猪巨细胞病毒dna聚合酶基因的克隆与序列分析课件

猪巨细胞病毒DNA聚合酶基 因的克隆与序列分析 学生姓名：xxx 学号：xxxxxxxxxxxx 年级专业及班级：2007级动物 医学（动检）班 指导老师：xxx 副研究员 学院：动物医学院 摘要 l本论文克隆了2株来自长沙和湘潭两地的两株猪巨细 胞病毒(PCMV)的DNA聚合酶(DPOL)基因，其基因全 长均为3024 bp，编码含1007个氨基酸的多肽。采用 生物信息学方法对所测DNA及推导的氨基酸序列进行 了分析，并与GenBank中已知的PCMV分离株的序列 进了比较分析，发现这两株病毒间存在12个氨基酸差 异，同源性为98.8%，与GenBank中其它已知毒株的 同源性为99-99.6，表明DPOL基因在不同毒株间 高度保守。本文结果为进一步研究PCMV的基因组特 征提供了基础。 前言 1、PCMV 猪巨细胞病毒感染也称包涵体鼻炎，主要 侵害猪的鼻甲黏膜、黏液腺、泪腺、唾液腺及 肾小管上皮，在易感的种猪中可引起胎儿和仔 猪发育不良、鼻炎和肺炎以及增重缓慢等临诊 症状，成年猪多为隐性感染。由于该病毒的性 质及病变分布与人的巨细胞病毒和豚鼠的唾液 腺病毒相似，故称之为猪巨细胞病（porcine cytomegalovirus，PCMV)。 2、病理变化 感染该病毒之后病畜鼻甲骨粘膜呈扁平化，纤 毛脱落，粘膜固有层见有圆形细胞浸润和水肿 ，特别是见有管胞状腺上皮细胞肥大和核内形 成嗜碱性包涵体(此正常核大510倍)。 3、临床症状 仔猪该病常发生于13 周龄的仔猪， 发病程度与 从初乳中获得母源性抗体的多少有很大关系。510 日龄仔猪感染后，呈现急性经过，其主要症状是呼吸 道症状，如喷嚏、咳嗽、流泪、鼻分泌物增多，继之 出现鼻塞、吮乳困难，体重很快减轻。如果无母源抗 体的仔猪感染，则可能发生鼻衄、颤抖和呼吸困难等 症状，甚至在发病后5 d 死亡，1 窝感染该病的仔猪 中死亡率可高达25 %。其他耐过的仔猪表现增重变慢 、生长发育不良，并有可能持续排毒成为僵猪。 研究目的及意义 l目前国内对于这个病毒基因的研究还不是很多 ，本文结果为进一步研究PCMV提供了基础。 目前PCMV的诊断方法 l1 PCR诊断技术 l2 血清学诊断方法 方法 根据GenBank中已知序列，在保守区设计 PCMV检测引物和DPOL基因扩增引物。利用 PCR扩增法获取DNA聚合酶基因片段序列，然 后采用DNAMAN进行序列对比。 表 PCMV检测及DPOL扩增引物 Name Sequence (5-3) Expected product (bp) Purposeb PCMVDF PCMVDR GAATACACTGAAGCAAGCGATGATG AATCTCGGCAGCGGAAAAACAT 336 PCMV detection PCMV3F PCMV3R TTGCGGGTAAGGAGGCGTATT GTTTCGCTGGGCACTTCACAG 1241 Amplification of gB and DPOL PCMV4F PCMV4R GTAAAAATCTGCGTCAATGTGTT-3 GATTATTGGCTATCATTATGCTG-3 1366 Amplification of DPOL PCMV5F PCMV5R GGTTACTATGCTTCTCCAGTGATTGT CGGATGACATAAATGAAAAATACG 1040 Amplification of DPOL 结果 l获得的两株病毒（湘潭，HN0601；长沙，HN0901 ）的DPOL基因编码区全长都是3024 bp，编码1007 氨基酸的多肽，与其他已知DPOL蛋白具有相同的长 度。十二个氨基酸替换发现两者之间，他们之间的同 源性为98.8。同时与GenBank其他已知的四株病毒 的DPOL基因进行比较 (其登录号分别为: AF268039, B6; AF268040:55B; AF268041:OF1;AF268042:489 ），发现我们所测的两株病毒的DPOL的氨基酸序列 与它们具有9999.6的相似性，而所有菌株的 DPOL蛋白之间的同源性为98.899.6，表明 DPOL基因在不同PCMV毒株间高度保守。 讨论 l迄今为止，人们对PCMV的基因组和PCMV分 子流行病学了解仍然十分有限，除了少数文献 分别介绍了gB, MCP，DPOL外。对我国 PCMV的D