急性经皮毒性实验及全血胆碱ppt课件

i(LD100- LD0)/(n1) i :组距（相邻两个剂量组对数剂量之差） n ：设计的剂量组数 Smi pq/n nlgLD50及其95可信限lgLD50 1.96x Sm n雄鼠 1.6281.96 x 0.0151.6280.0294 n 42.5（39.747.1）mg/kg 急性经皮毒性实验及全血胆碱酯酶 活性的测定 实验的目的和意义 n掌握胆碱酯酶活性测定的方法原理 n了解受试物引起局部皮肤损伤、全身中毒 等毒性效应 n了解甲胺磷经皮染毒后对全血胆碱酯酶的 影响 n为进一步的实验提供参考依据 急性经皮毒性试验 n定性：浸尾试验 n定量： 一、动物的选择 成年健康大鼠 180220g 动物数 610只 二、剂量 通过预实验确定最高剂量组 氯甲胺磷经皮对大鼠LD50：2000mg/kg(经皮) 三、 受试物的配制： 本次为200mg/kg，浓度为20mg/ml 给药容积：0.1ml/100g n采血时间： n0min，30min，60min,2h,4, 全血胆碱酯酶的测定 n胆碱酯酶测定的意义 1、作为有机磷农药中毒防治的试验指南 2、为亚慢性、慢性的域剂量提供参考指标 3、解毒药的筛选 原理： AchE在PH为7.4的PBS环境中可以分解 ASCH(硫代乙酰胆碱)为硫代胆碱和乙酸， 前者进而与DTNB(5,5-联硫代双-2-硝基苯甲 酸)反应生成黄色产物TNB（5-巯基-2-硝基 苯甲酸），通过分光光度计，在412nm波长 下比色定量，得出OD值，通过标准曲线反 推AchE的活性。 硫代乙酰胆碱（ASCH） 胆碱酯酶（AchE） 硫代胆碱乙酸 +DTNB 黄色的TNB（5-巯基-2-硝基苯甲酸） 实验步骤: 1、取14只试管，分两组（样品组、对照组），样品 组每管加 PBS 3.0ml 2、动物染毒，尾尖采血（20ul)，症状观察记录 3、将不同时间点采集的血样加入（样品组）试管 中，冰浴 （立即放进冰箱） 1 2 3 4 5 6 7（第二天） 采血时间 0 15 30 1h 2h 5h 22h 4、将样品组各管混匀，分别取1.5ml到对应的对照管 中，对照组各管加1-2滴毒扁豆碱，充分混匀 5、14管中各加入0.5ml DTNB 混匀（37水浴 5min) 6、加入0.5ml的Asch充分混匀并计时 7、37水浴，标准温浴10min，每2-3min振荡 摇动一次，测定组管中加1-2滴毒扁豆碱， 充分混匀中止反应 8、14管1500转/min离心10min，取上清，412nm 比色，以自身对照调零，测A组B组的吸光 度，记录OD的值。 9、查标准曲线，计算AChE活性，作图（活性- 时间） 标准曲线的制作： 以GSH替代Asch，经反应后以分光光度计 测量OD的值，以GSH的量为横坐标，OD 的值为纵坐标，绘制标准曲线 OD值 GSH的量(umol) n10 、 标准管配置 管号 1 2 3 4 5 巯基标准 0 0.05 0.10 0.15 0.20 H2O (ml) 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 PBS (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 DTNB溶液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 OD值 n1 umol 谷胱甘肽能提供1 umol 巯基，其显色 效应相当于1 umol 的硫代胆碱，也相当于 酶促使1 umol 基质（乙酰硫代胆碱）的效 应。 nAchE活力（umol Aich/ml/min）标准曲 线查得的umol/分析血样量（ml）反应时 间（min） n酶活力单位：1ml血样在37条件下每分钟 水解1umol乙酰硫代胆碱产生1umol巯基为一 个酶活力单位 n实验结果： 1、急性经皮毒性试验 2、全血胆碱酯酶活性得测定： 用分光光度计412nm测定对照管测定管的OD值 编号 1 2 3 4 5 6 7 OD值 标曲上得 到的umol AchE活力 （umolATcH/ml/min） n作图（活性-时间曲线