帕金森病课件_9

帕金森病 中国医科大学 神经生物学教研室 掌握内容 1.概念：帕金森病；基因修饰细胞 2.帕金森病的病理表现及发病的病理学基 础 3.基底神经节环路的调节方式 4.帕金森病的发病机制 一、定义 帕金森病（Pakinsons Disease, PD） 又名震颤麻痹（paralysis agitans）， 由Parkinson（1817）首先描述，是一 种进展缓慢，原发于黑质-纹状体通路 的锥体外系变性疾病。临床上以静止性 震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异 常为主要特征。 临床表现 肢体震颤 肌强直 运动迟缓 姿势平衡反射消失 其他症状 Monograph by James Parkinson 1817 流行病学 PD在60岁以上人群中患病率为 1000/10万，并随年龄增长而增高，两 性分布差异不大 是一种常见的中老年人神经系统变性 疾病 病理 主要病理改变是含色素的黑质致密 部DA能神经元变性、缺失 出现症状时DA能神经元常丢失50% 以上，症状明显时神经元丢失严重 ，残留者变性，黑色素减少 以黑质、纹状体减少为主，皮层和 下丘脑并不减少 病理改变 PET显示PD脑内DAT功能显著降低 病理 胞浆内出现特征性嗜酸 性包涵体-Lewy小体，a -突触核蛋白是Lewy小体 中重要成分 类似改变也见于蓝斑、 中缝核、迷走神经背核 等，程度较轻 病理特点 总之，典型病理特点是： 进行性黑质含色素多巴胺神经元大 量丧失(50%70%) 路易(Lewy)小体有a-突触核蛋白沉 积 病理改变 a. 黑质萎缩 b. 与正常对照比较 Parkinson病 a.黑质致密部Lewy体， H&E b.改良Bielschowsky 银染技术 生化病理 脑内存在多条DA递质通路，最重要为黑 质-纹状体通路 左旋酪氨酸 TH L-DOPA DDC DA 该通路DA神经元在黑质致密部，正常时 自血流摄入左旋酪氨酸，经细胞内酪氨 酸羟化酶(TH)转化为左旋多巴(L-DOPA) 再经过多巴脱羧酶(DDC)转化为DA DA通过黑质-纹状体束作用于壳核和尾 状核细胞 Levodopa Mechanism 黑质-纹状体多巴胺系统功能紊乱， 多巴胺含量显著减少(80% 99%) 该生化异常与临床症状严重程度成正 比 PD发病的病理学基础：黑质-纹状体 多巴胺能神经环路 生化病理-基底节的神经生化解剖简图 DA神经元对纹状 体GABA源性递质 释放起抑制作用 ACh神经元对纹状 体GABA源性递质 释放起兴奋作用 生化病理-帕金森病基底节神经生化病理学 DA神经元变性(黑圈 及虚线)破坏纹状体 GABA神经元的多巴 胺抑制与ACh兴奋的 平衡 净效应是增加纹状体 GABA释放 帕金森病生化病理 病因及发病机制 本病病因迄今未明-原发性PD (idiopathic Parkinsons disease)。 发病确切机制还不完全清楚，20世纪80年 代以后，对PD发病机制的研究有两个突 破性发展：其一基底核神经回路的平衡 失调成为PD发病的病理基础；其二DA 氧化应激学说成为黑质部位DA神经元退 化的理论基础。 一、基底神经节环路与帕金森病 锥体外系的运动调节中心区：基底神经节 运动调节的关键递质：多巴胺 基底神经节（basal ganglia）包括：纹状体 （striaturn, corpus striaturn）、黑质 （substantia nigra, SN）、丘脑底核和杏仁 核。 基底神经节的主要功能：控制肢体肌张 力，全身运动协调，维持姿势调节反射 和下运动神经元的反射控制 基底神经节损害：肌张力不全运动增 多综合征或肌张力增高运动减少综合 征 基底神经节接受来自大脑皮层有关运动区的传入 冲动，基底神经节的传出冲动又通过丘脑返回皮质的 特定区域，构成了5条不同通路的皮质-基底节-丘脑- 皮质反馈的神经环路。 基底神经节环路的调节方式：直接通路；间接通 路；黑质-纹状体多巴胺通路。 基底核调节运动的神经回路 （一）直接通路 皮层谷氨酸能神经元 纹状体GABA神经元 释放GABA递质 苍白球GABA神经元 丘脑对谷氨酸神经元抑制作用 谷氨酸释放增加 皮层运动神经元活性增加。 （二）间接通路 皮层谷氨酸能神经元 纹状体GABA神经元释 放 GABA递质 苍白球GABA神经元 丘 脑底核的谷氨酸能神经元纤维投射到苍白球的神 经兴奋性 苍白球的GABA神经元释放增加 丘脑谷氨酸能神经元兴奋性降低 皮层运动 兴奋 抑制减弱 兴奋 抑制 抑制 （三）黑质-纹状体多巴胺通路 直接环路：D1受体介导的，GABA/肽类神 经 递质(SP)/强啡肽(DYN)参与的 调 节环路，起兴奋调节效应 。 间接环路：D2受体介导的，GABA/脑啡肽 (ENK)/神经营养素(NT)参与的 调 节环路，起去抑制调节效应。 二者易化运动效果，相互协调作用， 平衡锥体外系运动功能。 T Dopamine: Inhibitory Ach: Excitatory GABA: Inhibitory DA neuron generated 三、PD的发病机制 （一）环境因素与PD发病 参与PD发病的物质： （1）N-甲基氨基-L-丙氨酸（L-BMMA ） （2）长期接触铜、锰、铁、铅或长期暴露 于杀虫剂 （3）N-甲基1,2,3,6四氢吡啶（N-methyl- 4-phenyl-1,2,3,6-tet-rahydro-pyridine ， MPTP ） （二）多巴胺(DA)的氧化应激学说与 PD发病 脑内生成的自由基可以攻击脑内的多 巴胺神经元，使之产生神经细胞的退化性 病理变化。 氧化应激损伤是黑质多巴胺神经元死 亡的主要原因，导致氧化应激损伤增高的 可能原因：外源性毒物的侵入；DA的 氧化应激代谢；神经黑色素的存在； 清除自由基的能力不全。 1、DA的氧化应激代谢 在DA的代谢过程中，77%DA被星形神经胶 质细胞内的单氨氧化酶B( MAO-B )所氧化， 23%DA被神经元内MAO-A氧化代谢。在O2存 在的情况下，此MAO-A催化DA代谢为34-双 羟苯乙酸（DOPAC）的同时生成过氧化氢（ H2O2），DOPAC在单胺氧化酶甲基转移酶的作 用下代谢生成高香草酸（HVA）。 在生理的条件下，DA的酶促反应代谢较快 。但在氧化应激的条件下，神经细胞内的DA可 通过非酶促反应来进行代谢，在铁离子的参与下 ，反应加快，被氧化生成醌类衍化物，并进一步 形成黑色素。 多巴胺在神经元中的酶代谢及其代谢产物 在DA代谢过程中，产生超氧阴离 子（O2-）和H2O2；此外，多巴胺又可 以被代谢形成6-羟基多巴（6- hydroxyldopamine, 6-OHDA），后 者又可以作为单胺类神经递质的化学切 割剂进一步损伤多巴胺神经元。 该途经生成的H2O2通过Fenton反 映，形成羟基和羟自由基。 H2O2 + Fe3+ OH - + OH 2、铁离子参与DA的氧化应激 脑内的铁离子（Fe2+和Fe3+）主要分布在黑 质、纹状体和苍白球，尤其是在黑质。在PD病 人的脑内发现铁离子的含量明显升高，并呈现以 下三方面的特点： 在黑质的铁离子浓度异常升高，但其它脑区并 不升高； 铁离子含量升高，但铁蛋白的含量不变； Fe3+含量升高，但Fe2+的含量不变。 这些特点提示黑质铁离子的升高可能与PD 的发病过程有关。 铁离子的促进氧化应激的作用可以通过以下 几条途径： 如前所述，加速非酶促反应的DA自身氧 化生成H2O2和O2-。 促进H2O2和O2-形成OH。 促使脂质过氧化物的分解。 铁离子与黑色素结合沉积于黑质，催化 自由基产生。 DA神经毒的氧化应激机制示意图 由上述可以得出多巴胺引起儿茶酚胺的细胞 死亡主要通过以下三方面的机制： 细胞内和细胞外的多巴胺的自身氧化产生 自由基； MAO介导的多巴胺代谢产生的过氧化氢； 多巴胺对线粒体呼吸链的直接抑制作用。 （三）遗传易感性 参与PD发病的遗传调节因子： 1、-神经突触核蛋白(-synuclein, -SN) ： 除分布在神经突触末梢外，在神经细胞核内也 有分布，因此称为神经突触核蛋白，可分为、和 三种 。 有几个PD家系的患者-SN有突变位点，主要 位于染色体臂的4q21-q23，呈染色体显性遗传。 -SN致蛋白空间结构改变，可引起DA神经元 选择性毁损，且需要达到一定量才会发生作用。 在MPTP制备的PD模型上观察到，黒质神经元 上-SN表达呈时间依赖性上调，并与DA神 经元退变平行。 2、Parkin ：parkin基因突变与早发性PD 有关。Parkin主要位于神经元胞浆和突触中 ，与突触传递有关，功能与泛素样蛋白裂解 有关，参与泛素蛋白酶体复合物降解异常 蛋白的功能，若此复合物的功能减退，则导 致异常蛋白选择性聚集在黒质多巴胺神经元 ，妨碍多巴胺递质释放和运输，产生PD样症 状，同时产生细胞毒性，导致细胞死亡。 3、细胞色素P450同工酶 ：能代谢很多内外源性物 质。 亚家族CYP 2D6 可能与PD发病有关；在肝脏 MPTP通过 CYP 2D6的代谢形成非毒性产物，而在 脑中则经MAO-B代谢形成有毒性的产物MPP+。如 果细胞色素P450酶基因和阿朴脂蛋白E同时改变时 ，则诱导PD的发病的可能性加大。 （四）线粒体功能缺陷 MPTP 1-甲基-4-苯基吡啶离子 (MPP+) 动物（特别是灵长类动物） 产生类似PD的病理及临床特点 机制：阻断线粒体呼吸链复合物I （五）兴奋性氨基酸的毒性作用 兴奋性氨基酸L-谷氨酸与PD的发病有 关 ，主要通过N-甲基-D天冬氨酸 (NMDA)起作用。 MAO-B 诱发 主要机制： 老龄动物神经突触线粒体内膜上的谷氨酸载体的转运 活性明显 谷氨酸和天冬氨酸的线粒体的内外交换 发生障碍 谷氨酸在细胞内大量堆积，同时神经细胞 间隙的谷氨酸不能及时地被再摄取，引起NMDA型谷 氨酸受体持久性激活 （1）改变Ca2+、Na+、Cl-等离子的通透性 ，破坏细 胞的生理稳态平衡，使细胞肿胀、变性和坏死 ； （2）诱发线粒体内自由基的生成 ； （3）引起线粒体肿胀和功能异常 。 黑质变性 PD （六）其他 1、炎症反应参与PD发病过程 PD病人和长期暴露于MPTP的黑质和纹 状体有胶质增生和反应性小胶质细胞；在PD的 黑质中已经观察到有胶质细胞表达的白介素、 干扰素、肿瘤坏死因子等炎症反应介质。 2、细胞凋亡与PD发病 细胞凋亡参与神经细胞的发育和老化的生 理和病理过程，尚无明确的证据说明凋亡是否 参与PD的发病，有些现象提示凋亡可能参与PD 的发 病。 有研究表明，MPP+ 可诱导细胞内凋亡，而细胞 凋亡因子Caspase抑制可降低MPTP的神经毒性 。 3、免疫异常与PD发病 PD患者的血清对大鼠中脑DA神经元有抑制作用， 并呈补体依赖性的抑制效应。PD患者中多数的病人脑 脊液中含有能与黒质多巴胺神经元起免疫反应的抗体 ，即多巴胺神经元抗体 ；进一步的研究发现，PD患者 中有78的病人脑脊液中含有多巴胺神经元抗体，而 对照组病人的脑脊液中仅有3的人含有多巴胺神经 元抗体。 主要临床表现 主要症状 静止性震颤 肌强直 运动迟缓 姿势步态异常 初发症状：震颤最多(60%70%)，步行障碍 (12%)、肌强直(10%)、运动迟缓(10%) 帕金森震颤 多数患者以震颤为首发症状。一侧上肢远端( 手指)开始，逐渐扩展到同侧下肢及对侧肢体， 下颌、唇、舌及头部最后受累。 静止性震颤，46次/秒。拇指与食指“搓丸 样”(pill-rolling)动作，安静时出现。 多为不对称性。 情绪激动或精神紧张时加剧，睡眠中可完全消 失。 肌强直 初期患者感到患肢运动不灵活，有僵硬 或紧张的感觉，出现动作困难。 对侧肢体的自主运动可诱导出肌张力的 增高。 “铅管样强直”、“齿轮样强直”。 运动迟缓 因肌张力增高、姿势反射障碍，使起床、 翻身、步行、变换方向等运动迟缓 病人有运动启动困难和动作执行困难，是 病人最常见和较特殊的表现。 早期以肢体远端受累 对左旋多巴治疗反应好 运动迟缓的具体表现运动迟缓的具体表现 一般性表现： 动作启动困难 自主动作变慢、幅 度变小 重复动作易疲劳 做序列性动作困难 不能同时做多个动 作 僵住 特殊表现： 解系鞋带、扣纽扣 难 “小写症” “面具脸” 手摆动减少 流涎 言语减少，语音低 沉、单调。 运动迟缓(bradykinesia) 表情肌活动少，双眼凝视，瞬目减 少，呈面具脸(masked face)，流涎 手指精细动作(扣纽、系鞋带等)困难；做 序列性动作困难，不能同时做多个动作 随意动作减少，始动困难 小写症 (micrographia) 姿势步态异常 站-屈曲体姿 行-步态异常 转弯-平衡障碍 早期下肢拖曳 ；之后小步态 、启动困难、 行走时上肢摆 动消失 屈曲体姿 四、四、PDPD的诊断和治疗的诊断和治疗 诊断标准 1.静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势性 反射障碍；四个症状和体征中的二个。 2.排除帕金森综合征 没有可以引起继发性帕金森病的病因： 如脑外伤、脑血管疾病、病毒感染、金属中 毒、一氧化碳中毒等。 3.必要时可结合左旋多巴实验或阿朴吗啡实 验。 修订的帕金森病诊断标准： 有下列表现三项以上的可以诊断： 1. 起病：一个或多个肢体的运动缓慢、静止 性 震颤。 2. 明显的单侧分布起病形式。 3. 铅管样或齿轮样强直，伴有面部、躯干或 肢体的运动减少，姿势反射异常等。 4. L-DOPA治疗两个月内反应良好（改善 25%以上）。 左旋多巴可以改善临床症状，降低死亡率， 是治疗PD的金标准 不支持PD诊断的症状和体征： 1. 下运动神经元损害。 2. 失用性步态障碍。 3. 小脑症状、意向性震颤。 4. 凝视麻痹。 5. 明显的痴呆伴轻度锥体外系症状。 6. 严重的自主神经功能障碍。 （二）PD的治疗 1、 药物治疗 药物治疗是目前最常用的方法，主要针对增 加多巴胺递质而改善症状： （1）左旋多巴：是数十年来最主要的治疗药物 ； （2）单胺氧化酶B（monoamine oxidase B, MAO-B）：抑制多巴胺的代谢； （3）多巴胺受体激动药：激活纹状体神经元上 的 D1和D2多巴胺受体，增加多巴胺含量 ； （4）乙酰胆碱抑制药。 2、其他正在进行临床试验的新疗法 （1）多巴胺能组织移植 （2）多巴胺和去甲肾上腺素的微球体注入纹 状体内，能可控地释放多巴胺 ； （3）神经营养因子（neurotrophic factors, NTFs）的治疗 A:胶质源性神经营养因子（GDNF） B:脑源性神经营养因子（BDNF） GDNF和BDNF能提高多巴胺能神经元 的生存能力，减少MPTP和6-羟多巴对黑质 纹状体系统的损害，改善6-羟多巴所致的 旋转症状。 C:碱性成纤维细胞生长因子( bFGF) 能提高多巴胺合成酶-酪氨酸羟化酶 (TH)免疫活性细胞的数目及活性。 将神经营养因子注入到黑质、纹状体 或脑室内可以挽救PD患者的多巴胺能神经 元，减轻黑质纹状体系统损害产生的震颤 麻痹症状。 3、基因治疗 PD的基因治疗策略： （1）导入编码多巴胺合成酶的基因以增加多 巴 胺局部含量； （2）将神经营养因子基因引入到黑质和纹状 体 以阻止或减缓多巴胺能神经元的退变， 甚 至促进损伤神经元的恢复。 基因导入的方式 ： （1）直接体内(in vivo)导入:载体 （2）间接体内(ex vivo)导入:细胞 3.1 基因转移的载体，用于直接体内的表 达载体 载体优点缺点 腺病毒载体（ Ad） 高滴度，外源基因容 量大，不依赖细胞分 裂而自然感染细胞 细胞毒性大 腺相关病毒载 体(AAV) 细胞毒性小，能有效 感染神经元 外源基因容量 小 HSV-1 低细胞毒性和免疫源 性，外源基因容量大 有潜在致病性 ，用途受限 3.2 用于间接体内的基因修饰细胞 基因修饰细胞：将外源基因克隆到一个合 适的载体并导入体外培养的自体或异体靶 细胞内，这种细胞即是基因修饰细胞。 表达载体：真核表达质粒和反转录病毒 靶细胞：神经元前体细胞、原代神经元、 神经胶质细胞、成纤维细胞和成肌细胞等 。 3.3 神经递质替代的基因治疗 将编码合成多巴胺的酪氨酸羟化酶( tyroxine hydroxylase，TH ) 和其他与多巴 胺合成相关的酶基因引入纹状体，是目前基因 治疗PD的主要策略 。 直接体内酶替代基因治疗 A: 将携带TH基因的HSV-1扩增子载体或 AAV载体注射到脑内，促进多巴胺合成； B: AAV同时介导TH和GTPCH-I/ADCC基因 进 入纹状体内，增加多巴胺含量 ； C: 编码D2受体的腺病毒载体进入大鼠纹状体 ， 增加D2受体的表达。 间接体内酶替代基因治疗 间接体内方法通常先用磷酸钙转染或 病毒感染的方法对靶细胞进行基因修饰， 再将携带目的基因的细胞植人脑内以达到 治疗目的。 移植基因修饰细胞的治疗效果明显， 但转移基因细胞的表达呈进行性下降，因 此，长期表达是需要解决的问题。 3.4 神经营养因子的基因治疗 神经营养因子的在PD中的作用： A: 能维持多巴胺能神经元的存活； B: 促进突起生长； C: 增强多巴胺神经元对多巴胺的摄取能力； D: 减轻或防止多巴胺能神经元的损伤，减轻 PD症状。 直接体内神经营养因子基因治疗 载体：Ad、AAV、HSV-1和慢病毒等病毒载体 神经营养因子：最主要的是GDNF GDNF作用：防止多巴胺神经元的破坏，对黑质 多巴胺能系统产生保护和修复作用，减轻PD症状 。 间接体内神经营养因子基因治疗 GDNF, BDNF, bFGF 成纤维细胞 、成肌细胞、星型胶质细胞 基因修饰细胞 黑质或纹状体 分泌神经营养因子 减轻PD症 状 反转录病毒载体 五、用于PD研究的动物模型 （一）帕金森病动物模型的发展： 19世纪50年代，Carlson，腹腔内注射利血 平后，表现出了类似人类帕金森病的症状。 但是该模型不同个体间差别较大，而且其病 理改变与人类PD大不相同。 1968，6-OHDA 80年代初期，MPTP （二）利用6-羟多巴（6-OHDA）制备的 大鼠PD模型 1. 6-OHDA的建模机制： (1) 黑质内的6-OHDA与DA竞争摄取位点； (2) 细胞内外的氧化反应把6-OHDA分解后产 生活性氧，通过MAO诱导产生H2O2； (3) 直接引起线粒体功能障碍。 2. 6-OHDA制模的方法： 完全损伤模型 ：用成年健康SD大鼠或 Wistar大鼠麻醉后，固定于立体定位仪， 将6-OHDA定向注射于大鼠的内侧前脑束 （Medial Forebrain Bundle, MFB）或 黑质。 模型成功标准：模型制备成功后，外周注 射DA能受体直接激动剂（如阿普吗啡、左 旋多巴等）能诱发动物向健侧旋转，促DA 释放剂如苯丙胺等能诱发动物向损伤侧旋 转。 部分损伤模型 ： A: 小剂量6-OHDA黑质内注射； B: 黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNpc）周围注射 ，外侧单点注射和内外侧两点注射； C: 纹状体内注射。 3. 6-OHDA模型的行为测定与评定： 大鼠PD模型制备成功的标准：注入诱导剂后 ，通过旋转测量仪计算30分钟内大鼠旋转的总 次数，若超过平均7转/分钟，连续4周诱发旋 转次数稳定，表示损毁稳定，可认为模型制备 成功。 完全损伤模型 ：可模拟晚期帕金森病病人的 特征，主要用于黑质细胞移植，TH基因及胶 质源性神经营养因子移植等研究。 6-OHDA单侧损毁模型 ：用于PD的发病机制 及药物疗效判定、细胞移植治疗、基因治疗和 神经保护治疗等方面的研究。 （三）利用MPTP制作的帕金森病动物模型 1. MPTP制模的方法 . 非人灵长类动物双侧PD模型； . 非人灵长类动物偏侧PD模型； . 小鼠PD模型； . 猫的PD模型。 2. MPTP的制模机制：MPTP 主要通过MPP+ 发挥作用 （1）抑制线粒体的呼吸功能； （2）产生氧自由基和改变Ca2+流； 使黑质神经元细胞减少。 （3）低浓度的MPP+能诱发黑质细胞发生凋 亡，而高浓度的MPP+则导致细胞死亡。 3. MPTP模型的行为测定与评价： . 非人灵长类双侧PD动物模型： 较少用 . 非人灵长类偏侧PD动物模型：是目前建 立 机制、诊断和治疗等方面的研究。 . 猫PD模型： 在PD基础和临床药理研究方 面具有很好的应用价值。 . 小鼠MPTP模型：主要用于检测药物毒性 机 制等实验，一般不进行行为测定。 （四）利用其它药物和方法制作的PD动物模 型： 1. 遗传学模型：-神经突触核蛋白基因和 Parkin基因PD动物模型。 2.免疫损伤模型：将PD患者血清免疫球蛋白 或免疫激活剂脂多糖（LPS）立体定向注 入 大鼠一侧黑质区制备PD动物模型。 3.大鼠机械损伤模型：用特制的Scouten电 线 刀行内侧前脑束轴突切断术或中脑半切术 。 4. 其他药物模型： . 除草剂PD模型：某些除草剂（如百草枯 ） 结构与MPP+相似，可用来制作PD动物 模 型。 . 鱼滕酮PD模型：鱼滕酮可抑制脑组织线 粒体呼吸链复合体I的活性； . 拟胆碱药物模型： . 抗DA制剂： 有人发现PD是由于中脑的黑