细胞产物分析技术3细胞产物分离方法2011课件

第三章 细胞产物分离技术 经典分离方法 色谱分离方法 样品的预处理 细胞产物的提取 细胞产物的分离 产物的分析鉴定 经典分离方法 红外光谱 紫外可见光谱 色谱分离法 质 谱 核磁共振谱 经典分离方法液-液萃取法 l利用组分在两个互不相溶的液相中的溶解度差异而 将其从一个液相转移到另一个液相的分离过程称为 液液萃取，也叫溶剂萃取，简称萃取。 l待分离的一相称为被萃相，萃取后成为萃余相，用 做分离剂的相 称为萃取相。 经典分离方法液-液萃取法 l被萃取组分在萃取相中的溶解度要大于被萃取 相。 l一般一相为水相，一相为有机相。在水相中增 加盐离子浓度可以降低有机相在水中的溶解度 。 l萃取应采用少量多次原则。 l从水相中萃取有机物质时，单级萃取时一般选 择该物质的最佳溶剂。多级萃取溶剂选择一般 从弱极性强极性。 l密度：石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丁醇、苯600m2/g 0.4ml/g 150-180m 80-100 20-30A 600m2/g 0.4ml/g 125-180m 80-120 20-30A 600m2/g 0.4ml/g 75-150m 100-200 20-30A 600m2/g 0.4ml/g 45-75m 200-300 20-30A 600m2/g 0.4ml/g 柱层层析硅胶（粗孔） 粒度 目数 平均孔径 比表面积积 孔体积积（约约 ） 180-250m 60-100 80-100A 300-400m2/g 0.8ml/g 125-180m 80-120 80-100A 300-400m2/g 0.8ml/g 75-150m 100-200 80-100A 300-400m2/g 0.8ml/g 45-75m 200-300 80-100A 300-400m2/g 0.8ml/g 色谱分离法柱色谱 l常用固定相硅胶 硅胶的吸附性能取决于硅 胶中硅醇基的数及含水量。 随着水分的增加吸附能力 降低。若吸水量超过12， 吸附力极弱，不能用做吸附色谱，只可用于分配色 谱的载体。 硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均 直接影响着色谱分离的效果。 色谱分离法柱色谱 l常用固定相硅胶 硅胶应是中性无色颗粒，由于制备过程中接触强酸常 带有酸性，故在使用前应检查其水浸液的酸度不低 于pH 5 时才可使用；否则应用水洗至中性再在 110活化24小时。 硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解性，约 为0.01。在pH=9以上，则溶解度急剧上升。 有时可以向硅胶中掺入某种试剂以改良吸附性能， 提高分离效果。通常用硝酸银处理过的硅胶对不饱 和烃类有极好的分离作用。改良吸附剂的制备一般 是将含110填加试剂的水或丙酮溶液与硅胶混 匀，稍后于110干燥即可。 色谱分离法柱色谱 l常用固定相硅胶 硅胶的再生一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂 烘干活化处理即可使用。必要时用0.5氢氧化钠 水溶液浸泡洗涤、过滤、水洗，再以510盐 酸浸泡洗涤最后用蒸馏水洗至中性，110活化， 过筛即可。 50200m的硅胶每克吸附剂承载 10 mg样品，吸 附剂每克硅胶载样30mg时只能用于被分离物质的 Rf值差别很大的情况。上样较多时可达到过滤的 目的。 色谱分离法柱色谱 l常用固定相氧化铝 色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性 氧化铝pH约为4-4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性 物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质， 应用最广；碱性氧化铝pH为9-10，用于分离生物碱 、胺和其它碱性化合物等。 吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性 越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。 色谱分离法柱色谱 l常用固定相氧化铝 常用规格：50100目、100200目、200300目 、300400目、400500目、500目以上 外观白色微球和沙状 白色微球 白色微球 粒径(m) 75 (%) 250 250 250 PH 值 4.55.5 6.57.5 8 酸碱度 酸性 中性 碱性 色谱分离法柱色谱 l常用固定相聚酰胺 由酰胺聚合而成的一类高分子物质，又 称锦纶、尼龙等，层析常用的是锦纶6 和锦纶66；其单体物质是已内酰胺、已二胺和已 二酸。分子中的酰胺键是其结构的重要部分，酰胺 键也是与其它极性键基团产生氢键的物质基础。 l是吸附层析，酰胺键与物质分子中的极性键的相互 作用应该是吸附作用的主要原因；分离物质的氢键 作用是聚酰胺层析的根本原因；但非氢键物质也可 用聚酰胺进行分离。原理目前尚未完全阐明。 色谱分离法柱色谱 l常用固定相聚酰胺 通常有两种杂质：一种是蜡质，另一种是锦纶的聚 合原料单体及其小分子聚合物。原料单体及其小分 子聚合物可与酚类物质形成复合物，而蜡质能被醇 液洗脱下来，与分离之物质混在一起则难以除去。 除去原料单体及其小分子聚合物的方法是用二甲基 甲酰胺（DMF）或DMF：醋酸：水：乙醇（5：10 ：30：20）混合液洗脱。除去蜡质的方法是用甲醇 ：二氯乙烷（1：1）混合液洗脱。 色谱分离法柱色谱 l装柱 要求:固定相的上表面一定要 平整，并且固定相的高度要根 据需要，短了可能分离效果不 好，长了也会出现扩散或拖尾 导致分离效果不好。 湿法装柱:是先把硅胶混悬于 流动相溶剂中，然后加入到装 有溶剂的柱子顶端，在保持一 定流速的条件下固定相逐渐沉 积并达到需要的高度，并始终保持一定的液面高 度，不可将柱子“走干”，最大的优点是柱子装 的比较结实，没有气泡。 色谱分离法柱色谱 l装柱 干法装柱：直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻 敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至 硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适 高度，减压抽气可以使得柱子装得结实，接着是 用洗脱剂“走柱子”，干法装柱较方便，技术要 求低，但容易产生气泡，在上样前需要用大量溶 剂淋洗才能达到湿法装柱的效果。因而相对成本 较高。 色谱分离法柱色谱 l上样 湿法上样：适合湿法的样品 是粘度不大均匀液体样品或 者在极性弱于洗脱剂的溶剂 中溶解度好的固体样品，需保证上样过程中不会析 出。 用于溶解样品的溶剂体积应越少越好。样品沿柱子 内壁于硅胶面上方0.5cm以内距离均匀地加样，加 样的速度以柱子不出现气泡为限。待所有样品上完 后，用尽可能少的溶剂洗涤样品瓶，待样品在固定 相上恰好走干后依上样法将溶液加到固定相上。 色谱分离法柱色谱 l上样 干法上样：干法就是把待分离的样品用少量低沸 点溶剂溶解后，再加入少量固定相，拌匀后再挥 干溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层 ，注意保留足够的溶剂使加入的干粉恰好能被覆 盖以防柱子开裂。此时加入的干粉层中可能会有 大量的气泡，但由于是松的，可以用玻棒稍做搅 拌以除去气泡，同样要保持硅胶表面的平整。 若担心上样及加溶剂过程中会将柱子表面弄破可 考虑在上样前先在柱子上加一层石英砂。过程中 时刻保持柱子不要干出气泡或裂纹！ 色谱分离法柱色谱 l洗脱 柱层析所用的流动相，习惯上称为 洗脱剂,可将目的组分自混合样品 中逐次分离出来。 洗脱的过程中，洗脱剂自柱上端加 入,固定相上端始终在洗脱剂溶剂不 能干，每30分钟1小时内流出的洗 脱剂体积等于所用吸附剂的重量为 宜。洗脱剂可随意变，混合过渡为重点。 根据需要分段收集，然后用薄层色谱检测。 色谱分离法柱色谱 l洗脱剂 在柱色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和洗 脱剂之间发生吸附-溶解分配，强极性洗脱剂对极 性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性洗脱剂对 极性小的有机物溶解的多，随洗脱剂的流过不同极 性的有机物以不同的次序形成分离带。 当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同 极性的溶剂分级洗脱。 如一种溶剂作为洗脱剂只 洗脱了混合物中一种化合物，对其它组分不能洗脱 ，需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样 分次用不同的洗脱剂可以将各组分分离。 色谱分离法柱色谱 加压柱色谱 l利用各种装置施加压力进行的液相色谱，压力可 高达100bar。 l可允许在分离过程中使用颗粒度更小的吸附剂， 从而获得更高的分辨率。 l可加快洗脱剂的流速缩短分离时间。在对敏感化 合物进行长时间的常压色谱分离时，化合物的结 构可能会发生转变，而缩短分离时间的最大优点 在于可以避免这种转变的发生。 色谱分离法柱色谱 加压柱色谱 l根据分离中所用压力的大小可把制备型柱色谱区 分为快速色谱（约2bar）、低压液相色谱（ bar）。中压液相色谱（520 bar）及高压液相 色谱（20 bar) 低压、中压与高压液相色谱的 压力范围之间会存在一定交叠。 l分离中所用色谱柱及固定相颗粒的大小需根据分 离的难易程度而定。一般对于难分离的样品应采 用小颗粒的固定相及稍长的色谱柱分离所需压力 也会加大。 色谱分离法柱色谱 加压柱色谱快速色谱 lStill等于1978年介绍了快速色谱技术。 l色谱分离时长时间的洗脱可造成敏感化合物的分解 并使色带脱尾，快速色谱大大缩短分离所需时间从 而避免产生上述问题。 l快速色谱中使用最广泛的固定相为硅胶。一些粒度 范围较窄的球形硅胶是专门为快速色谱而设计的。 此外也可采用具有一定粒度范围的非球形硅胶。 l硅胶快速色谱可对天然产物进行最终纯化，但更常 见的是用此方法对粗提物或混合物进行初步纯化， 然后再利用其他具有高分辨率的色谱技术进行纯化 。 色谱分离法柱色谱 加压柱色谱快速色谱 快速色谱分离装置包括一装 有活塞，长度适合的玻璃柱 。可用干法或湿法将固定相 加入其中。干法装柱效果更 好，但需用大量溶剂使固定 相完全润湿。在固定相的顶 部最好加一层沙子。 色谱分离法柱色谱 l固定相的上端应留有足够的空 间以便反复加入洗脱剂，也可 在柱顶部加一球形磨口储液槽 。 l加样后可施加高于大气压l bar 的压力以加速样品的洗脱。在 气体入口处可利用一针式阀门 控制压缩气体的流速。 l利用不同尺寸的色谱柱对 0.0110.0g样品所进行的分离 通常可在15min内完成。 加压柱色谱快速色谱 色谱分离法柱色谱 l使用最广泛的低压液相色谱系统是E Merck公司生 产的Lobar柱系列产品，一般与其他分离方法结合 起来使用，将其用作中间或最后的纯化手段。 l预制色谱柱是由玻璃制成，色谱柱中的固定相被柱 两端的熔融玻璃封闭。色谱柱两端连有聚四氯乙烯 环的金属管可与输液泵相连，金属管及聚四氯乙烯 环被柱端的旋钮固定于柱体。 加压柱色谱低压柱色谱 色谱分离法柱色谱 l因分离过程中需使用输液泵一般采用组成恒定的 洗脱剂。 l利用反相Lobar RP18色谱系统从山甘草中分离得 到三萜皂苷类成分，所用溶剂系统为乙醇-水（ 1:1）和乙腈-水（1:1） 加压柱色谱低压柱色谱 色谱分离法柱色谱 加压柱色谱低压柱色谱 lLobar柱规格分为 A、B、C三种型号预制色谱往的填料有 硅胶、RP18、RP-8、NH2-、CN-及diol键合相硅胶等。 色谱分离法柱色谱 加压柱色谱中压柱色谱 lLobar色谱分离系统具有使用方便，分辨率较高的 优点。然而，用这些色谱柱难以分离5g以上的样 品。 l中压液相色谱可采用更长、具有更大内径的色谱 柱，可以一次性分离更多的样品。 l中压液相色谱比低压液波相色谱使用的填料颗粒 度更小，分辨率更高，需使用更大的压力来维持 适当的流速所需 l压力可由压缩空气或往复泵提供。先利用分析型 HPLC可以十分有效地选择适当的溶剂系统。 色谱分离法柱色谱 加压柱色谱中压柱色谱 l中压色谱柱可用于分离100 mg至100g的样品。 l活塞泵及可替换泵头可在最大压力为 40 bar时， 使流速在 3160 mLmin 之间调节。 l该系统接有溶 剂梯度形成装置 并可用各种紫外 检测仪检测。 l柱体大小可从 130 mL直至 1880 mL。 色谱分离法柱色谱 加压柱色谱中压柱色谱 l该系统的色谱柱由带有塑料保护膜的强化玻璃制 成，因此可以观测到分离的进展情况。 l可以将色谱柱连接起来使用以提高分离能力。 l可以用干法或湿法装柱。与湿法装柱相比，干法 装柱可使固定相填充密度提高20。最大承受压 力只有40 bar，但使用颗粒度为 15 m 的固定相 可以获得同HPLC柱类似的分离效果。 色谱分离法柱色谱 加压柱色谱中压柱色谱 应用键合相固定相时应采用湿法装柱。可以用注射 器将样品直接加到色谱柱上或使用进样器进样。如 在色谱柱前连接一小的样品柱，也可以采用固体上 样法。 l在制备型色谱柱前连一前置柱，在每次分离后将被 污染的填料除去，利用甲醇乙酸乙酯已烷的冲 洗顺序对硅胶固定相进行再生。但在重复使用几次 之后，应将固定相废弃。 l键合相色谱柱更易于清洗井具有更长的使用寿命。 l分离中多数采用的是硅胶或反相硅胶固定相但有时 也采用聚酰胺或纤维素 色谱分离法柱色谱 减压柱色谱 是利用真空为动力来加速流动相流经固定相的一种 色谱分离方法。可用减压液相色谱法替代快速色谱 法在进行高压液相色谱及其他复杂分离之前对植物 提取物进行初步分离。 与制备薄层色谱和快速色谱相比，设备简单，分离 全程短，有较理想的分离度，分离容量大。 类似于制备型薄层色谱，在完成一次展开、干燥后 ，还可再次对之进行展开。已有多种吸附剂被尝试 用于减压液相色谱分离，其中包括硅胶、氧化铝、 聚酰胺及健合相硅胶等。例如： 用减压液相色谱法 分离姜（Zingiber officinale）中的辛辣成分，可将 姜醇与姜烯酚完全分开。 色谱分离法柱色谱 减压柱色谱 操作方式是在一装有熔融玻璃（1020 m，D型 孔径或2号孔径）的短住或布氏漏斗中干法加入吸 附剂（1040m薄层色谱用吸附剂，如Merck硅胶 60H或60G），轻轻敲击装置，使吸附剂在重力作 用下沉降。然后通过三通活塞抽真空并用一橡皮塞 压紧吸附剂，直至吸附剂变得坚硬。放气之后，快 速向吸附剂的表面加入低极性的溶剂，并继续抽真 空。当溶剂流经全部柱体后。将柱抽干，即可准备 上样。可将样品溶于适当的溶剂中直接加在柱上部 ，然后减压小心地将样品抽入吸附剂。 色谱分离法柱色谱 减压液相色谱 另外也可将样品先吸附于硅胶、氧化铝或硅藻土 上。洗脱剂的选择应适当先用低极性溶剂，然后 再逐渐增大溶剂极性在收集每份馏分后将柱体 抽干（可减少馏分之间的相互交叉）。已有多种 吸附剂被尝试用于减压液相色谱分离，其中包括 硅胶、氧化铝、聚酰胺及健合相硅胶等。 减压液相色谱不同于快速柱色谱，因该方法在收 集每份馏分后允许色谱柱流干。 减压液相色谱因其操作简便、分离速度快、分辨 率高而在天然产物研究中获得广泛应用。 色谱分离法柱色谱 干柱色谱 将干的吸附剂装入色谱柱中，待分离的样品配成 浓溶液或吸附于少量填料上，然后上样。洗脱液 依靠毛细作用流经色谱柱，当接近色谱柱底部时 ，停止洗脱，将吸附剂从柱中挖出用适当的溶剂 将各色带中的成分洗出的色谱操作方法。 在干柱色谱中，没有洗脱液从色谱柱流出，色带 明显分开，耗时短且节省溶剂。 可利用具有相同吸附剂的分析型薄层色谱来推测 干柱色谱分离的效果。 色谱分离法柱色谱 干柱色谱 实际上只是制备型薄层色谱形式上的变化，具有相 同的分辨能力。 先利用薄层色谱选择最佳的溶剂系统，然后进行干 柱色谱分离。在使用混合溶剂系统进行干柱色谱分 离时，可能达不到分析型薄层色谱所显示的分辨力 ，这时可在装柱前用10的流动相对干柱的吸附剂 进行预饱和。 最佳的干柱是尼龙柱。根据展开的色带位置，可用 刀将色谱柱或管切成若干段，然后把被分开的化合 物用溶剂提取出来并进行过滤。尼龙柱的另一优点 是可在紫外灯下观测到无色的色带，以此来指导切 割。 色谱分离法柱色谱 干柱色谱 填充剂是决定柱效的主要因素，填充剂的颗粒直 径越小直径范围越小，柱的效能越高；填装均匀 ，分离的层带才会整齐；若颗粒太小，流速减慢 ，则传质缓慢同时移动相线速度减慢，引起纵向 扩散，影响分离度；使用过长的柱会引起移动相 流速减慢及纵向扩散增加洗脱时间加长。 可增加适当的压力使流速稳定。 一般所用柱的高度不宜超过50cm直径在13cm 之间，主要决定于样品容量及吸附剂量，通常比 例在1：100以上。 色谱分离法柱色谱 干柱色谱 刘嘉森等用国产硅胶（青岛海洋化工厂产品，150 2目）进行干柱色谱。成功地分离了华中五味子 中的五味子酯乙与酯丙。同时用酸性氧化铝（120 200目，级）干柱色谱分离出五味子酯 丁。 Ai和Li将丹参根的95%乙醇提取物用几种溶剂进行 分配，对所得的一个部位（45g）用2.3kg硅胶进行 干柱色谱分离（洗脱剂为氯仿一甲醇甲酸85：15 ：1）。把色谱柱切割成16段每段吸附剂都用热甲 醇洗脱。对第13段和第14段进一步用加Sephadex LH-20纯化，得到2.06g丹参酚酸B（salvianolic acid B）。 色谱分离法薄层色谱 l又称薄层层析，属于液固吸附色谱。是一种微 量、快速而简单的色谱法。兼备了柱色谱和纸色 谱的优点，既适用于小量样品（几到几十微克， 甚至0.01g）的分离，又可用于制备（把吸附层 加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg 的样品）。 特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化 而不能用气相色谱分析的物质。 在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑 点的逐步消失来判断反应是否完成。 色谱分离法薄层色谱 l制板 选择合适的玻璃板（小板使用显微镜上的载 玻片），依次用水和乙醇洗净，晾干。取适量薄 层色谱用的固定相，加适量蒸馏水调成糊。调制时 慢慢搅拌，勿使产生气 泡。将糊倒在玻璃板上， 摇动摊平，晾干。使用前放入烘箱内，在105- 115左右烘干40-50分钟，冷却后使用。 l点样 在薄板上轻轻画出一条平行于玻璃板底 边的细线，将试样用最少量展开剂溶解， 用毛细管蘸取试样溶液，在线上点样。 在样点上薄层色谱板载样量有限，勿使 点样量过多。 色谱分离法薄层色谱 l展开 吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有 盖展开瓶中。展开剂要接触到吸附剂 下沿，但切勿接触到样点。盖上盖子 ，展开。待展开剂上行到一定高度（ 由试验确定适当的展开高度），取出 薄层板，再画出展开剂的前沿线。 l显色，计算Rf值 挥发干展开剂，选择合适的显色方法 显色。量出展开剂和各组分的移动距 离，计算各组分的相对移动值。 色谱分离法薄层色谱 色谱分离法薄层色谱 色谱分离法 薄层色谱 离心薄层色谱 l传统的薄层色谱需将 被分开的化合物色带 从薄层板上刮下，并将其从吸附剂上提取出来；分 离所需时间较长；在用溶剂对色带内化合物进行提 取后，可能混入来自于吸附剂的杂质。 l离心薄层色谱技术主要是在传统的PTLC基础上运用 离心力，促使流动相加速流经固定相。 l可用于