狂犬病疫苗治疗抗体及其诊断课件

狂犬病疫苗、治疗抗体及其诊断 武汉生物制品研究所 孟胜利 一、狂犬病毒病原学 二、狂犬病疫苗、抗体的应用 三、狂犬病抗原抗体的诊断 狂犬病:现状 我国狂犬病近年来发 病人数逐年递增，据 统计我国2003年狂犬 病病死人数达2037人 ，是10年来最高峰， 截至今年12月，全国 狂犬病死亡人数已超 过3000人。 中国狂犬病死亡数连续6年明显回升 人群中特别是少年儿 童易受宠物的攻击， 且头面部咬伤居多， 019岁者占发病人 数的40。 狂犬病患者 中典型三恐 （恐风、恐 水、恐光） 病症占60 。 另有40%为 不典型症状 。 狂 犬 病 的 传 染 源 甲醛、乙醚、升汞、过氧 化氢、高锰酸钾和季胺类 化合物（如本扎溴铵）等 化学药品对狂犬病毒都有 杀伤作用。 1%甲醛或3%来苏尔15分钟 可使病毒灭活。 20%乙醚、10%氯仿、75%酒 精、5%碘酊和0.1%胰蛋白 酶等也可使病毒灭活。 狂犬病毒理化特性 狂犬病毒对温度的抵抗力很弱，在高温下很 不稳定。病毒悬液56。C，30分钟或60。C，10 分钟即可灭活。煮沸2分钟，病毒全部死亡。 但是保留在机体组织内的病毒加温灭活的时 间要延长些。 含有狂犬病毒的脑组织在常温下可保存活力7 -10天，在日光和紫外线照射下，或强酸、强 碱的环境下，病毒灭活的时间会缩短。 狂犬病毒在Ph7.4-8.0较为稳定，若pH超过7- 9的范围，则病毒易灭活。 狂犬病毒的感染特点 狂犬病毒一般是通过破损的皮肤或黏膜 进入人体的。狂犬病毒在体内典型的感染过 程是由唾液中带有狂犬病毒的疯动物咬伤， 使病毒从伤口侵入机体内。在侵入部位一般 不增生，也不侵入血液，故无病毒血症。狂 犬病毒从侵入局部进入周围神经组织内，沿 着神经向心传递至中枢神经系统。病毒运行 、扩散过程的长短与潜伏期有关，一般为20- 60天或更长或更短，这与病毒侵入部位和数 量有关，在此过程中，若对机体进行疫苗接 种，提高机体的抗感染能力，则可预防发病 。 一旦狂犬病毒进入中枢神经，侵犯脑和脊 髓的神经细胞，并大量增生，则引起神经细胞 功能紊乱和退行性病变，机体开始出现症状， 一旦发病，目前尚无法医治，病死率为100 。狂犬病毒在脑神经细胞中大量增生后，通过 传出神经离心性地向外扩散到周围神经及其所 支配的组织中，从而引起广泛的非神经组织的 感染，常累积于唾液腺，病毒大量增生而由唾 液腺排除体外，一般出现典型的狂犬病症状后 一周内死亡。 3040的狂犬病患者病程晚期脑部 大量增生的狂犬病毒突破血脑屏障进入血 液，诱导产生极高水平的狂犬病毒抗体， 一般高出疫苗诱导抗体水平的100倍，对 于不典型症状的狂犬病病例可通过这一指 标作实验室确证。 人狂犬病潜伏期 潜伏期 365 (天) 病例数 0 464 846 226 19 （） 0 29.8 54.4 14.6 1.2 WHO推荐的暴露后治疗指南 分类暴露类型推荐的治疗方法 I触摸或饲养动物 舔在完整皮肤上 如有可靠的病史， 不必处理 II轻度抓伤或擦伤但未出血 舔到有破口的皮肤 立即接种狂犬病疫 苗 单一或多处穿过皮肤的咬 伤或抓伤 粘膜被唾液污染（如舔） 立即接种狂犬病疫 苗及免疫球白 狂犬病发病与抗体消长趋势 疫苗注射 0天 7天14天 180天360天 自主抗体低水平期 3天 28天 体内自主抗体水平 发病率 43天103天 体内被动免疫抗体水平 被动免疫 二、狂犬病疫苗、抗体的应用 国内外抗狂犬病血清临床使用效果 时间 地点 肇事动物 重伤人数 处理 死亡人数 死亡率 1954 伊朗 疯狼 13 疫苗抗血清 1 7.7% 5 单用疫苗 3 60 1981- 中国 疯狼 26 疫苗抗血清 0 0 1982 3 单用疫苗 3 100 17年间 伊朗 364 疫苗抗血清 19 5.3% 298 单用疫苗 75 25 1957- 苏联 22 疫苗抗血清 0 0 1958 28 单用疫苗 11 39.3% 俞永新等狂犬病和狂犬病疫苗中国医药科技出版社 2001年 p190-191 抗狂犬病血清使用方法 WHO建议重度咬伤、多部位咬伤者尤其应尽量多用于伤口 处作浸润性注射狂犬病毒抗血清，使局部伤口处抗狂犬病 毒抗体含量足够多，用以中和伤口处肥皂无法到达部位的 狂犬病毒，剩余的抗血清肌肉注射于另一上臂。 人狂犬病免疫球蛋白使用量为20 IU/KG体重,马抗狂犬病 血清使用剂量为40 IU/KG体重。不得增多用量。只能一次 注射,不应多次注射。不应提早于疫苗注射。 在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病 疫苗和抗血清。 应在清洗伤口后立即使用，最迟不超过7天。 马血清使用前应作过敏试验。 中国狂犬病疫苗的发展过程 使用年代 制备来源 效力 注射次数 第一代狂犬病疫苗 羊脑组织疫苗 0.8 IU/ml 21 （20世纪6070年代） 第二代狂犬病疫苗 地鼠肾细胞疫苗 原倍疫苗 1.3 IU/ml5 （20世纪8090年代） 浓缩疫苗 2.5 IU/ml 5 第三代狂犬病疫苗 Vero细胞纯化疫苗 2.5 IU/ml 5 （21世纪） 0.1 9911CBG 9908CBG 9916CBG 9719cCAMB 02006CBGGX 9912CBGGX 01017VNMGX 01016VNM 8743THA 8734THA 8758cTHA 8760cTHA 8738THA 8664cTHAI 02005 9910LAO 02002LAO 02001LAOGX 9914CBGGX 9915BIRGX 9909BIR 9913BIRGX 8677cMAL 02042CHIGX 02041CHIGX 02045CHIGX 02043CHIGX 02044CHI 02040CHIGX 9811CHI 02035CHI 02036CHI 02037CHI 03003INDOFL 9707CHIGX 02050CHIFL 94270PHI 94280PHIGX 94273PHIGX 03007PHI 03006PHI 02047CHIGX 02049CHIGX 02046CHI 9709cCHI 9702INDI 94257cSRI 9903NEPGX 9902NEP 9901NEP 94260cNEP 02052 9706CHIGX 8690CHIGX RCHL CVS PV aG CTN 亚洲街毒分离株N基因序列进化图 中国街毒1组 中国街毒3组 中国街毒2组 中国街毒4组 街毒3组 街毒2组 街毒4组 街毒1组 武生旺宁的制备流程 VERO细胞 狂犬病毒CTN株 继续培养 收获培养上清 超滤、分子筛层析纯化精制并灭活 分装待检 生物学检定及生化检定 合格后发货 武生旺宁精制苗的纯度 纯化后去除了 9598的杂 蛋白 残余牛血清含 量50ng/ml 狂犬病疫苗临床反应观察结果 产品厂家 试验观察 全身反应 局部反应 血清中和抗体 人数 平均效价 阳转率 武生旺宁 304 4.28% 7.24% 11.89 IU/ml 100% 国外产品 50 8.0% 3.6% 10.08 IU/ml 100% 国内产品 50 34.0% 25.6% - - 狂犬病疫苗临床反应观察结果 武生旺宁免疫动物街毒攻击保护性试验 旺宁稀释度 街毒株攻击途径 实验小鼠数 存活小鼠数 存活率（ ） 原倍 颅内攻击 10 10 100 1:5 颅内攻击 9 9 100 阴性对照 颅内攻击 9 1 11.11 原倍 肌肉攻击 10 10 100 1:5 肌肉攻击 10 10 100 阴性对照 肌肉攻击 10 1 10 微生物学免疫学进展 2000年 28(1):10-11 NIH效力测定结果 狂犬病疫苗品种 批号 效力(IU/ml) 武生旺宁 20040202 2.99 NE1 20040102-01 0.82 N 2004020503 2.12 E 20031202.30 1.28 NE2 200403013-12 0.30 NE3 20031203-4 0.58 NE4 20031234 0.30 我国药典规定, 狂犬病疫苗NIH效力必须达到 2.50 IU/ml 以上方 为合格 武生旺宁的效力 批号 效力(IU/ml) 批号 效力(IU/ml) 20020201 3.77 20030101 3.21 20020302 2.61 20030102 3.63 20020503 2.67 20030103 2.94 20020604 2.55 20030204 2.82 20020905 2.92 20030205 3.10 20021006 3.36 20030206 2.90 20021007 5.00 20030307 3.23 20021108 2.99 20030308 2.89 20021109 3.21 20030309 3.15 20021210 2.89 20030410 2.95 20021211 2.72 平均值 2.74 武汉生物制品研究所承担狂犬病疫苗 中国国家标准品的制备 武汉生物制品研究所起草 中国药典狂犬病疫苗规程 精制马抗狂犬血清柱层析纯化示意图 引起过敏反应 的血清成分 具有中和活性 的血清成分 三、狂犬病抗原抗体的诊断 1、狂犬病毒抗原的检测与诊断 (Diagnostic procedures for antigen detection) 狂犬病毒通常在感染的活体神经细胞中或体外 感染狂犬病毒的培养细胞的胞浆中形成尼氏小体 和病毒颗粒，而尼氏小体和病毒可以通过组织切 片或以荧光素标记的特异性抗体进行免疫组化染 色或其他方法进行检测，这些方法用于实验室诊 断既精确、又快速和经济。尼氏小体大多出现在 海马回、大脑皮质的锥体细胞和浦肯也氏细胞中 ，较少出现在丘脑、桥脑、髓质、脊髓和感觉神 经节等神经组织中，因此在进行神经组织为标本 的实验室诊断中，其标本的选择就显得尤为重要 。 通常采用非常简单的手术即可暴露海马回 ，打开颅骨暴露脑组织后沿大脑半球背面 半球沟外测2cm处往下通过灰质和白质直到 侧脑室纵切35cm，掀开上部脑半球，即 可露出光滑的形似蚕豆状的海马回，取出 海马回、部分小脑和脑干，分别在载玻片 上印压制成脑印片，室温干燥后浸入丙酮 30分钟，取出晾干即可用于荧光抗体实验 。 1. 荧光抗体实验 Fluorescent Antibody Test (FAT) 狂犬病毒感染的细胞内有由狂犬病毒核衣壳 聚集形成的包涵体。以提纯的狂犬病毒核衣壳免 疫实验动物制备的多克隆抗体，或抗核衣壳单克 隆抗体与异硫氰酸荧光素偶联后，用直接免疫荧 光法可特异地与这些包涵体结合，该方法是狂犬 病毒实验室诊断最精确、快速和最可靠的方法。 狂犬病毒抗原 荧光标记抗 狂犬病毒抗体 免疫荧光实验检测狂犬病毒抗原 脑或神经组织的印片、涂片或冰冻切片经过 标记有异硫氰酸荧光素的狂犬病毒抗血清或球蛋 白处理后，在紫外线激发下，通过荧光显微镜即 可检测，狂犬病毒阳性标本中分布有大量的黄绿 色荧光颗粒，呈不同的形状和大小，较大的圆形 或椭圆形发强烈荧光者为内基氏小体（Negri bodies)，而象沙粒或灰尘的较细小的荧光粒子及 丝状荧光物为神经元或树突中含有的狂犬病毒颗 粒，荧光颗粒大小范围为0.24-27m。 由于狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑 干处，因此合适的取样部位对抗原的检测 很重要。脑样品印片必须用丙酮固定30分 钟，因为丙酮可去除细胞膜表面的脂类， 以便抗体到达细胞内与狂犬病毒结合。待 测脑样品必须在含50%甘油的生理盐水中0C 以下保存，印片染色前需用生理盐水洗涤 数次，印片及丙酮固定过程需要在P3实验 室中进行。 武汉生物制品研究所徐葛林等采用多种抗 狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体混合物标记 荧光素，经法国巴斯德研究所多次实验， 分别检测了人、犬、猫、狐狸、臭鼬、蝙 蝠等12种动物来源的样品，包括目前已知 的狂犬病毒7个基因型在内的共计360多份 样品，与BIO-RAD同类产品相比，证实我国 制备的荧光抗体具有非特异性小、灵敏度 高、使用前不需用正常鼠脑吸附的特点， 得到国外同行的认可。 荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反 应，因此制备特异性、高效价的抗体是FAT 的关键。目前有关狂犬病毒FAT检测试剂已 完全国产化，1999年用该方法检测了我国 广西狗肉市场上出售的食用狗的脑组织， 结果发现在154份外观健康的犬中，有5份 为狂犬病毒抗原阳性，通过乳鼠颅内接种 已分离到这5株狂犬病街毒株。 2.快速狂犬病酶免疫诊断法 Rapid Rabies Enzyme Immunodetection (RREID) RREID可通过检测脑组织中的狂犬病毒核衣壳 来诊断狂犬病。将标本于缓冲液或组织培养液中 研磨成30匀浆，1500g离心5分钟取上清，置于 微量反应板中孵育（该板已用抗狂犬病毒核衣壳 抗体包被），然后再用过氧化物酶标记的抗狂犬 病毒核衣壳抗体来检测被捕获的抗原，加显色底 物进行酶促颜色反应。对于一个给定的标本，通 过用肉眼观察颜色反应或用酶标仪测光吸收值， 再与阴、阳对照比较，即可得出有无狂犬病毒抗 原的结论。该方法所能检测到的基因1型狂犬病毒 最小核衣壳抗原量为0.8-1.0 ng/ml。 该方法由Perrin.P 于1986年建立，后经欧美6个 实验室试验，共检测了3000多个样品，结果表明 与FAT有很好的相关性（96%），由于不需要特别 的仪器和技术，该方法尤其适用于发达国家，但 其灵敏度略低于FAT。武汉生物制品研究所用抗狂 犬病毒核蛋白的单抗建立了用于检测狂犬病毒抗 原的双抗体夹心ELISA法，目前经与小鼠颅内接种 及FAT法相比较，检测了近1000份动物脑组织，结 果完全一致，该试剂盒对基因1型的狂犬病毒检出 灵敏度达到0.8 ng/ml，对狂犬病毒7个基因型均 能检出。 快速狂犬病酶免疫诊断法 抗狂犬病毒单抗 狂犬病毒样品 酶标抗狂犬病毒抗体 检测狂犬病毒核蛋白的双抗体夹心法已于 2004年11月份被中国药品生物制品检定所 列为我国狂犬病疫苗鉴别诊断试剂。 技术特点及要求 本方法具有灵敏度高、特异性好、操作简 单、重复性好、不需要昂贵仪器等特点， 最适合于作现场流行病学调查。本试剂盒 中酶标板包被后需立即使用或保存于-20C 备用。肉眼观察阳性对照显黄颜色，阴性 对照完全无色。所有显色样品，无论深浅 均认为是阳性。福尔马林固定的样品不适 宜作RREID。使用酶标记抗体前的加样、孵 育及洗涤过程需要在P3实验室中进行。 3.小鼠颅内接种分离狂犬病毒法（MIT） 狂犬病毒是嗜神经性病毒，可采用颅内 接种法分离后，再进行狂犬病特异性抗原 的检查。 可采用小白鼠接种分离，任何品种的实验 用小白鼠均可使用，一般选择体重10-20克 的健康小白鼠，雌雄不限。如用1-3日龄的 乳鼠，可提高分离病毒的阳性率。 可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒 的分离，一般前者病毒检出率要高于后者 ，但从流行病学观点考虑，检查唾液腺中 的病毒更显重要。脑组织需要预先用含10 50灭活牛血清的生理盐水或PBS或脱脂 奶研磨成10悬液，150200g离心5分钟 去除粗颗粒；唾液腺需切碎后再研磨，1 2层无菌纱布过滤后，颅内接种小鼠， 0.03ml/只。 狂犬病毒后潜伏期至少5天，一般观察21天 ，小鼠狂犬病症状一般为竖毛、战栗（用 镊子夹尾悬空时）、后肢失调（置于桌上 使其运动时）、麻痹、衰竭（濒死前）。 MIT法的特点 该方法灵敏度高，仅适于分离活的狂犬病 街毒，不适于因腐烂或其他原因导致病毒 灭活的样品。仅凭动物发病症状不足以确 定为狂犬病毒，需配合免疫荧光法作特异 性鉴定。耗时较长，不适于作快速诊断用 。需要在P3实验室中操作，并需要有经验 的技术员。 4.狂犬病组织培养感染实验(rabie tissue- culture infection test RTCIT) 上世纪70年代中期以来，各实验室相继用 婴地鼠肾细胞、BHK21、鸡胚细胞、成神经 瘤细胞分离街毒狂犬病毒。与小鼠颅内接 种法相比所需时间大大缩短，BHK21细胞培 养法的敏感性与小鼠颅内接种法相似，而 小鼠成神经瘤N2a细胞分离街毒比BHK21细 胞更为敏感。 狂犬病毒抗原的检测与诊断 30%脑悬液样品，5000rmp， 5min N2a细胞，继续培养24h后固定，加荧 光标记的抗狂犬病毒核蛋白抗体 细胞无荧光，表明样品中 不含狂犬病毒 细胞有荧光，表明样品中含有狂犬病毒 与MIT相比，RTCIT法操作简便、成本低、 耗时短，灵敏度与MIT相同，适于快速诊断 。由于狂犬病毒对感染细胞不形成空斑， 因此通过普通显微镜无法观察到细胞病变 ，借助于荧光素标记的抗狂犬病毒核蛋白 即可检查出感染的细胞。 动物脑组织用含抗生素及10灭活牛血清的EMEM 培养液研磨成0（w/v）悬液后2000g离心30分钟 ，取上清0.1ml加入0.1ml的N2a细胞悬液（5105 细胞/ml）于96孔微量细胞培养板孔中，37C 5 CO2孵箱中培养24小时，甩出培养液，板孔用80 冷丙酮室温固定30分钟，甩干，晾干后加入荧光 素标记的抗狂犬病毒核蛋白的抗体，37C孵育45 分钟,PBS洗涤即可通过荧光显微镜观察。胞浆中 有黄绿色荧光颗粒的为狂犬病毒阳性，无荧光颗 粒者为狂犬病毒阴性。 狂犬病毒抗原的检测与诊断 诊断技术 免疫荧光 快速酶 小鼠颅内 细胞培养 胶体金 实验 免疫诊断 接种 分离技术 免疫层析法 所需时间 2-3h 3-4h 5-10d 20-24h 5-10min 特异性 99.99% 99.96% ND 99.99% ND 敏感性 99.99% 98.06% ND 98.21% ND 二 狂犬病毒抗体的检测（Tests for the determination of rabies antibody） 滴定抗狂犬病抗体是为了测定接种对象在暴露后 治疗末期或暴露前免疫的抗体水平。 WHO狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5国际单 位（IU）/ml的抗体水平才具有足够的保护性，如 果滴度低于0.5IU /ml，必须给予加强剂量，直到 抗体达到要求的水平。 也可在血库中进行抗体滴定以筛选来自免疫供体 的血浆样品，用以制备治疗用人狂犬病免疫球蛋 白（HRIG）。 特异狂犬病抗体的检测也有利于不明原因病毒性 脑炎病人的病原学诊断。 1973年第七届WHO狂犬病专家委员会推荐的 标准检测方法有小鼠中和试验（MNT）空斑 减少试验亦即随后发展成的快速荧光灶抑 制试验（RFFIT）。 RFFIT为现代试验室的首选方法，其敏感度 至少与MNT一致。 小鼠中和试验 三倍系列稀释待测血清 预先滴定过的中和用狂犬病毒 （设已知国际单位的标准血清对照） CVS鼠脑悬液（稀释成30- 300LD50） 等量混合 37保温1小时后 37中和1小时 复滴定LD50 颅内接种10-12克小白鼠 观察并记录小鼠发病及死亡情况 根据试验结果计算中和指数及中和抗体含量 特点： 可定量检测狂犬病毒中和抗体效价； 需专门技术培训，操作较繁琐； 实验周期需14天，耗时长，不利于快速诊断 ； 需较多试验小鼠，成本高； 动物间的个体差会影响试验结果， 我国药典收录的狂犬病中和抗体滴定法即用 此法。 2. 快速荧光灶抑制试验 （RFFIT）： 原理： 将预先滴定致细胞80感染的攻 击毒株CVS与3倍系列稀释的待滴定血清37C 孵育1小时，试验中设包括已知中和抗体国 际单位含量的参照血清，再将血清/病毒混 和液加入BSR细胞悬液。37C 5CO2孵育24 小时后，细胞单层用80冷丙酮固定，加 荧光标记的抗核衣壳抗体进行染色，检测 未被中和的病毒的存在（荧光灶），通过 Reed-Muench法计算待滴定血清中狂犬病毒 中和抗体单位。 快速荧光灶抑制试验 三倍系列稀释待测血清 预先滴定过的中和用狂犬病毒 （设已知国际单位的标准血清对照） CVS病毒悬液（致80细胞感染的病毒量） 等量混合 37保温1小时后 37中和1小时 复滴定FFU 接种BSR细胞 CO2孵箱37培养24小时 固定并用荧光抗体染色，荧光镜观察， 记录每孔荧光灶数量，