梅毒试剂盒相关抗原介绍课件

梅毒ELISA诊断试剂盒及相关抗原 天津晨星生物工程有限公司 2010.8.16 v梅毒介绍 v试剂盒开发常用抗原 TP15 TP47 TP17 TmPA（44.5） v重组表达抗原 梅毒简介 v 梅毒是由梅毒螺旋体（苍白螺旋体）（Treponema pallidum，TP）引起的 一种临床表现复杂多变的全世界流行的性传播疾病。TP细胞末端尖，有外 膜（含丰富脂类和少量蛋白质）、胞浆膜（肽聚糖层）和原浆外周鞭毛（ 又称内鞭毛）。 v 螺旋体是一种细长、柔软、弯曲成螺旋状、运动活泼的原核细菌，在自然 界和动物体内广泛存在，种类很多，多数是非致病的。致病性螺旋体有三 属： 细螺旋体属（Leptospira），又称钩端螺旋体，可致钩端螺旋体病； 疏螺旋体属（Borrelia），如回归热螺旋体（引起回归热）和伯氏螺 旋体（引起莱姆病）； 密螺旋体属（Treponema），包括Tp（引起梅毒）、品他螺旋体（引起 品他）、雅司螺旋体（引起雅司）和地方性梅毒螺旋体（引起地方性 梅毒）。 梅毒简介 v TP经皮肤和淋巴结进入血液后，几乎可侵犯人体各器官，造成多器官损害 ，还可通过胎盘传给下一代，危害极大。人类是其唯一的天然宿主，也是 其传播的媒介。感染TP后，由于TP与宿主之间的相互作用，临床上梅毒表 现为显发症状和潜伏状态交替出现，病程可持续很长，症状的轻重、发病 的时间和早晚亦因人而异，不全相同，甚至可自然痊愈。因此，诊断梅毒 不仅需要丰富的临床经验，还需要直接或间接发现和证明人体内TP的存在 ，即进行微生物学检测和血清学试验。 v TP的基因组是有1139457bp组成的环状DNA，G+C的含量为52.8%，有1041个 开放阅读框（ORFs），每个ORF平均为1032bp，代表92.9%的TP DNA，55%的 ORF有生物学功能。 v 各种蛋白质的平均分子量为3.78kd。 梅毒简介 v 迄今，已有许多实验证实47-、17-和15kd TP脂蛋白（Tpp47、Tpp17和 Tpp15）具有高度免疫原性，并存在于梅毒感染的各个时期。 v 其中Tpp47和Tpp15高度保守，是其他3中致病性密螺旋体如雅司螺旋体、品 他螺旋体和地方性梅毒螺旋体的同族抗原，还可能是诊断先天梅毒最有用 的抗原，尤其是伴有HIV感染的梅毒患者，当血中抗TP抗体低于普通梅毒患 者时，仍能检测到抗Tpp47抗体。在非致病性螺旋体如Tp-Reiter和其它腐 生性螺旋体中未发现Tpp47和Tpp15。 v Tpp17可能是最可靠最特异的抗原标志。 v 因此，Tpp47、Tpp17和Tpp15这3种脂蛋白抗原在建立梅毒血清学诊断方法 中具有重要的意义。 梅毒简介 v Tp-Nichols可通过接种兔睾丸繁殖传代保持毒力，但不能长期在体外培养 ，一般体外培养1周左右即丧失活力，此时为腐生性螺旋体Tp-Reiter。 v 血清学诊断梅毒常用方法荧光螺旋体抗体吸收实验（FAT-ABS），梅毒螺旋 体血凝实验（TPHA）等，此类方法虽然具有较强的特异性和敏感性，但是 由于这些方法使用完整的梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP 感染兔睾丸获得，这种方法花费大、获得TP量少，纯度不够（混有宿主蛋 白），与其他病原微生物存在交叉反映，因此假阳性也时有发生。 梅毒简介 v 克隆技术发展，使得重组抗原越来越多地应用于酶联免疫吸附实验。 v 1996年，Gerber等对梅毒螺旋体抗原进行了较为全面的研究，他们用PCR法 扩增了编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，产生为了 TPN17、TPN29-35、TPN44.5（TmpA）、TPN47、TPN35、TPN39梅毒螺旋体抗 原，并用ELISA对合成的抗原进行检测，结果发现TPN17、TPN47和TPN44.5 的抗体滴度最高，而且这三种抗原联合起来的敏感性要比单一任何一种抗 原的敏感性要高。 v 1998年，Young合成了TPN15、TPN17和TPN47，并将这三种重组抗原联合起 来设计了快速诊断试剂盒Syphilis-Fast，其敏感性和特异性均高于传统的 VDRL和TPHA血清学诊断方法。 梅毒简介 v 设计思想：从TP基因组DNA中克隆编码Tpp47、Tpp17和 Tpp15抗原的tpp47、tpp17和tpp15基因片段，诱导表达 rtpp47、rtpp17、rtpp15、TmPA及相关嵌合抗原，评价 这些重组抗原与梅毒血清和正常人血清的反应原性。 TP15 v 15kd脂蛋白首先由Hensel等1985年分离鉴定，其分子量为15.654kd，PI值 为7.34。它在TP膜蛋白中的含量相对较少，是一种天然梅毒感染和实验梅 毒感染的主要免疫原。 v 在兔免疫模型中，能导致强烈的体液免疫、细胞免疫和抵抗感染后期的梅 毒螺旋体再感染。因此认为TP15在保护性免疫中起着重要作用。Young等报 道在梅毒感染各期，甚至晚期潜伏梅毒均可能检测到强的抗15kd脂蛋白的 抗体反应。 v TP15基因编码142个氨基酸 v 1997年Centurion等对梅毒15kd抗原基因的研究发现，TP15基因的保守型很 强，在梅毒螺旋体各株中，如Nichols株、Bal-3株、Gauthier株、Bosnia 株以及CuniculiA、H、K株编码15kd抗原的DNA序列没有明显变异，并且各 株梅毒螺旋体均表达该抗原，说明15kd抗原基因的变异较少，该蛋白比较 合适作为梅毒的特异性抗原。 TP15 v TP15基因成为研究梅毒早期特异性诊断试剂盒及基因工程疫苗的首选基因 ，目前国际上已经将TP15重组表达蛋白应用于诊断试剂盒的研制上，其最 新报道的表达质粒为Pmal-c2，该质粒在DNA插入位点的上游含有麦芽糖结 合蛋白（MBP）的基因，利用这一表达系统，已经可以使表达的15kd融合蛋 白能够得到高效分离和纯化。 v CDS complement(946853947281) /gene=“tpp15“ /protein_id=“ACD70597.1“ /translation=“MVKRGGAFALCLAVLLGACSFSSIPNGTYRATYQDFDENGWKDF LEVTFDGGKMVQVVYDYQHKEGRFKSQDADYHRVMYASSGIGPEKAFRELAD ALLEKGNPEMVDVVTGATVSSQSFRRLGAALLQSARRGEKEAIISR“ /protein/189017979 TP47 v 47kd脂蛋白是TP螺旋体主要外膜抗原蛋白成分中含量最为丰富的一种，其 分子量为47.645kd，PI为5.41。 v 47kd脂蛋白具有高度免疫原性。家兔在接种47kd脂蛋白710天后即可产生 抗47kd脂蛋白抗体，开始以IgM为主，以后逐渐产生IgG。几乎所有的TP感 染病人均可以产生特异的IgM，数周后为IgG。 v TP47基因编码47kd蛋白，415个氨基酸。Norgard等已将47kd蛋白的DNA片段 转化大肠杆菌，表达出了重组的47kd蛋白。 TP47 v DEFINITION Chain A, Tp47, The 47-Kilodalton Lipoprotein Of Treponema Pallidum. ORIGIN 1 cgssshetsy gyatlsyady wagelgqsrd vllagnaead ragdldagmf davsrathgh 61 gafrqqfqya vevlgekvls kqetedsrgr kkweyetdps vtkmvrasas fqdlgedgei 121 kfeavegava ladrassfmv dseeykitnv kvhgmkfvpv avphelkgia kekfhfveds 181 rvtentnglk tmltedsfsa rkvssmesph dlvvdtvgtg yhsrfgsdae asvmlkradg 241 selshrefid yvmnfntvry dyygddasyt nlmasygtkh sadswwktgr vpriscginy 301 gfdrfkgsgp gyyrltlian gyrdvvadvr flpkyegnid iglkgkvlti ggadaetlmd 361 aavdvfadgq pklvsdqavs lgqnvlsadf tpgteytvev rfkefgsvra kvvaq /protein/24987893 TP17 v 在个抗原中活性是最高的，选择除N端21个氨基酸残基以外的其他全 部序列，即第22到第156位的135个氨基酸。 675364675834 /gene=“tpp17“ 1 mkgsvralca flgvgalgsa lcvscttvcp hagkakaekv ecalkggifr gtlpaadcpg 61 idttvtfnad gtaqkvelal ekksapsplt yrgtwmvred givelslvss eqskapheke 121 lyelidsnsv rymgapgagk pskemapfyv lkktkk /protein/189018242 TmPA complement(303051304088) /gene=“tmpA“ DEFINITION membrane protein Treponema pallidum subsp. pallidum SS14. ORIGIN 1 mnahtlvysg valacaamlg scasgakeea ekkaaeqral lvesahadrr lmearigaqe 61 sgadtqhpel fsqiqdverq stdakiegdl kkaagvasea adkyeilrnr vevadlqski 121 qthqlaqydg dsanaaeesw kkalelyetd saqclqstve alesyrkvah egfgrllpdm 181 karagaaktd vgglkvavel rpqleeadsq yqeareaeev narakafsgy hraleiytel 241 gkvvrlkkte aekalqsakt kqkassdlar sadksaplpe naqgfskepi eveplpndrl 301 nttqadesap ipisdtssps rvqsrgvedg grspkssmne egasr /protein/189018568 重组抗原表达 vELISA试剂盒方法： 间接法：借助酶标二抗 双抗原夹心法：包被抗原和酶标二抗原都是重组单一 抗原或嵌合抗原 v 重组抗原 单一抗原：TP15、TP17、TP47 嵌合表达抗原（）： 计算机软件分析出单一抗原中的优势抗原表位 ，通过基因工程技术，表达和纯化得到多种优势表位 的嵌合抗原，并以此抗原作为包被抗原来验证重组嵌 合抗原是否具有比单一抗原更好的免疫反应性。 单一全长抗原： 表达蛋白为目的蛋白与麦 芽糖结合蛋白（MBP）融 合的重组蛋白。通过淀粉 树脂柱经亲和层析法纯化 ，再通过凝血因子Xa切合 纯化后的融合蛋白中MBP ，从而获得纯化的抗原 TP15-17-47嵌合表达 TP15-17-47重组嵌合抗原表达载体构建 v嵌合表达抗原（）： TP17-47 ：根据计算机软件预测出TP17除N端为疏水信号肽序列 而无抗原表位外，其余部分（22156位，135个氨基酸残基） 存在多个优势抗原表位 TP47中第97120位（VLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSV）是优势抗原 表位。 TP17 TP47 v 重组抗原TP15、TP17、TP44.5（TmPA）、TP47 v 构建质粒PBVIL1/TP47-15-44.5-17 v 在单一抗原中，以重组TP17的活性最高，而多表位嵌合抗原的检出 率最高，检出率略高于TPHA试剂的结果。 v 有研究表明，TP47