第六章 基因工程寄生虫疫苗 生物制品学 教学课件

第七章 基因工程寄生虫疫苗 Parasite Vaccine By Gene Engineering 第一节 概 述 （Section I Outline） 人体寄生虫与人类共存的历史可追溯到远古， 在漫长的岁月里寄生虫和宿主的关系经历了“ 史前期”，“形成期”和“确定期”。 据WHO统计，目前大约1/4世界人口受到五大寄 生虫感染（疟原虫、血吸虫、利什曼原虫、丝 虫、锥虫）要全面控制寄生虫病的流行，所面 临的仍是一条漫长而艰辛之路。 寄生虫与宿主的关系保持平衡是在长期 进化过程中逐步形成的。 经过自然选择 宿主逐渐形成有效的免疫反应以防范寄 生虫的毒害作用。 通过高度自然选择，一些种群的寄生虫 和宿主关系不相适应，难以平衡逐步消 失。而另一些种群在进化过程中获得某 些保护自己而不被宿主清除的功能，即 所谓寄生虫的免疫逃避机制。 一.对寄生虫疫苗研究成功的关键（key of success ）： 1.包括选择免疫应答难以作用的寄生部位； 2.寄生虫在宿主体内不同发育阶段表现抗原特异性 改变，从而使获得性免疫力有严格的阶段（或期 ）特异性。各阶段（期）因其不同的表面抗原而 避开了前一阶段引起的宿主免疫效应机制的伤害 。寄生虫表面抗原变异在锥虫，疟原虫，巴贝虫 等致病性原虫表现更为明显。 3.寄生虫在抗原变异，抗原模拟和寄生虫摄入 宿主DNA和获得宿主蛋白或以宿主抗原伪装自己 方面也表现出非常复杂而有效的免疫逃避机制 。但是，任何一种寄生虫在宿主体内长期存活 的免疫逃避机制均未能完全搞清楚。仍是一个 值得深入研究和探讨的课题。 二.寄生虫疫苗的分类（category of parasite vaccine）： 寄生虫疫苗研究始于1903年，至今洽好100年 。可分类为： 带低毒活野生型疫苗（自然界中分离的）； 致弱病原疫苗（减毒活疫苗）； 灭活或死病原疫苗； 亚单位疫苗（包括抽提物或代谢产物）； 合成的或重组的抗原疫苗； 抗独特型Ab疫苗； DNA疫苗。 三.问题（questions） 迄今仍无公认的寄生虫病疫苗，究其原因： （1）多数寄生虫为多细胞生物，寄生虫抗原成分 非常复杂，很难找准特定保护性抗原，保护性免 疫应答机制不清。 （2）寄生虫抗原免疫所诱导的大都为部分保护性 免疫力（一般为30%70%）。 （3）寄生虫形成种种逃避宿主免疫应答的办法， 其机制尚待阐明。 （4）寄生虫一般引起慢性长期感染，病期因寄生 虫生活史中形态上不同，常存在数阶段（期）。 本章将综述基因工程寄生虫疫苗 ，取得较大进展的寄生虫基因工程 疫苗如疟疾，利什曼病和血吸虫病 。前两种单细胞原虫病疫苗已进入 临床试验，而复细胞蠕虫血吸虫疫 苗仅处于I期临床。 第二节 基因工程寄生虫疫苗的研究现状 （Research status of parasite vaccine by gene engineering） 一.疟疾疫苗(maria vaccine) 世界上每年3-5亿人口感染人疟，1.5-3百万人死于疟疾 。大多数严重发病和死亡发生在儿童和孕妇，主要是恶性 疟（由恶性疟原虫感染引起）。 其流行原因如下： 疟原虫抗疟药的抗性呈上升趋势； 媒介蚊对常用杀虫剂抗性的产生即所谓抗性蚊的出 现和扩散； 人口的迅速增长和人口流动，特别是对疟疾无免疫 力人口迁移，使疟疾问题越来越严重，导致疟疾在世界范 围持续地流行。 疟原虫复杂生活史的不同发育阶段中包括数 种潜在保护性阶段（期）特异性抗原，为宿 主有效免疫应答提供多个靶子。 这些抗原是三种特定途径研究疫苗的基础。 红前期包括肝期的子孢子疫苗或肝内期疫苗 ，无性期天然血液期疫苗，传播阻断疫苗针 对配子体，配子或蚊体内后期。 被感染蚊接种的子孢子在血液循环1h后 ，进一步发育需入侵肝细胞，在细胞内 增殖，或裂体增殖（schizogong），随 后释放数千裂殖子(merozoites)，入侵 红细胞。因为单一子孢子感染能导致严 重血液期感染，抗子孢子疫苗必须是 100%有效才有实用价值。 最近报导了经较大改进的亚单位疫苗的免疫效 果。他们用恶性疟原虫环子孢子蛋白结合经选 择能加强免疫应答的佐剂制成抗原制剂。制剂 配方为CSP和B型肝炎表面抗原（HBsAg）以油- 水均化制成，再加免疫激活佐剂（mono phosphoryl-lipid A和QS21）。这种疫苗在大 多数受试者产生对疟疾感染完全抵抗力及高水 平抗子孢子抗体滴度，提示有一种与体液免疫 相关的保护性作用。 疟疾疫苗研制的策略之一是预防活疟原虫 从肝内释放。这种疫苗很可能保护人免发 疟疾的全部临床症状。约氏疟原虫（P . yoelli）鼠疟模型所获结果表明，编码P . yoelii CSP或17kDa肝期和红细胞期蛋白的 质粒DNA疫苗对诱导针对感染的肝细胞保护 性的细胞毒CD8+T细胞应答是有效的（Ho- ffman 1997）。 传播阻断途径针对蚊体内疟原虫有性 发育期，因此减少疟疾的传播。血餐中 获得的抗体与靶抗原反应，阻断受精（ fertilization）及其后在蚊体肠内的 发育。 p因此，传播阻断疫苗的目的是预防蚊 子变成传染性蚊，从而减少疟疾传播。 满意的保护性抗原（或表位）组合在一起作为 疫苗候选抗原，再进行其编码基因的克隆和表达 。与单一成分的阶段（或表位）特异抗原疫苗比 较，一种多成分，多阶段和多价的Pf疫苗将更为 有效。 利用基因工程的常规方法，将目的抗原基因插 入表达载体（真核质粒表达载体），在体外利用 工程菌大量扩增，再分离纯化带有抗原基因的质 粒DNA作为核酸疫苗，采用不同的方法将核酸导入 体细胞。对这一项新的疫苗研究技术，它能全面 诱导机体的体液和细胞免疫应答。 此外，构建疟疾多阶段（期），多价， 多表位复合基因DNA疫苗也取得一定进展。 将疟原虫不同发育阶段（期）不同抗原的 编码DNA序列（多价）拼接，从而拓宽宿主 的免疫应答面 。 二.血吸虫病疫苗（schistosomiasis vaccine） 血吸虫病是一种慢性的，严重危害人民健 康的人畜共患寄生虫病。 世界上2亿人口受血吸虫病危害，每年约 有50万人死于血吸虫病。 10年前血吸虫安全有效的口服新药吡喹酮 广泛应用，但易感动物和人群感染血吸虫 后能产生对再感染的抵抗力和“伴随免疫 ”（concomitant immunity）。 已鉴定出许多对实验血吸虫病有保护性 的抗原。这些抗原被WHO/TDR认为是血吸 虫疫苗最好的候选抗原。 p谷胱甘肽-S-转移酶（GST）Sm28在曼氏 血吸虫中主要位于童虫和成虫表皮。用纯 化天然抗原或是重组Sm28免疫在不同种实 验动物均诱导对实验Sm感染保护作用。 特定单克隆抗体探针的应用确定了GST免 疫后血吸虫产卵受到抑制是与GST酶活性受 抑制有关。Sm28GST表位的测定表明N端和C 端均起重要作用。 新型的黏膜型疫苗最好选用经修饰或减毒 的，且又能用于疫苗候选抗原基因表达的 活载体。 日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）与曼 氏血吸虫，埃及血吸虫的生活史与免疫发病机制 不同。 p免疫化学分析证明日本血吸虫和曼氏血吸虫分 别至少有2种26kDa和28kDaGST同工酶。编码这四 种GSTs的cDNA均已克隆。 p日本血吸虫疫苗从复细胞血吸虫分离纯化出9种 天然特定疫苗候选抗原分子，包括血吸虫糖酵解 和解毒相关酶以及与肌肉和表膜相关的副肌球蛋 白和原肌球蛋白等。 第三节 基因工程寄生虫疫苗研制 的前景及展望 （foreground and prospect） 特定寄生虫疫苗的成功研制依赖于对寄生虫感 染时所引起免疫应答的细胞和体液成分清楚的 了解，以及对能诱导保护性应答抗原的确定。 最近在验证和生产某些寄生虫病疫苗潜在保护 性抗原方面取得明显进展，但对免疫宿主所诱 导保护性免疫力的机制了解以及人对寄生虫病 免疫应答特征的研究进展不大。 1998年WHO/TDR与美国NIH/USAID密切协作资 助血吸虫疫苗研制计划（SVDP）主要是促进对 两个重组曼氏血吸虫抗原副肌球蛋白和MAP4/ TPI的I期临床试验以及另两个候选抗原IrV-5 和MAP-3（Sm23）的DNA疫苗实验研究，以期找 到安全有效的血吸虫疫苗。SVDP将血吸虫疫苗 候选抗原研究集中在重组抗原和DNA疫苗的评 价上。 从全球看，对寄生虫疫苗新候选 抗原的发现，研制和临床试验需要 各国共同协作，特别是发达国家科 学家和寄生虫病流行国家的科研机 构间的协作。 对疟疾，利什曼病和血吸虫病，一种重组抗原的 混合疫苗可能克服遗传局限性和株种特异性。作 为多抗原表位基因途径，已用重组形式同时表达 在一种致弱痘苗病毒细胞称NY VACpf7。第一次试 验已完成。 此外，核酸疫苗（含编码不同肽基因）也有价值 。有效的佐剂可能增强抗原诱导保护作用，对抗 原提呈细胞提供上调共同刺激因子所必须的信号 ，以及诱导分子的表达从而使这些细胞达到靶组 织。 用于疫苗注射的任何分子必须能诱导保 护性免疫力，同时并不引起免疫病理或 免疫抑制反应。至今仍无现成的疫苗预 防人寄生虫感染，人们仍将注意力集中 在新药研究及对寄生虫病治疗上。一些 研究者认为核酸将成为未来寄生虫病的 疫苗。 抗原 特征 保护作用 小鼠大鼠其他WHO推荐意见 谷胱甘肽- S-转移酶 （GST28） 幼虫和成 虫中酶 30%-60% 40%-60% 40%（狒狒 ） 生产和I期临床试 验重组抗原GMP 副肌球 蛋白 （Sm97） 幼虫和成 虫中的无 脊椎动物 肌蛋白 30% 重组抗原GMP生产 和I期临床试验 表7-1 曼氏血吸虫疫苗候选抗原（WHO/TDR，1997） 照射致弱疫 苗抗原5（ IrV-5） 生活史各期 中的脊椎动 物肌蛋白 50%-70% 95% 25%（狒狒） DNA疫苗制 备和试验 MAP-4 生活史各期 中磷酸丙