南京大学 分子生物学 课件 ppt 34讲

Nanjing University 1，卫星DNA：有 些高度重复DNA 序列的碱基组 成和浮力密度 同主体DNA有区 别，在浮力密 度梯度离心时 ，可形成不同 于主DNA带的卫 星带，此类DNA 称为卫星DNA。 Nanjing University 2，卫星DNA的分类 Nanjing University 分类 长度 重复单位 染色体定位 大小（bp） 卫星DNA 100kb数Mb 卫星序列2和3 5 整个染色体 卫序列1 2548 大多数染色体 着丝点和其他 异染色质区域 171 所有染色体着 丝点 （Sau3A家族） 68 1，9，1315， 21，22及Y染色 体的着丝点 小卫星DNA 0.120kb 端粒家族 6 所有染色体端 粒 高变家族 924 所有染色体通 常 靠近端粒 微卫星DNA 小于150bp 14 所有染色体 Nanjing University 三、细胞器基因组 （一）一般情况 1，DNA形状及基因组大小 绝大多数为环状非重复序列，少数低 等真核生物为线性分子 线粒体DNA为十几数十kb，叶绿体可 达二百多kb 2，细胞器编码的蛋白 自身所需的某些蛋白质以及tRNA和 rRNA Nanjing University 3，核基因编码的蛋白 细胞器专用的蛋白质合 成机器组分，及其他蛋 白质。在细胞质中合成 好后输入细胞器 Nanjing University （二）酵母线粒体 基因的特点 1，存在大量非编 码区 2，两个rRNA基因 中，21SrRNA基因 有一个内元 3，细胞色素基因 和细胞色素氧化 酶亚基1基因是不 连续基因 Nanjing University （三）人类线粒 体的分子遗传学 特点 1，基因的组织情 况 （1）有37个基因 13个蛋白质基因 2个rRNA基因 22个tRNA基因 （2）DNA利用效 率极高 Nanjing University 基因排列紧密（间隔区只占 DNA总长度的0.5%） 有重叠基因 有的基因以U或UA结尾，借 助playA尾巴产生UAA终止密 码子 （3）有特殊的终止密码子 AGA或AGG（核基因密码子为 Arg） Nanjing University 2，转录 大部分基因（ 28个）从重链 上转录 两条链的转录各产生一个转录 元 tRNA基因位于蛋白质和rRNA基 因之间，其产物在转录后处理 中的起重要作用 Nanjing University rRNA的合成多于mRNA 重链转录产物的转录后 处理比轻链转录产物更 为及时 Nanjing University 3，翻译 由线粒体内的蛋白质翻译机 器完成自身基因的翻译 有特殊的起始密码子（AUA ，AUU） mRNA的非翻译区极少 对抑制原核生物蛋白质合成 的抗生素敏感 Nanjing University 四、卫星DNA的等级结构及其 起源和进化 （一）卫星DNA的等级结构 1，小鼠卫星DNA 234bp重复 单位 小鼠基因组DNA的EcoRII酶 切 60-70%的卫星DNA含有一种 234bp的重复单位 Nanjing University2，117bp重复亚单位 推测：两者由基因扩增形 成，差异是基因扩增之后 积累的 Nanjing University Nanjing University 3，四分之一（58bp） 重复亚单位 最大差异为40% Nanjing University Nanjing University 4，八分之一重复亚单位 分（ 28bp） 、（ 30bp ）两种亚单位，两者差异为 61% Nanjing University Nanjing University 5，最小重复亚单位（ 9bp） 八分之一重复亚单位 由3种最小重复单位构 成 G A A A A A C G T G A A A A A T G A G A A A A A A C T Nanjing University Nanjing University 三者可能来源于共 同的祖先序列 Nanjing University （二）卫星DNA可能的进化过 程 1，27bp重复亚单位的形成 两种亚单位只有19%的差异 9bp重复亚单位经跃进式复制 （saltatory replication） 形成27bp重复亚单位 随后发生突变积累 Nanjing University 2，58bp重复亚单位的形成 27bp重复单位发生跃进式 复制，形成54bp二聚体 插入突变形成 、亚 单位 Nanjing University 3，116bp重复亚单位的形成 58bp重复单位发生跃进式 复制 突变积累 4，234bp重复单位的形成 116bp发生跃进式复制 突变积累 Nanjing University Nanjing University （三）重复序列一致性的 形成机制 1，不均等交换（unequal crossing-over) （1）原理：姐妹染色体上 的非等位重复序列之间发 生配对并交换，导致非对 等的交换 Nanjing University （2）种类： 全符合的（in register) 不均等交换 ； 半符合的(half- register)不均等交换 Nanjing University 2，交换固定 （1）概念：一系列的 不均等交换将导致一种 重复单位替代其他所有 的卫星DNA，这个过程 称为交换固定 （2）过程：图2-14 b Nanjing University 3，基因转换 （1）概念：通过异源双 链区内不配对碱基的修 复而进行的基因矫正过 程 （2）过程：图2-14 c Nanjing University第四节 基因定位与基因克隆 一、基因定位 （一）连锁定位 （二）原位杂交 （三）染色体步行 Nanjing University 1，基因组文库的构建 l基因组文库 ：将基因组 DNA切割成宜于操作的片 段，然后与适当的载体 重组连接。由此建立的 包含一整套基因组DNA片 段的克隆群叫基因组文 库 Nanjing University 2，染色体步行 （1）基本原理：通过一系 列的杂交，确定按基因组 原来顺序排列的相互重叠 的基因组克隆（重叠群） ，以获得目标序列所对应 的基因组DNA序列 Nanjing University （2）过程： l标记目标DNA（探针制备） l菌落杂交 l测定阳性克隆DNA序列 l亚克隆阳性克隆末端DNA序列 l利用亚克隆制备新的DNA探针 l进行新的一轮菌落杂交 l重复上述过程 Nanjing University Nanjing University（3）存在的问题： l重复序列使步行出错 ； l克隆过程中基因组片 段的发生突变 Nanjing University （四）染色体跳跃 l染色体跳跃文库（ chromosome jumping library）的制作： Nanjing University （1）用识别长序列的限制性内切酶切 割基因组DNA和克隆载体DNA （2）用脉冲电场梯度电泳分离DNA酶切 片段 （3）将DNA片段导入克隆载体，连接成 环 （4）用另一种限制性内切酶（载体DNA 无此酶识别位点）将大部分基因组DNA 切除后，再将之连接起来 Nanjing University 二、基因克隆 （一）功能克隆 利用基因的产物（RNA 或蛋白质）所包含的功 能信息来推知相应基因 的序列 Nanjing University （二）候选基因克隆法 根据遗传疾病可能相关的 生理特征，去进一步确定 与这些生理特征相关的侯 选基因，再在这些侯选基 因中寻找与疾病表型可能 相关的数据，以次确定疾 病基因 Nanjing University （三）位置候选基因克隆法 通过连锁图谱与连锁分析， 先将致病基因定位于某些染 色体的某一狭窄的区域，再 对该区域中分布的基因位点 进行筛选和确认，从而找到 与疾病相关的基因。其过程 为： Nanjing University 1，利用低密度DNA标记进行 染色体扫描定位 利用全基因组内均匀分布 的具有一定密度的多态性 DNA标记来作为连锁分析中 的参考点，快速达到初步 基因定位的目的 Nanjing University 2，精确定位 在目标区域内选择更多 的标记作进一步分析， 以确认先前的连锁分析 结果，并将待克隆基因 范围进一步缩小 Nanjing University 3，确定基因 从靶区域中得到的 候选基因中，确定 由其突变而导致发 病的基因 Nanjing University 第四章 以修复作用为中 心的DNA的安全 保障体系 Nanjing University 导致DNA不稳定的因素 1，偶然的复制错误 2，环境紫外线、电离 辐射化学物质（突变剂 ）造成的核酸分子损伤 3，外源遗传物质的侵 入 Nanjing University 保证DNA稳定性的机 制 1，复制修复系统 2，损伤修复系统 3，限制-修复系统 Nanjing University第一节 复制修复 一、尿嘧啶糖基酶系统 （一）DNA中尿嘧啶的产 生 1，dUTP渗入 2，胞嘧啶脱氨氧化生成 Nanjing University （二）尿嘧啶糖基酶系统 的组成 1，尿嘧啶-N-糖基酶 2，无嘌呤（AP）内切核酸 酶 3，DNA聚合酶I（Pol I） 4，DNA连接酶 Nanjing University （三）修复过程 1，尿嘧啶-N-糖基酶 将DNA双链中的尿嘧啶 切除 2，AP内切核酸酶切除 无碱基核糖 Nanjing University 3，DNA聚合酶I（Pol I） 在缺口（gap）的3端 ，以互补链为模板合成 DNA链，同时其5 3外切核酸酶活性不 断将缺口下游的5端核 苷酸切除 4，DNA连接酶将切刻（ nick）封闭 Nanjing University 二、错配修复系统（mismatch repair system） DNA聚合酶偶尔能催化不能与 模板配对的错误碱基的渗入 ，这种复制错误绝大多数由 DNA聚合酶3 5 校对 功能立即得以修正。然而在 某些条件下，会有频率为10-8 的错误的不到立即纠正。错 配修复系统使这种复制错误 的频率降至10-1010-11 Nanjing University （一）错配修复系统的组成 1，错配矫正酶（ mismatch correction enzyme） 是核酸内切酶 由基因mutH，mutL，和 mutS所编码 Nanjing University可识别新生链上的错 配碱基及未甲基化的 GATC 2，DNA聚合酶I 3，DNA连接酶 Nanjing University （二）错配修复的过程 1，错配矫正酶与未甲基化的 GATC及同一条链上的错配碱 基结合 2，错配矫正酶在两者之间切 除一段包括错配碱基的DNA 单链 Nanjing University 3，DNA聚合 酶III进行 缺口充填 4， DNA连 接酶连接 切刻 Nanjing University （三）错配修复系统 其他作用 1，去除渗入DNA的碱基 类似物 2，在基因转换中起重 要作用 Nanjing University第二节 损伤修复 致损伤因素 电离辐射 紫外线 化学突变剂等 Nanjing University DNA分子损伤的类型 嘧啶二聚体 碱基修饰 碱基丢失 链的断裂 碱基交联 Nanjing University 一、胸腺嘧啶二聚体的产生及其 后果 相邻胸腺嘧啶在理、化因素 作用下形成二聚体，产生破 坏碱基平面的环丁基 Nanjing University 在以有胸腺嘧啶二聚 体的DNA为模板时，DNA 聚合酶I反复连接和切 割腺嘌呤核苷酸（空耗 ），消耗大量dATP而不 能继续复制DNA，最后 导致细胞死亡 Nanjing University 二、胸腺嘧啶二聚体修复的生物 学指征 （一）细菌的活存曲线 （二）修复类型 1，光复活（photoreactivation ） 只作用于紫外线照射所形成的 产物 只需要光复活酶（ photoreactivating enzyme） Nanjing University 2，暗修复 除了可作用于胸腺嘧啶二 聚体外，还可以修复其他 类型的损伤，包括： （1）切除修复 （2）重组修复 （3）SOS修复 （4）二聚体糖基酶修复 Nanjing University 三、胸腺嘧啶二聚体修复的分 子生物学机制 (一）光复活（photoreactivation ） 1，光复活的定义 在可见光（300nm 600nm） 的活化之下由光复活酶催化 胸腺嘧啶二聚体分解成为单 体的过程 Nanjing University 2，光复活的过程 光复活酶（PR酶）与DNA链上 的胸腺嘧啶二聚体结合成复合 物 复合物吸收光能并切断胸腺嘧 啶二聚体之间的C-C键 胸腺嘧啶二聚体变为单体，PR 酶从DNA上解离下来 光复活作用还可以修复紫外线 照射形成的其他嘧啶二聚体 Nanjing University （二）切除修复 1，切除修复一般 过程 修复内切酶识别 损伤引起的DNA 双螺旋结构的变 形，并在DNA损 伤的两侧切开糖 -磷酸骨架 Nanjing University 外切核酸酶去除 切刻之间的DNA DNA聚合酶合成一 条新的DNA链置换 损伤的DNA片段 DNA连接酶封合新 合成的DNA片段和 原有DNA链之间的 切刻 Nanjing University 2，大肠杆菌的 切除修复 （1）修复过程 UvrA识别引起 DNA双螺旋变形 的损伤， 并与 UvrB结合 UvrA解离（需 ATP)， Uvr加 入 Nanjing University UvrBC复合体在 损伤DNA的两侧 切开一个切刻。 5端和3端离 损伤位点分别为 7个和34个核苷 酸（需ATP） UvrD（解旋酶） 解开DNA双链， 释放损伤DNA片 段 Nanjing University DNA聚合酶I进行缺口 的充填 最后由DNA连接酶将 切刻连接起来 Nanjing University （2）大肠杆菌切除修 复的类型 短补丁修复（short- patch repair） 切除的DNA不超过30 个核苷酸 约占99% Nanjing University 长补丁修复（long -patch repair） 切除的DNA大多数 在1500核苷酸左右 ，少数可达9000核 苷酸以上 约占1% Nanjing University 3，真核生物的切 除修复 （1）TFIIH打开 DNA双螺旋 （2）XPG内切核酸 酶切开损伤的3 端 （3）ERCC1内切核 酸酶切开损伤的 5端 Nanjing University （三）重组修复 1，除Uvr系统之外，还存 在其他的暗修复系统 证据1：对于uvrA-的细 菌，UV致死剂量能在细 胞内产生300个胸腺嘧啶 二聚体。而一个未被修 复的胸腺嘧啶二聚体就 可使细胞死亡 Nanjing University 证据2：recA-细菌比uvrA-细 菌对紫外线更敏感 2，重组修复（复制后修复） 的机制 （1）重组修复的姐妹链交换 假说（图4-10） DNA分子的a链和b链上各有一 个胸腺嘧啶二聚体并开始复 制 Nanjing University 通过二聚体后起始机制， 复制出包含缺口的子链 a和b a， a姐妹链发生交换 ，即从a链上切下a链上 所缺少的一段，由DNA连 接酶连接在a链上。在 下一轮复制时， a链成 为完整的模板 Nanjing University a链上的缺口由Pol I和 DNA连接酶补好。 b 链可以按同样的方式进 行修复。但是a链上的 二聚体如果被其他机制 所修复，那么只要由 DNA聚合酶I补齐就行了 Nanjing University Nanjing University （2）重组修复所涉及 的基因 recA recBCD 其他不详 Nanjing University （四）SOS修复 1,SOS反应 细菌在DNA受损或其他因素使DNA复 制受到抑制时,会产生一系列的表型 变化,包括对损伤DNA的修复能力迅 速增强,诱变率的提高,细胞分裂停 止以及原噬菌体的诱导释放等.这些 反应通称为SOS反应 Nanjing University 2,SOS修复的概念 是DNA损伤修复的一种旁路 系统，它能引起DNA复制校对 系统松懈,从而允许新生DNA 链能够越过胸腺嘧啶二聚体 （超越二聚体合成， t