多肽抗原的设计与抗体制备 ppt课件

多肽抗原的设计与抗体制多肽抗原的设计与抗体制 备备 多肽抗原的设计多肽抗原的设计 多肽的固相合成和纯化多肽的固相合成和纯化 多肽的交联和免疫多肽的交联和免疫 抗多肽抗体的检测和功能学鉴定抗多肽抗体的检测和功能学鉴定 抗体的纯化抗体的纯化 怎样利用怎样利用Internet Internet 的免费资源寻找与抗体相关的的免费资源寻找与抗体相关的 信息信息 抗合成肽类抗体制备程序 免疫原性肽的选择 肽的合成、纯化与鉴定载体蛋白的选择 连接剂的选择 载体蛋白/肽连接物 免疫动物McAb的制备ELISA筛选抗体血清反应性 收集阳性血清 Western blot, Immunofluorescence assay 鉴定抗体的生物学功能 阳性抗体的纯化 抗体制备常用的免疫原抗体制备常用的免疫原 1 1：表达纯化一段或全长的重组的带：表达纯化一段或全长的重组的带GST,HistagGST,Histag的融合蛋白的融合蛋白 Abnova corporationAbnova corporation 2 2：利用合成肽制备抗体：利用合成肽制备抗体 AVIVA SYSTEMS BIOLOGYAVIVA SYSTEMS BIOLOGY LIFESPAN BIOSCIENCES LIFESPAN BIOSCIENCES 3 3：利用纯化的天然蛋白：利用纯化的天然蛋白 免疫原性肽选择的基本程序免疫原性肽选择的基本程序 利用在线设计软件或DNAStar筛 选抗原性强的多肽序列 尽量使用N端或C端的序列 该序列经Blast后在人的其他蛋白中 同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高 度保守 用peptide companion 软件判定 易于合成的14-16个氨基酸 免疫原性肽选择的注意事项免疫原性肽选择的注意事项 避开信号肽，磷酸化，糖基化位点避开信号肽，磷酸化，糖基化位点 避开很多蛋白所共有的相同的或相近的避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,motif,例如例如zinc fingerzinc finger，SH2 SH2 domains domains ，GTP binding sites GTP binding sites 。 有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。 如果选用如果选用MBSMBS交联方法，需要在交联方法，需要在N N端或端或C C端加上端加上C C 对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcript transcript variants variants ），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多 肽肽 利用利用Swiss-ProtSwiss-Prot数据库辅助设计数据库辅助设计 UniProtKB-Swiss-Prot entry P26992 UniProtKB-Swiss-Prot entry P26992 CNTFR_HUMAN Ciliary neurotrophic CNTFR_HUMAN Ciliary neurotrophic factor receptor alpha.htmfactor receptor alpha.htm 多肽的固相合成多肽的固相合成 此法的基本过程是：此法的基本过程是：基于基于FmocFmoc化学合成，化学合成，将目标多肽的将目标多肽的C C - -端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连， 然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨 基酸的羧基（已经活化）作用（用基酸的羧基（已经活化）作用（用NMM,HBTUNMM,HBTU作偶联剂）形作偶联剂）形 成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。 合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得 到目标产物。到目标产物。 合成原料合成原料 Fmoc-AA(prot)-Wang resinFmoc-AA(prot)-Wang resin 提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质 例如：例如：Fmoc-His(Trt)-Wang resin Fmoc-His(Trt)-Wang resin ProtProt：Boc,tBu,Trt,OtBu Boc,tBu,Trt,OtBu 侧链活性位点的保护基团侧链活性位点的保护基团 Fmoc: -NH2Fmoc: -NH2保护基团：保护基团： Boc: Boc: Trt: Trt: Fmoc-AA(Prot)-OHFmoc-AA(Prot)-OH Solvent 1: DMFSolvent 1: DMF Solvent 2: 20%pipdine/DMFSolvent 2: 20%pipdine/DMF Solvent 3: 0.4M NMM/ HBTU/DMFSolvent 3: 0.4M NMM/ HBTU/DMF Solvent 4: 50% ACN/DMFSolvent 4: 50% ACN/DMF Solvent 5: methylene chlorideSolvent 5: methylene chloride Solvent 6: 94% TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2OSolvent 6: 94% TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O 标准合成程序标准合成程序 Step solvent/operation volume mix time drain RepStep solvent/operation volume mix time drain Rep 1 DMF 1 00:00:30 on 3 1 DMF 1 00:00:30 on 3 2 20%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 2 20%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 3 DMF 1 00:00:30 on 6 3 DMF 1 00:00:30 on 6 4 Reagent(AA) 1 00:00:00 off 1 4 Reagent(AA) 1 00:00:00 off 1 5 0.4M NMM/HBTU/DMF 1 00:40:00 on 1 5 0.4M NMM/HBTU/DMF 1 00:40:00 on 1 6 DMF 1 00:00:30 on 3 6 DMF 1 00:00:30 on 3 标准切割程序标准切割程序 Step solvent/operation volume mix time drain RepStep solvent/operation volume mix time drain Rep 1 DMF 1 00:00:30 on 3 1 DMF 1 00:00:30 on 3 2 20%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 2 20%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 3 DMF 1 00:00:30 on 6 3 DMF 1 00:00:30 on 6 4 methylene chloride 1 00:00:30 on 6 4 methylene chloride 1 00:00:30 on 6 5 Dry 1 00:10:00 on 1 5 Dry 1 00:10:00 on 1 6 TFA 2 02:00:00 on 1 6 TFA 2 02:00:00 on 1 7 TFA 1 00:00:30 on 1 7 TFA 1 00:00:30 on 1 8 methylene chloride 1 00:00:30 on 3 8 methylene chloride 1 00:00:30 on 3 9 Dry 1 00:02:00 on 1 9 Dry 1 00:02:00 on 1 多肽合成的一般常识多肽合成的一般常识 固相多肽合成一般最多只能合成到固相多肽合成一般最多只能合成到20aa20aa。为了保证合成的效率和纯度。为了保证合成的效率和纯度 ，我们在设计多肽抗原时，一般设计，我们在设计多肽抗原时，一般设计14-16aa14-16aa的多肽。的多肽。 减少多肽序列中多个困难性氨基酸减少多肽序列中多个困难性氨基酸Cys, Met, Arg, or TrpCys, Met, Arg, or Trp的含量。的含量。 避免多肽序列中连续避免多肽序列中连续3 3到到4 4个疏水性的氨基酸。（个疏水性的氨基酸。（Val-VVal-V，Leu-LLeu-L，Ile-Ile- I I，Met-MMet-M，Phe-FPhe-F） 避免避免Asp-ProAsp-Pro序列序列 避免多肽序列中最后一个氨基酸是避免多肽序列中最后一个氨基酸是ProPro。 PIWIL3 SR0015 FFLKHGSNFQNPPPPIWIL3 SR0015 FFLKHGSNFQNPPP Caspase 2 SR0024 TDTVEHSLDNKDGPCaspase 2 SR0024 TDTVEHSLDNKDGP Caspase 7 SR0032 DRVARHFESQSDDPCaspase 7 SR0032 DRVARHFESQSDDP 切割完以后，用乙醚沉淀什么都没有切割完以后，用乙醚沉淀什么都没有 多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序 列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。 Ago2 SR0009 IVEHMVQHFKTQIF Ago2 SR0009 IVEHMVQHFKTQIF 极难溶极难溶 DGCR8 SR0004 LHILSKLQEEMKRLDGCR8 SR0004 LHILSKLQEEMKRL TNFRSF19 SR0303 WSLRSQDIQYNGSELS TNFRSF19 SR0303 WSLRSQDIQYNGSELS 不溶于甲醇不溶于甲醇 可以用可以用peptide companion peptide companion 软件辅助判定多肽合成的难软件辅助判定多肽合成的难 易程度，但是由于该软件默认了最后四个氨基酸是容易合易程度，但是由于该软件默认了最后四个氨基酸是容易合 成的，可是有时实际情况并不如此，因此依然需要综合考成的，可是有时实际情况并不如此，因此依然需要综合考 虑虑 TIE1 SR00043 DRPEETSTIIRGLNTIE1 SR00043 DRPEETSTIIRGLN BAG4BAG4： SR00079SR00079 LRRSGYGPSDGPSYLRRSGYGPSDGPSY SR00007 Dicer GKVRVTVEVVGKGKSR00007 Dicer GKVRVTVEVVGKGK 多肽的鉴定和纯化多肽的鉴定和纯化 合成完整长度粗肽的纯度不仅取决于多肽的本身长度和序列的特异性合成完整长度粗肽的纯度不仅取决于多肽的本身长度和序列的特异性 ，还和使用的各种试剂的质量密切相关，因此我们合成多肽使用的试，还和使用的各种试剂的质量密切相关，因此我们合成多肽使用的试 剂都是色谱纯。剂都是色谱纯。 FmocFmoc固相多肽合成每个氨基酸的偶连效率在固相多肽合成每个氨基酸的偶连效率在95%95%以上。对于一个以上。对于一个15aa15aa 的粗肽，其完整长度多肽的合成效率一般在的粗肽，其完整长度多肽的合成效率一般在50%50%左右。左右。 长度长度 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 合成效率合成效率 % 9595909085858181777773736969 长度长度 % 9 9 101011111212131314141515 合成效率合成效率 % 6666626259595656535350504848 长度长度 % 1616171718181919202021212222 合成效率合成效率 % 4545434341414040373735353737 质谱分析（质谱分析（MS/ESIMS/ESI） 用途：测定合成的粗肽产物中目标肽的分子量，以此来衡量我们合成用途：测定合成的粗肽产物中目标肽的分子量，以此来衡量我们合成 的肽序列是否正确的肽序列是否正确 原理：将样品分子离子化后，根据离子间不同的质荷比（原理：将样品分子离子化后，根据离子间不同的质荷比（m/zm/z）来分）来分 离并确定分子量。离并确定分子量。 TPTETPTE SR00283: SR00283: ( (CH3CO)CH3CO)RVSENKRVSENKRRRRYTRYTRDGFCDGFC MWMW：1887.13+42=1929.131887.13+42=1929.13 TNFRSF13B SR00306 TNFRSF13B SR00306 （NH2NH2）P PE ELRRQLRRQRSGEVERSGEVENNSDNNSD MWMW：1885.991885.99 多肽粗品中一般含有非全长多肽多肽粗品中一般含有非全长多肽, ,非多肽类杂质。非多肽非多肽类杂质。非多肽 类杂质主要是指去保护过程中产生的一些保护性基团，多类杂质主要是指去保护过程中产生的一些保护性基团，多 肽裂解过程中的一些原料如肽裂解过程中的一些原料如DTTDTT、TFATFA等。等。 粗肽的一般后期纯化处理有脱盐，离子交换色谱，反相粗肽的一般后期纯化处理有脱盐，离子交换色谱，反相 HPLCHPLC。国内外的多肽公司可以根据用户要求的纯度选择不。国内外的多肽公司可以根据用户要求的纯度选择不 同的纯化方法。同的纯化方法。 多肽的纯度分析一般使用反相多肽的纯度分析一般使用反相HPLCHPLC，通常都能得到较好的，通常都能得到较好的 分析效果。分析效果。 多肽脱盐（凝胶过滤法）多肽脱盐（凝胶过滤法） 原理：利用凝胶层析介质原理：利用凝胶层析介质( ( 固定相固定相) )交联度的不同所形交联度的不同所形 成的网状孔径的大小，在层成的网状孔径的大小，在层 析时能阻止比网孔直径大的析时能阻止比网孔直径大的 生物大分子通过。利用流动生物大分子通过。利用流动 相中溶质的分子量大小差异相中溶质的分子量大小差异 而进行分离的一种方法。而进行分离的一种方法。 表表 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex )(Sephadex )的物理特性的物理特性 品品 名名干胶干胶颗颗 粒粒 直径直径/m/m 得水得水值值 WW f f /g.g/g.g-1 -1 床体床体 积积 /mL.g/mL.g - - 1 1 最适分段分离范最适分段分离范围围 溶溶胀胀所需所需 时间时间 /h/h 最大流体最大流体 静力静力压压 /Pa/Pa (cmH(cmH 2 2 O)O) 球蛋白分球蛋白分 子子质质量量 DaDa 线线性葡聚糖性葡聚糖 分子分子质质量量 /Da/Da 2020 lOOlOO Sephadex G-1OSephadex G-1O40-12040-1201.01.00.10.12-32-3700700700700 3 3 1 1 9810(100)9810(100) Sephadex G-15Sephadex G-1540-12040-1201.51.50.20.22.5-3.52.5-3.51500150015001500 3 3 1 1 9810(100)9810(100) SephadexSephadex G-25 G-25 粗粗 中粗中粗 细细 超超细细 100-100- 300300 50-15050-150 20-8020-80 10-4010-40 2.52.50.20.24-64-61000-50001000-5000100-5000100-5000 6 6 2 2 9810(100)9810(100) SephadexSephadex G-50 G-50 粗粗 中粗中粗 细细 超超细细 100-300100-300 50-15050-150 20-8020-80 10-4010-40 5.05.00.30.39-119-111500-300001500-30000500-10000500-10000 6 6 2 2 9810(100)9810(100) Sephadex Sephadex G-75G-75 中粗中粗 超超细细 40-12040-120 10-4010-40 7.57.50.50.512-1512-153000-700003000-700001000-500001000-500002424 3 3 4905(50)4905(50) Sephdex Sephdex G-100G-100 中粗中粗 超超细细 40-12040-120 10-4010-40 1010l.0l.015-2015-20 4000-4000- 150000150000 1000-1000001000-1000004848 5 5 3434(35)3434(35) SephadexSephadex G-150 G-150 中粗中粗 超超细细 40-12040-120 10-4010-40 15151.51.520-3020-30 5000-5000- 400000400000 1000-1500001000-1500007272 5 5 1472(15)1472(15) Sephadex Sephadex G-200G-200 中粗中粗 超超细细 40-12040-120 10-4010-40 20202.02.030-4030-40 5000-5000- 800000800000 1000-2000001000-2000007272 5 5 981(10)981(10) 多肽脱盐条件选择多肽脱盐条件选择 Sephdex G-15: Sephdex G-15: 适用于分子量在适用于分子量在1500-20001500-2000多肽的脱盐，对于分子量多肽的脱盐，对于分子量 超过超过15001500的多肽能够完全排阻。的多肽能够完全排阻。 柱子的选择：鼎国自产柱子的选择：鼎国自产10mm20cm10mm20cm色谱柱色谱柱 柱床体积：根据上样体积确定，一般柱床的体积不要少于上样体积的柱床体积：根据上样体积确定，一般柱床的体积不要少于上样体积的 10%10%。我们一般脱盐。我们一般脱盐1.0ml1.0ml的多肽，柱床体积通常选者的多肽，柱床体积通常选者10-15ml10-15ml。 洗脱速度：洗脱速度会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒洗脱速度：洗脱速度会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒 定而且合适。定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵 ，另一种是恒压重力洗脱。流速通常选择，另一种是恒压重力洗脱。流速通常选择 1ml/min1ml/min 洗脱夜洗脱夜: PBS: PBS， 0.1M NaHCO3-0.5M NaCl(PH8.3)0.1M NaHCO3-0.5M NaCl(PH8.3) 检测波长：检测波长：214nm214nm SR0002SR0002脱盐结果脱盐结果 称取称取SR0002SR0002约约7.0mg,7.0mg,溶于溶于1.0ml1.0ml的的0.1M NaHCO3-0.5M NaCl(PH8.3) 0.1M NaHCO3-0.5M NaCl(PH8.3) 过柱收集：过柱收集：500ul/500ul/管管 ODOD214( 214(空白）空白）=0.664 =0.664 (1) OD(1) OD214 214 =0.704 =0.704 (7) OD(7) OD214 214 =0.869 =0.869 (2) OD(2) OD214 214 =0.713 =0.713 (8) OD(8) OD214 214 =1.095 =1.095 (3) OD(3) OD214 214 =0.710 =0.710 (9) OD(9) OD214 214 =0.909 =0.909 (4) OD(4) OD214 214 =0.718 =0.718 (10) OD(10) OD214 214 =0.780 =0.780 (5) OD(5) OD214 214 =0.724 (11) OD =0.724 (11) OD214 214 =0.661 =0.661 (6) OD(6) OD214 214 =0.742 =0.742 (12) OD (12) OD214 214 =0.598 =0.598 峰形区带变宽，收集第（6），（7），（8），（9），（ 10）管共约2.5ml，会有部分损失。 多肽多肽RL-HPLCRL-HPLC分析分析 RL-HPLCRL-HPLC是一种分辨率最高的分离分析方法，可以分开长度上相差一是一种分辨率最高的分离分析方法，可以分开长度上相差一 个氨基酸的多肽。个氨基酸的多肽。 流动相中溶质分子与固定相配基间的疏水性相互作用形成的流动相中溶质分子与固定相配基间的疏水性相互作用形成的“on-on- off”off”机制。机制。 RL-HPLCRL-HPLC分离多肽的基础是待分离多肽间分离多肽的基础是待分离多肽间“疏水脚疏水脚”的细微差别，这的细微差别，这 些差别来源于氨基酸序列和构象的差异。些差别来源于氨基酸序列和构象的差异。 SR0001SR0001多肽的多肽的RL-HPLCRL-HPLC分析分析 色谱柱：瑞典进口填料色谱柱：瑞典进口填料Kroamsil C18Kroamsil C18柱柱 250*4.6mm,5um,120A(2000KD 6.9MW 2000KD 6.9 -NH2-NH2，1.7-SH1.7-SH， 7.0 7.0 酚基酚基 BSA: MW 67KD 59 -NH2，1-SH， 19酚基 OVA: MW 43KD 20 -NH2，4-SH， 10酚基 肌红蛋白： MW 17KD 19 -NH2， 0-SH， 3酚基 绝大多数国外的抗体公司用KLH作为载体蛋白。 交联方法交联方法 MBSMBS法法 戊二醛法戊二醛法 EDCEDC法法 MBS Coupling EDC method 以上的四种交联方法中，最常用的还是前三种，但是戊二以上的四种交联方法中，最常用的还是前三种，但是戊二 醛法，醛法，EDCEDC法，都有一定程度的二次反应法，都有一定程度的二次反应。 偶联剂 修饰的氨基酸 初次反应二次反应 MBSCys-SH 戊二醛-NH2Lys，-NH2，SH-CysTyr，His EDC-NH2Lys，-NH2， -COOH， Glu，Asp Tyr，Cys 不同的肽序列应该选择不同的偶联方法。不同的肽序列应该选择不同的偶联方法。 偶联是一定要发生在多肽的末端，避免偶联发生在多肽的偶联是一定要发生在多肽的末端，避免偶联发生在多肽的 中间序列。中间序列。N-N-端序列需要通过端序列需要通过C-C-端氨基酸偶联，而端氨基酸偶联，而C-C-端序端序 列则需要通过列则需要通过N-N-端氨基酸偶联。端氨基酸偶联。 CLIC1CLIC1（241aa) SR00239 (147-160aa) :241aa) SR00239 (147-160aa) : PLPEEVDETSAEDEPLPEEVDETSAEDE （NH） B S A （NH）PLPEEVDETSAEDE KK (NH ) （NH）PLPEEVDETSAEDE (NH ) （NH）PLPEEVDETSAEDE K (NH) （NH）PLPEEVDETSAEDE K (NH ) （NH）PLPEEVDETSAEDE 典型的错误偶联方式典型的错误偶联方式 CLIC1（241aa) SR00240（46-59aa):VDTKRRTETVQKL B S A K(NH) VDTKRRTETVQKL (HN） K(NH) (HN) VDTKRRTETVQKL K(NH） （HN） VDTKRRTETVQKL K（NH） (HN) VDTKRRTETVQKL 赖氨酸(K）含有游离的-氨基，他也可以通过戊二醛与载体分 子上的氨基以共价键结合，可能会影响多肽链上赖氨酸及其附近 氨基酸残基暴露的侧链的免疫原性 或者产生的抗体不是针对天 然蛋白中的多肽的确切结构 。 K(NH) (HN) 正确的偶联方式在其正确的偶联方式在其C C端加上一个端加上一个C C，用，用MBSMBS法法 CLIC1（241aa) SR00240（46-59aa):VDTKRRTETVQKLC B S A K（NH） (HS) VDTKRRTETVQKLC K（NH）(HS) VDTKRRTETVQKLC K（NH） VDTKRRTETVQKLC（SH) K(NH) VDTKRRTETVQKLC(SH) K(NH) VDTKRRTETVQKLC(SH) 来源于蛋白中间序列多肽的偶联可以发生在来源于蛋白中间序列多肽的偶联可以发生在N N端，也可以端，也可以 发生在发生在C C端，但是我们一般会选择偶联在免疫原性相对较端，但是我们一般会选择偶联在免疫原性相对较 弱的一端。弱的一端。 有的公司提到：来源于蛋白中间序列的多肽，为了最大程有的公司提到：来源于蛋白中间序列的多肽，为了最大程 度的模拟其在天然蛋白中的位置，其度的模拟其在天然蛋白中的位置，其N N端常乙酰化，端常乙酰化，C C端酰端酰 氨化。有的公司则认为没有必要，而且这样做常常会增加氨化。有的公司则认为没有必要，而且这样做常常会增加 多肽的疏水性，导致溶解度减小。多肽的疏水性，导致溶解度减小。 Location in the native protein N-terminusinternalC-terminus Is there a C in sequence Add a C to c- terminus(MBS) Redesign sequence Choose which terminal is conjugated N-terminal conjugation Is there a K in sequence 戊二醛 Add a C to N-terminal Redesign sequence Is there a C in sequence Add a C to N-terminal Redesign sequence Is there a C in sequence Redesign sequence Add a C to C-terminal Conjugation Chemistry Determination Flow Diagram no yes C-terminal conjugation Is there a C in sequence no yes noyes yes no yes no made by puyong 2006.5.27 肽与载体蛋白偶联结果观察肽与载体蛋白偶联结果观察 连接物中多肽与载体蛋白的分子比影响其诱导免疫应答的效应。分子连接物中多肽与载体蛋白的分子比影响其诱导免疫应答的效应。分子 比太低，常常引起无关的免疫应答；分子比过高，易诱导低特异性抗比太低，常常引起无关的免疫应答；分子比过高，易诱导低特异性抗 体的产生。体的产生。 最适合分子比为：一个最适合分子比为：一个BSABSA分子与分子与5-155-15个半抗原分子结合。个半抗原分子结合。我们交联我们交联 后的肽后的肽- -载体蛋白复合物，理论上平均一个载体蛋白复合物，理论上平均一个BSABSA分子上面交联了分子上面交联了2020个多个多 肽分子。肽分子。 肽与载体蛋白的偶联反应是一种比较稳定和充分的化学反应，戊二醛肽与载体蛋白的偶联反应是一种比较稳定和充分的化学反应，戊二醛 的偶联效率通常能达到的偶联效率通常能达到80%80%以上，以上，MBSMBS的偶联效率通常能达到的偶联效率通常能达到90%90%以上以上 。因此，很多公司认为没有必要进行这一步的检测。因此，很多公司认为没有必要进行这一步的检测。 我们对偶联结果通过我们对偶联结果通过SDS-PAGESDS-PAGE做了定性检测。做了定性检测。 偶联结果：偶联结果：SDS-PAGESDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色胶考马斯亮蓝染色 MBS偶联 多肽免疫多肽免疫 免疫动物：健康新西兰大白兔免疫动物：健康新西兰大白兔1 1只只 饲养条件：饲养条件： 温度：温度：15-2515-25 饮食：饮食：100g 100g 兔饲料兔饲料/ /天，并配以白菜胡萝卜少许天，并配以白菜胡萝卜少许 卫生：专人每天负责清洗粪便托盘，拖洗地面，定期消毒。卫生：专人每天负责清洗粪便托盘，拖洗地面，定期消毒。 免疫方案：免疫方案： 500ug多肽/1ml+1ml 完全佐剂混 匀,皮下注射4-5点 间隔一周 500ug多肽/1ml+1ml不完全佐剂 混匀，皮下注射4-5点 共加强3次 第七周取血ELISA检测、收集血清 。 多肽免疫注意事项多肽免疫注意事项 佐剂与抗原一定要充分混匀，以混匀后静置长时间不分层佐剂与抗原一定要充分混匀，以混匀后静置长时间不分层 作为混匀充分的标准。作为混匀充分的标准。 每种抗原大概每种抗原大概1.5ml,1.5ml,一般皮下免疫四到五点，每点大约一般皮下免疫四到五点，每点大约 0.25m0.25m，每点间隔大概，每点间隔大概1-2cm.1-2cm.不能为了图省事，就直接免不能为了图省事，就直接免 疫一到两点，这样抗原的吸收会不好。疫一到两点，这样抗原的吸收会不好。 每次免疫要新选择兔子背部上未免疫区域，因为免疫过的每次免疫要新选择兔子背部上未免疫区域，因为免疫过的 区域皮肤有时会结痂变硬。区域皮肤有时会结痂变硬。 免疫过程中尽量避免扎到血管，引起出血和感染免疫过程中尽量避免扎到血管，引起出血和感染。 兔子取血和血清保存兔子取血和血清保存 颈动脉取血，每只兔子大概能收集颈动脉取血，每只兔子大概能收集35ml35ml左右的血清。左右的血清。 分装分装2.5ml2.5ml（0.5ml0.5ml血清血清+0.5ml+0.5ml甘油）其余的血清冻于甘油）其余的血清冻于- - 28 28 ，禁止冻融。，禁止冻融。 血清一般不建议加叠氮钠，因为叠氮钠上的氨基基团血清一般不建议加叠氮钠，因为叠氮钠上的氨基基团 会干扰偶联反应和许多标记反应。而且我们取血的器会干扰偶联反应和许多标记反应。而且我们取血的器 械，械，50ml50ml离心管都是经过高压灭菌的离心管都是经过高压灭菌的。 抗多肽抗体的检测和功能学鉴定抗多肽抗体的检测和功能学鉴定 肽封闭实验确定抗体的特异性肽封闭实验确定抗体的特异性 Western Western 实验中经常能见到一实验中经常能见到一 条或超过一条带，为了确定哪条或超过一条带，为了确定哪 一条带是特异性的针对抗多肽一条带是特异性的针对抗多肽 的抗体。的抗体。 例如：例如：Fas:Fas:（335aa) 335aa) SR0065 (42-55aa) SR0065 (42-55aa) TTVETQNLEGLHHD TTVETQNLEGLHHD 戊二醛戊二醛 交联交联 实验步骤实验步骤 1 1：确定：确定Western Western 实验所用抗体的效价和血清量实验所用抗体的效价和血清量 通常我们一条膜需要用通常我们一条膜需要用 5ml blot buffer,5ml blot buffer,按按 1:501:50稀释血清稀释血清, ,需要需要 100ul 100ul 血清。血清。 2 2：封闭所用的抗原肽一般为血清量的：封闭所用的抗原肽一般为血清量的5 5到到5050倍。也就是说如果倍。也就是说如果1ug1ug的的 血清，需要血清，需要5 5到到50ug50ug的多肽。的多肽。 来源于兔血清总抗体浓度为来源于兔血清总抗体浓度为10ug/ul,10ug/ul,特异性抗体的浓度一般为总抗特异性抗体的浓度一般为总抗 体的体的10%10%，也就是，也就是1ug/ul1ug/ul。100ul100ul的血清需要封闭的肽量为的血清需要封闭的肽量为1mg1mg。 3 3：称取：称取1mg1mg肽溶于肽溶于900ul PBS900ul PBS中，加入中，加入100ul100ul血清，血清，3737翻转翻转2 2小时，小时， 4 4 翻转翻转5 5小时。同时做一不加多肽的对照。小时。同时做一不加多肽的对照。 4 4：4 4 ，12000rpm,15mins.12000rpm,15mins.小心的吸取上清作为一抗加入到反应盒小心的吸取上清作为一抗加入到反应盒 中中 结果观察结果观察 阳性结果阳性结果 Fas SR0065 阴性结果 TOP2A SR0065 抗体纯化抗体纯化 DEAE-DEAE-纤维素纤维素 Protein AProtein A 多肽抗原柱亲和纯化多肽抗原柱亲和纯化 亲和纯化亲和纯化 NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH2-Tris NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH2-Tris NH2-Tris NH2-Tris NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH-PEPTIDE NH2-Tris NH2-Tris + 交联 封闭 结合 洗脱 Made by puyong 2006.6.4 多肽抗体的纯化结果多肽抗体的纯化结果 SIP1SIP1（HAHA）YPYDVPDYAYPYDVPDYA 纯化前 19/10/05 2mins 纯化后 11/12/05 曝光过夜 纯化抗体考马斯亮蓝染色结果纯化抗体考马斯亮蓝染色结果 甘氨酸洗脱（1)高值 甘氨酸洗脱（1)低值 三乙胺洗脱（1）高值 三乙胺洗脱（1）低值 protein marker BSA 4ug 甘氨酸洗脱(2)高值 甘氨酸洗脱(2)低值 三乙胺洗脱（2）高值 三乙胺洗脱（2）低值 甘氨酸洗脱（3)高值 甘氨酸洗脱（3)低值 三乙胺洗脱（3）低值 三乙胺洗脱（1）高值 注：每种洗脱的抗体均上样10ul SR0002 Drosha GAAMDALESR0002 Drosha GAAMDALEK KYNFPQYNFPQ 纯化前1 9/10/05 2mins 将将SROOO2SROOO2甘洗脱甘洗脱(1)(1)高值高值5.5ml5.5ml，甘洗脱，甘洗脱(2)(2)高值高值3.2ml,3.2ml, 甘洗脱甘洗脱(2)(2)低值低值8ml8ml，甘洗脱，甘洗脱(3)(3)高值高值2.7ml,2.7ml,甘洗脱甘洗脱(3)(3)低低 值值2.7ml,2.7ml,三乙胺洗脱（三乙胺洗脱（3 3）高值）高值3.3ml3.3ml收集在一起共收集在一起共25ml25ml， 加入加入NaN3NaN3至终浓度至终浓度0.05%0.05%，BSABSA至终浓度至终浓度0.5%0.5%。混合。混合 后的抗体再次进行后的抗体再次进行Western Western 检测，结果见下图：检测，结果见下图： 未纯化血清 混合后的抗体1:100 混合后的抗体1:50 混合后的抗体1:25 混合后的抗体1:250 16/12/05 30mins 16/12/05 30mins 纯化抗体考马斯亮蓝染色结果纯化抗体考马斯亮蓝染色结果 2ugBSA 4ugBSA Protein marker 甘氨酸洗脱（1)高值 甘氨酸洗脱（1)低值 甘氨酸洗脱（2)高值 甘氨酸洗脱（2)低值 甘氨酸洗脱（3)高值 甘氨酸洗脱（3)低值 三乙胺洗脱（3）高值 三乙胺洗脱（3）低值 8/12/05 注：每种洗脱的抗体均上样10ul 将不同次纯化的抗体混合后考马斯亮蓝染色结果将不同次纯化的抗体混合后考马斯亮蓝染色结果 Protein marker 0.5ug人IgG 1ug人IgG 2ug人IgG 4ug人IgG 10ul的混合抗体 SR0002 Drosha 10ul的混合抗体估计在0.75ug左右，那么 25ml的混合抗体总量估计在2mg左右。 17/12/05 SR0004 DGCR8 LHILSSR0004 DGCR8 LHILSK KLQEEMLQEEMK KRLRL 阴性血清1:100 SR0004-1 1:100 SR0004-1 1:100 SR0004-2 1:100 SR0004-2 1:100 冻融 至少4