对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及vegf的作用课件

GM-CSF对诱导人血 管内皮细胞血管形成 的影响及VEGF的作用 中国医科大学实验病理学教 研室 前 言 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)一直 被认为是一种慢性进展的血管壁脂质 沉积性疾病。近些年的研究逐渐阐明 了炎症在AS病理过程中的重要作用。 炎症学说认为，炎症可导致不稳定斑块 形成，斑块破裂甚至急性冠状动脉综 合症（acute coronary syndrome, ACS ）等临床严重并发症的发生。而不稳 定斑块的重要特征之一就是斑块内血 管新生。斑块内血管新生与斑块不稳 定之间的关系已逐渐成为当前研究的 热点。 血管新生是由既存的血管以出芽的方式 形成新血管的过程，见于许多生理和 病理情况。 血管新生的过程极其复杂，受到促进血 管生成因子和抑制血管生成因子的共 同调控。 AS斑块内的新生血管主要来自外膜血管 滋养管（vasa vasorum）。 通过新生血管，血液中的血浆脂蛋白和 大量炎细胞流入斑块内，加重炎症反应 。 新生血管本身无平滑肌和周细胞支持， 管壁薄弱，易于引起斑块内出血、斑块 破裂甚至一系列临床严重并发症的发生 。 实 验 目 的 研究炎性因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因 子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）对诱导人血 管内皮细胞血管形成的影响及血管内皮生 长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的作用。 探讨GM-CSF和VEGF与AS斑块稳定性及病 变进展之间的关系。 实 验 方 法 原代培养HUVECs 应用Matrigel建立稳定的血管 形成的体外培养体系。 Matrigel的用法： Matrigel冻存于-20，使用前置于4 过夜，融化成黄色胶状液体。 根据本实验研究所得的经验：用预冷的 微量进样器在短时间内迅速加入预冷 的24孔板中，每孔80l/cm2（厚度约 为0.5mm）。轻轻摇晃培养板，使其 铺平。最后将培养板放入37孵育箱 内，30分钟后即可使用。 HUVECs原代培养: 采用本实验室改进的Jaffe氏培养法。取 健康新生儿脐带（最好不超过12h）， PBS冲洗干净，0.25%胰酶消化（37 ，5分钟），用含5%胎牛血清的 DMEM培养液终止消化，收集消化液 。离心（1000转/分钟，10分钟）。弃 上清，用含20%胎牛血清的DMEM培 养液制成细胞悬液，以5.0105/cm2接 种于涂有Matrigel的培养板内进行培养 ,24小时后换液。 实验分组 GM-CSF作用的检测 本实验根据不同的实验因素浓度和不 同的作用时间，分别设计成浓度效应 组和时间效应组。 浓度效应组：正常对照组（无血清 DMEM培养液）、rhGM-CSF不同浓度 组（25、50、100ng/ml），分别作用 48h。 时间效应组：取相同浓度rhGM-CSF（ 100ng/ml）不同作用时间组（12、24 、48h）。 VEGF作用的检测 正常对照组（无血清DMEM培养液） 、rhGM-CSF（100ng/ml）组、rhGM- CSF（100ng/ml）+ VEGF165（10ng/ml ）组，分别作用24h。 相差显微镜下观察各实验组 血管腔形成情况。 各实验组用95%冰乙醇固定 ，4过夜 。用CD34免疫细 胞化学方法（SP法）显示各 组血管形态。 计数管腔数并进行统计学分 析 每个实验组在40倍镜下选取3处血管密 集的视野，100倍镜下计数每个视野的 管腔数。应用SPSS、microsoft excel进 行统计分析和处理。P0.05为有统计 学意义。 实 验 结 果 Matrigel对体外培养人脐带静 脉内皮细胞形成血管的诱导 作用 本研究提示，应用Matrigel可在体外 诱导培养的人脐带静脉内皮细胞形成 管腔结构。内皮细胞在培养后18小时 开始形成管腔结构，24小时即可建立 稳定的血管形成的体外模型。 图1 在普通明胶上培养的人脐带静脉内皮细胞24小时形态， 内 皮细胞呈短梭形或多角形 ，达到亚融合（倒置相差显微镜x100） 图2 Matrigel诱导培养的人脐带静脉内皮细胞在24小所 建立的血管形成的体外模型（倒置相差显微镜x100） 图3 Matrigel诱导培养的人脐带静脉内皮细胞在24小时所建立 的血管形成的体外模型（CD34免疫细胞化学染色x100） 本研究提示，与在普通明胶上生长的内 皮细胞相比，在Matrigel上生长的内皮 细胞生长周期较短，并且细胞不发生 融合，而是形成相互连接的毛细血管 样的血管网络。细胞间界限不清。 不同浓度GM-CSF作用的检测 图4 正常对照组作用48小时形成的管腔数较少 （倒置相差显微镜x100） 图5 rhGM-CSF（25ng/ml）作用48小时形成的管腔数 有所增多（倒置相差显微镜x100） 图6 rhGM-CSF（50ng/ml）作用48小时形成的管腔数 进一步增多（倒置相差显微镜x100） 图7 rhGM-CSF（100ng/ml）作用48小时形成明显的管 腔结构，连接成血管网络（倒置相差显微镜x100） 图8 不同浓度 rhGM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形 成的影响（各组间P值均小于0.001） 相同浓度GM-CSF不同作用时 间的检测 图9 rhGM-CSF（100ng/ml）作用12小时形成的管腔数 较少（CD34免疫细胞化学染色x100） 图10 rhGM-CSF（100ng/ml）作用24小时形成的管数 有所增多（CD34免疫细胞化学染色x100） 图11 rhGM-CSF（100ng/ml）作用48小时形成明显的管腔 结构，连接成血管网络（CD34免疫细胞化学染色x100） 图12 相同浓度 rhGM-CSF作用不同时间对诱导人血管内皮 细胞血管形成的影响（各组间P值均小于0.001） VEGF作用的检测 图13 正常对照组作用24小时形成的管腔数 较少（CD34免疫细胞化学染色x100） 图14 rhGM-CSF（100ng/ml）作用24小时形成的 管腔数有所增多（CD34免疫细胞化学染色x100） 图15 rhGM-CSF（100ng/ml）与VEGF165（10ng/ml）共 同作用24小时形成明显的管腔结构，连接成血管网络 （CD34免疫细胞化学染色x100） 图16 VEGF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响 （各组间P值均小于0.001） 讨 论 AS的炎症机制和斑块的不稳定性 炎症学说认为，AS是一种特殊的慢性炎症 性疾病，表现为一系列高度特异的分子细 胞反应，每一种特异性病变都表现为动脉 炎症过程的不同阶段。在病变的发生发展 过程中，脂蛋白、细胞成分（单核巨噬细 胞、T淋巴细胞、ECs、SMCs）及ECM、 炎性因子、细胞因子、生长因子相互作用 。如果这个过程不减弱或过度发展，将导 致晚期更为复杂的病变。 不稳定AS斑块的病变特征：偏心的管 腔周缘；含有厚度易变或较薄的纤 维帽；脂质丰富；局部巨噬细胞 、T淋巴细胞等炎细胞浸润、活化； 新生微血管增多等。 血管新生的过程及其调节 血管新生是由既存的血管以出芽的方式 形成新血管的生物学过程。 一般来讲，血管新生见于胚胎发育晚期 及个体出生后。 血管新生亦可见于许多病理情况，如缺 血、创伤修复、AS、肿瘤、糖尿病视 网膜病变、风湿性关节炎等。 VEGF也称血管通透因子（vascular permeability factor，VPF）。 VEGF家族包括VEGF-A、-B、-C、-D、 -E和胎盘生长因子。 VEGF-A由于其mRNA剪切的不同可产 生9种不同的蛋白异构体，其中最为常 见的是VEGF121和VEGF165 。 VEGF由内皮细胞、单核巨噬细胞、成 纤维细胞产生后，与仅存于内皮细胞 膜上的两种酪氨酸蛋白激酶受体Flt-1、 Flk-1/KDR特异性结合。 通过自分泌或旁分泌途径介导内皮细 胞迁移、增殖，进而诱导血管新生。 AS斑块内血管新生及其调节 斑块内的新生血管大多位于内弹力膜 附近，周围有大量炎细胞，常有含铁 血黄素沉积或伴新鲜出血，说明在病 灶局部出血、吸收经常发生。 随着病变的发展，新生血管的检出率也 逐渐增加，尤其在不稳定斑块更为明 显。新生血管的数目、大小、形状也 随之变化。 斑块内的新生血管与大血管的管腔相通， 可作为更多的血浆脂蛋白进入斑块的通道而 促进斑块生长。 血液中的巨噬细胞、淋巴细胞等炎细胞通 过新生血管流入到斑块内，释放多种炎性因 子刺激血管生长因子的表达；另一方面，炎 细胞也可以直接表达血管生长因子并释放多 种蛋白水解酶如MMPs、胶原酶（ Collagenases）、uPA等，促进了斑块内血 管新生。而新生血管又为炎细胞在斑块内聚 集提供了重要通道，从而形成恶性循环。 新生血管促进病变发展导致斑块破裂 的机制： 新生血管无平滑肌及周细胞支持，无感 受血流和血压的受体，管壁薄弱，易 于引起斑块内出血、血栓及溃疡形成 。 新生血管内皮细胞高表达黏附分子，促 进炎细胞聚集于斑块内，后者表达生 长因子并分泌蛋白水解酶，降解纤维 帽。 在AS斑块内，VEGF的阳性细胞数与内膜 血管新生程度呈正相关，分布也高度一致 ，即主要位于斑块肩部及纤维帽。 VEGF可能直接促进内皮细胞生长，也可 能促进骨髓中内皮前体细胞（endothelial precursor cells，EPCs）的释放，后者迁移 至AS斑块处参与血管新生。 本实验结果表明，加入外源性VEGF后，培 养体系的血管形成显著增多。 炎性因子对血管新生的影响及其作用 机制 GM-CSF作为一种炎性因子，可由斑块处 的巨噬细胞和SMCs、ECs分泌。GM-CSF 具有促进骨髓细胞分化，调节白细胞功能 的作用。但目前关于GM-CSF与血管新生 之间关系的研究报道甚少。 本实验结果表明，随着GM-CSF浓度的逐 渐增加和作用时间的延长，培养体系的血 管形成随之增多。 本实验的成功之处在于，在体外培养 HUVECs，应用Matrigel建立稳定的血 管形成的体外培养体系，来观察GM- CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的 影响。目前在国内未见报道。 Matrigel在-20中至少可保存3个月， 呈淡黄色。在2-8过夜后液化，在22- 37迅速聚合成具有生物活性的玫瑰 红色胶状物质。在37条件下可保存 12天。 Matrigel在未稀释的情况下可涂成薄层 （0.5mm）或厚层（1.0mm）,用无血 清的培养液稀释（1:3）可涂成薄层（ 0.5mm）作为培养底物。尤其要注意 的是，在使用过程中避免反复冻融。 Matrigel应用于生命科学和药物发现的 研究已有15年 。 Matrigel为细胞的迁移、侵袭、管腔结 构的形成及细胞的生化功能、基因表 达的研究提供了相关的环境。 目前认为，GM-CSF促进血管新生可能 是由于细胞内JAK2/STAT3途径激活。 在今后的