呈 蓝色，属2球蛋白。 功能： 1 具氧化酶活性，催化多酸及多胺类底物氧化。 2 铜代谢库，血液中CER可视为铜的无毒代谢库。 3 抗氧化剂作用，减少组织中脂质过氧化物及自由基的生成 。 4 APR。 临床意义： 在感染、创伤、肿瘤时升高； Wilson病（肝豆状核变性，主要因体内铜代谢障碍所致）时 血浆CER明显下降；严重肝、肾疾病及妊娠期时下降。 (九) 转铁蛋白(transferrin TRF) 来源：肝细胞及MPS合成。 理化性质：Mw7.7万，单链糖蛋白，半寿期7天。 功能：血浆中主要含铁蛋白，负责以TRF-Fe形式运载消化 道吸收及红细胞降解的铁至骨髓再利用合成血红蛋白。 临床意义： 1. 用于贫血诊断和对治疗的监测。 IDA时TRF升高，但铁饱和度下降； 铁利用障碍性贫血时，TRF正常下降，但铁饱和度升高。 2. 急性时相反应时下降。 3. 妊娠或服用雌激素时升高。 (十) 2-微球蛋白 (2-microglobwlin BMG) 来源：由细胞合成，存在于所有有核细胞表面 ，尤其淋巴/肿瘤细胞，并释放入血。 理化性质：Mw 11800，半寿期107min，人类白细胞 抗原的轻链部分，分子内含一对二硫链。因其分子 量小，可自由透过肾小球滤过膜，但在肾小管近曲 约99被重吸收。 临床意义：在肾功衰竭、炎症及肿瘤时血浆浓度上 升，主要用于监测肾小管功能，也是一种恶性肿瘤 标志物。 (十一) C-反应蛋白 (C-reactive protein CRP) 来源：肝细胞。 理化性质 MW11.5-14万，5个多肽链亚单位非共价 结合为盘形多聚体，电泳位于慢带，有时可延伸 至区带。 功能：可以和肺炎链球菌多糖结合，结合多种 细菌，真菌等体内多糖物质及卵磷脂、核酸等，激 活补体系统，是第一个被认定的APR. 临床意义：作为急性时相反应的一个极灵敏指标。 三、疾病时的血浆蛋白质 n急性时相反应蛋白：在急性炎症或某些组织损伤时，有些 血浆蛋白质含量会增高，有些会降低，这种现象称为急性时 相反应。而这些血浆蛋白质被称为急性时相反应蛋白。 （一）关于急性时相蛋白 (acute phase reactants, APR) 前述除了甲胎蛋白、2 微球蛋白和 2-巨球蛋白以 外再加上纤维蛋白原的九种蛋白质 n急性时相反应蛋白分类： 升高：其他种蛋白质。 降低：前白蛋白、白蛋白、转铁蛋白 产生机制 临床意义： 机体处于炎症，损伤状态时，以上血浆APR出现一系列特征 变化，与炎症创伤的时间进程具有相关性，可用以鉴别急， 亚急性及慢性病理状态与病理损伤性质范围。 长期炎症: Alb 1抗胰蛋白酶 血浆铜蓝蛋白 结合珠蛋白 C3 C反应蛋白 浆细胞瘤 风湿病 TP 100% Alb 41.6() 1 5.6 (N) 2 12.0 () 13.0 (N) 27.8 ()（IgA、IgG、IgM，特征性变化 ） 第二节 体液蛋白质检测 蛋白质的测定一般基于以下四种蛋白质的性质： 重复的肽链结构 酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂紫外光吸收 与色素的结合能力 沉淀后借助浊度或光折射测定 一 血清总蛋白质测定 1凯氏定氧法参考标准方法 结果较准确，是蛋白质测定的参考方法，但操作复 杂，影响因素较多，不适用于日常工作，多用于标 准蛋白的标定及校正其它的常规方法。 1.凯氏定氮法参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro) 消化 用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时） 蒸馏 用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发； 吸收 用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使H+ ） 滴定 用已标定的无机酸滴（使H+ 恢复），计算总氮量 定蛋白（总氮量-非蛋白氮）6.25=蛋白含量 纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含 量成正比。 n原理： 2双缩脲比色法血浆总蛋白测定推荐方法 蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性条件下与Cu2+络合 成紫红色化合物，产生的颜色在一定范围内与蛋白 质含量成正比。此反应和二分子尿素缩合后的产物 双缩脲（ H2N-CO-NH-CO-NH2）与碱性铜溶液作用形 成紫红色化合物的反应相似，故称为双缩脲反应。 此方法简便、准确、重复性好，但灵敏度较其它方 法稍差，是目前临床上最常规的方法。 2.双缩脲法 n原理： 蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。 条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反 应,三肽以上才能反应。 双缩脲生成 加热 NH3 2 2 H 1800 2 2 2 2 2 N 端 C 端 3.酚试剂法 n原理： 蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂 中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物， Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了 呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。 n评价及应用： 优点：操作简单，改良法灵敏度高（10g-60g），适合 测定蛋白含量少的标本。 缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定 单一蛋白质。受一些药物干扰。 4.紫外分光光度法 蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋 白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免 核酸干扰。 （1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 A 280 - 0.74 A 260 （2）Warburg-Christian 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55 A 280 - 0.76 A 260 n原理： n评价及应用： 优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶 和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。 缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm 测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确 性和特异性受影响。 措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000- 2000倍可消除干扰。 5.染料结合法 在酸性环境下，带正电的蛋白质（NH3+)与染料的阴离子 产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比 色测定。 n原理： 常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等 n评价及应用： 优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。 缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确 定。 6.比浊法 n原理： n评价及应用： 优点：简便不需特殊仪器。 缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋 白絮状沉淀等） 某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀 ，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。 p参考范围：成人6080g/L p临床意义： 总蛋白升高： 总蛋白降低：丢失过多 消耗增加 白蛋白合成减少 水肿 真性升高：MM、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病等 假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高， A/G几乎不变 7.折光测定法 溶解在溶液中的固体可增加溶液的光折射率，在固定 波长和温度下，光折射率和血清中蛋白质含量成正比。 n原理： n评价及应用： 优点：简便、快速，易掌握，重复性较好，适合临床急诊，体检筛查和 胸腹水蛋白质测定。 缺点：准确性较差，易受高血脂症，高胆红素血症以及溶血等因素影响 ，会由于A/G比值变化而产生误差。 临床意义 1 升高：MM、巨球蛋白血症、冷沉淀球蛋白血症； 另外，当由于机体失水引起的血液浓缩而导致的升 高时，总蛋白含量相对增高，但白球比变化不大， 称假阳性蛋白增多症。 2 降低：多反映合成减少或蛋白质丢失，如肾病综 合征、胃肠道疾病、严重烧伤等；长期营养不良及 消耗增加；各种慢性疾病时蛋白质合成减少；各种 原因引起的体内水分过多等。 二、血清白蛋白测定 p方法： 1.染料结合法( 推荐) 2.盐析法 3.电泳法 4.免疫化学法 1.染料结合法( 推荐) n原理: 血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种 有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与 GLB的情况下直接测定ALB。 染料 BCG BCP 优点 缺点 易于和非人源性白蛋白结合 与白蛋白结合特异性较差 与非人源性白蛋白结合力弱 与白蛋白结合特异性好 在30秒内测可提高特异性 n应用及评价: 严格控制反应时间的BCG法既适合手工也适合自动 化分析。临床上推荐使用。 n原理: 盐析是由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电 荷从而使蛋白质分子聚集而沉淀析出。 各种蛋白质的亲水性和带电荷不同，故盐析时所需盐浓度与pH不同。 GLB在生理pH下带电荷及水化膜比ALB少，可被较低浓度中性盐沉淀。 2.盐析法 中性盐：硫酸铵、硫酸钠等 n应及评价: 操作繁琐， 不宜自动化，基本不用 3.电泳法 n操作： 醋纤膜电泳 染色晾干透明 光密度仪扫描 洗脱比色染色分离 测得蛋白组分百分比计算得出各种蛋白质含量 半定量定量 n评价及应用： 优点：电泳特异性好，可了解血清蛋白质全貌 缺点：电泳技术繁琐，不易自动化；白蛋白与染料 亲和力高会导致结果偏高 4.免疫化学法 n原理及特点: n应用：特异性高,但成本较高,费时,生化检验用的不多. p参考范围:成人3555g/L. p临床意义： 白蛋白升高： 白蛋白降低：丢失过多 消耗增加 白蛋白合成减少 水肿 先天性ALB缺乏病 真性升高：未见 假性升高：机体明显失水，或治疗输入过多白蛋白 三、血清球蛋白测定 p方法： 间接法:TP-ALB=GLB 直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸远大于ALB中的色氨酸含量) 色氨酸+乙醛酸 紫色化合物 H+ Hopkins-Cole反应 : p参考范围: 成人2030g/L. A/G：1.52.5 p临床意义： 球蛋白升高： 球蛋白降低：合成减少、低或无-球蛋白血症 真性升高（常见）：自身免疫性疾病、感染反 应、MM、巨球蛋白血症。 假性升高（少见）：机体明显失水。 四、血浆纤维蛋白原测定 p血浆纤维蛋白原： 结构特点：凝血因子，肝合成，MW=3.4 万，大分子糖蛋白，pI5.3，222 功能特点：参与凝血 血凝过程中的作用： 纤维蛋白原 纤维蛋白网 血凝块 纤维蛋白细丝 血液凝块构造（红色为红血球，兰色为血小板，黄色为纤维蛋白） p测定方法及特点： 1.纤维蛋白原凝块测定法： 凝血酶或钙离子 原理：纤维蛋白原 不溶的纤维蛋白凝块 含有NaCl的双缩脲试剂反应 分离 2.比浊法：MW纤维蛋白原 MW球蛋白 方法一：pH7.0时，用13.3%的硫酸胺沉淀纤维蛋白原，产生浊度 方法二：热比浊法，缓冲盐水稀释后置5615min，沉淀纤维蛋白原，450nm下比浊 应用