医学肿瘤药理学课件

胡人杰 天津市医药科学研究所 肿瘤药物研究开发中心 抗肿瘤药物的药效学评价 实验肿瘤药理学 2 基本知识 实验肿瘤药理学 在新药研究 开发中的作用和内容 实验动物模型与肿瘤学的 基本知识 抗肿瘤药物研究 的历史概要 实验动物模型肿瘤学基本特征 肿瘤细胞的生物学特征 肿瘤细胞的生长特征 恶性肿瘤的研究历史抗肿瘤药物的研发 二二. .样品抗肿瘤活性的确证（一）样品抗肿瘤活性的确证（一） 体内筛选实验体内筛选实验 n n 1. 1.概述概述 n n 2. 2.动物的选择及肿瘤接动物的选择及肿瘤接 种种 （1 1）动物的选择）动物的选择 （2 2）移植瘤的接种）移植瘤的接种 n n 3. 3.移植性动物肿瘤的质移植性动物肿瘤的质 量鉴定量鉴定 n n 4. 4.待筛样品的制备待筛样品的制备 n n 5. 5.剂量的选择、动物分剂量的选择、动物分 组及数量组及数量 （1 1）剂量的选择）剂量的选择 （2 2）动物分组）动物分组 n n 6.6.疗效评价疗效评价 n n 7.7.瘤株的选择瘤株的选择 （1 1）常用瘤株的介绍）常用瘤株的介绍 （2 2）瘤株的选择）瘤株的选择 n n 8 8举例举例 n n 9 9人体肿瘤裸鼠异种移植人体肿瘤裸鼠异种移植 动物模型动物模型 3 3. 3. 样品抗肿瘤活性的确证（二）样品抗肿瘤活性的确证（二） 体外筛选实验体外筛选实验 n n 1. 1.原理与基本操作要点原理与基本操作要点 （1 1）实验原理）实验原理 （2 2）基本操作要点）基本操作要点 n n 2. 2.常用的肿瘤细胞株介常用的肿瘤细胞株介 绍绍 n n 3. 3.抗肿瘤药物体外筛选抗肿瘤药物体外筛选 的实验设计的实验设计 n n 4. 4.常用的评价方法常用的评价方法 （1 1）细胞拒染法）细胞拒染法 （2 2）生长曲线法）生长曲线法 （3 3）克隆计数法）克隆计数法 （4 4）MTTMTT法法 （5 5）SRBSRB法法 n n 5. 5.其它评价方法其它评价方法 4 1 1 知识知识 5 1.1实验药理学在新药研究开发中的 作用与内容 药物筛选的定义： 对可能作为药物的物质进行初步生物活性的检测和试 验，从而筛出高效的新药或先导化合物的过程。 药物筛选的基本形式: 1.随机筛选 2.对特定样品的筛选 3.比较筛选 4.定向合成筛选 1.11.1实验药理学在新药研究开发中的作用与内容实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 7 抗癌（细胞毒类）药物筛选研究的基本过程抗癌（细胞毒类）药物筛选研究的基本过程 待筛化合物 生化筛选测定 体外人类肿瘤细胞株系统筛选 体内模型复筛 毒理学实验 临床实验 1.1 1.1 实验药理学在新药研究开发中的作用与内容实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 n n 20052005年全世界上市的新药（新的活性物质）一共年全世界上市的新药（新的活性物质）一共2828个，其中抗肿瘤药个，其中抗肿瘤药 占占4 4个。个。 n n 20092009年美国年美国FDAFDA批准上市药物批准上市药物2626个，其中抗肿瘤药物个，其中抗肿瘤药物5 5种。种。 n n 抗肿瘤的药品市场是仅次于心血管药物及中枢神经系统用药的第三大抗肿瘤的药品市场是仅次于心血管药物及中枢神经系统用药的第三大 药品市场，预计，至药品市场，预计，至20102010年，全球抗肿瘤药物的市场的市值将达到年，全球抗肿瘤药物的市场的市值将达到600600 亿美元。亿美元。 n n 近年来抗肿瘤药物的研究取得了迅猛发展，出现了许多新型的抗肿瘤近年来抗肿瘤药物的研究取得了迅猛发展，出现了许多新型的抗肿瘤 药物，作用于肿瘤发生和转移的不同环节和新靶点。在我国医院用药药物，作用于肿瘤发生和转移的不同环节和新靶点。在我国医院用药 市场，抗肿瘤药物的销售规模近年一直稳步增长。市场，抗肿瘤药物的销售规模近年一直稳步增长。20062006年抗肿瘤药物年抗肿瘤药物 市场规模增长幅度有所趋缓，仅增长了市场规模增长幅度有所趋缓，仅增长了11.10%11.10%。2007-20092007-2009年销售规年销售规 模继续飞速增长，模继续飞速增长，20092009年突破了年突破了400400亿元，达到了亿元，达到了405405亿亿 元，同比增长了元，同比增长了28.57%28.57%。 8 1.1 1.1 实验药理学在新药研究开发中的作用与内容实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 n n FDA 2000-2010FDA 2000-2010年度批准上市的抗肿瘤新药年度批准上市的抗肿瘤新药 2000年 奥吉妥珠单抗 (gemtuzumab ozogamicin，Mylotarg) 三氧化二砷(Trisenox， arsenic trioxide) 2001年 Campath 来曲唑 (letrozole ，Femara ) 片剂 格列卫（Gleevec，甲磺酸伊马替尼imatinib mesylate） 凯特瑞（Kytril， granisetron Solution，盐酸格拉司琼注射液） 希罗达（Xeloda，卡培他滨，Capecitabine）， 2002年 乐沙定 (Eloxatin ，奥沙利铂oxaliplatin) 氟维司群 (fulvestrant，Faslodex) 泽娃灵 (Zevalin，替伊莫单抗ibritumomab tiuxetan) 9 1.1 1.1 实验药理学在新药研究开发中的作用与内容实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 n n FDA 2000-2010FDA 2000-2010年度批准上市的抗肿瘤新药年度批准上市的抗肿瘤新药 2003年 Emend (aprepitant) 易瑞沙 （Iressa，吉非替尼，gefitinib） 盐酸帕洛诺司琼 (palonosetron， Aloxi ) 万珂（Velcade，硼替佐米，Bortezomib) Bexxar; 2004年 安维汀（Avastin，贝伐珠单抗，bevacizumab) 爱必妥(Erbitux， 西妥昔单抗，cetuximab)。 2005年 氯法拉宾(Clofarabine，曾用名Clofarex) NOV-002(氧化型谷光氨肽，Glutoxim) 索拉菲尼(sorafenib，多吉美，Nexavar) 10 1.1 1.1 实验药理学在新药研究开发中的作用与内容实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 n n FDA 2000-2010FDA 2000-2010年度批准上市的抗肿瘤新药年度批准上市的抗肿瘤新药 2006年 加德西（Gardasil） 伏立诺他（Vorinostat，Zolinza） 达珂（Dacogen，地西他滨注射液decitabine） 苹果酸舒尼替尼（Sunitinib Malate，Sutent） 扑瑞赛（Sprycel，达沙替尼Dasatinib） 2007年 拉帕替尼（二甲苯磺酸拉帕替尼，1apatinib ditosylateTykerb） 坦西莫司（ternsirolimusTorisel） 伊沙匹隆（ixabepiloneIxempra） 尼洛替尼（nilotinibTasigna） 11 1.1 1.1 实验药理学在新药研究开发中的作用与内容实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 n n FDA 2000-2010FDA 2000-2010年度批准上市的抗肿瘤新药年度批准上市的抗肿瘤新药 2008年 醋酸奥曲肽(Octreotide Acetate)；左亚叶酸（Levoleucovorin）； 阿米福汀(Amifostine)； 碘苄胍（Iobenguane）； 地加瑞克（degarelix） 2009年 帕佐帕尼(pazopanib/Votrient) ； 依维莫司（everolimus）； 普拉曲沙（Pralatrexate）； 氟达拉滨（ofatumumab）； romidepsin 2010年 卡巴他赛(Cabazitaxel ，Jevtana注射剂) 地诺塞麦(Denosumab ，Xgeva) 甲磺酸艾日布林(Eribulin mesylate ，Halaven 注射剂) Sipuleucel - T（Provenge） 12 1.21.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识 n n 1.2.11.2.1实验动物模型实验动物模型 药效学实验研究工作中，建立人类疾病的实验动物模型至药效学实验研究工作中，建立人类疾病的实验动物模型至 关重要，成功动物模型的建立是药效学实验研究的根本。关重要，成功动物模型的建立是药效学实验研究的根本。 实验动物模型应该具备的条件：实验动物模型应该具备的条件：动物的致病因素、发病动物的致病因素、发病 机理、病理变化、评价指标、病程发展与转归应该与人类疾机理、病理变化、评价指标、病程发展与转归应该与人类疾 病一致或相近；病一致或相近；实验操作简便，成功率高，重现性好，便实验操作简便，成功率高，重现性好，便 于推广。于推广。所需实验动物能够方便提供，比如能够人工繁育所需实验动物能够方便提供，比如能够人工繁育 ，提供的动物具有相应的国家标准，实验成本适中。，提供的动物具有相应的国家标准，实验成本适中。 肿瘤学实验中小鼠的使用占有绝对的优势，它具有如下的肿瘤学实验中小鼠的使用占有绝对的优势，它具有如下的 优点：优点：敏感敏感 模型比较容易复制；模型比较容易复制；潜伏期短潜伏期短 复制速度快复制速度快 ；其形态特征等与人类肿瘤相似；其形态特征等与人类肿瘤相似；裸小鼠的应用使得实裸小鼠的应用使得实 验结果更加接近临床实际；验结果更加接近临床实际；易于大量繁殖并有可靠的质量易于大量繁殖并有可靠的质量 保证。保证。 13 大鼠大鼠 小鼠小鼠 裸鼠与毛鼠的对比裸鼠与毛鼠的对比 裸鼠裸鼠 T739T739小鼠小鼠 DBA DBA小鼠小鼠 1.21.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识 n n 1.2.21.2.2肿瘤学基本知识肿瘤学基本知识 n n 1.2.2.11.2.2.1癌细胞的生物学特征：癌细胞的生物学特征： 癌细胞对于控制正常细胞增殖和分化的调节因素不癌细胞对于控制正常细胞增殖和分化的调节因素不 能正常地发生反应，通常表现出持续性增殖和分化不良能正常地发生反应，通常表现出持续性增殖和分化不良 的倾向。绝大多数恶性肿瘤（癌）细胞则丧失了接触性的倾向。绝大多数恶性肿瘤（癌）细胞则丧失了接触性 抑制这一生物学特性。抑制这一生物学特性。 癌细胞表现出与邻近细胞及组织间关系的异常，改癌细胞表现出与邻近细胞及组织间关系的异常，改 变了正常的组织结构形式，表现为浸润性生长和播散转变了正常的组织结构形式，表现为浸润性生长和播散转 移。移。 癌细胞能够把上述恶性特征遗传给它的下一代（子癌细胞能够把上述恶性特征遗传给它的下一代（子 细胞）。细胞）。 18 1.2 1.2 实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识 n n 1.2.2.21.2.2.2肿瘤细胞生长的特征肿瘤细胞生长的特征 19 肿瘤细胞的生长速度不是恒定不变的，通常为迅肿瘤细胞的生长速度不是恒定不变的，通常为迅 速生长和相对稳定状态相互交错出现。大多数情况速生长和相对稳定状态相互交错出现。大多数情况 下其恶性程度逐渐增加。下其恶性程度逐渐增加。 恶性肿瘤组织增长的速度取决于三个因素，即细恶性肿瘤组织增长的速度取决于三个因素，即细 胞生长周期、增殖比例和细胞的丢失。胞生长周期、增殖比例和细胞的丢失。 绝大多数肿瘤细胞的细胞周期时间短于肿瘤体积绝大多数肿瘤细胞的细胞周期时间短于肿瘤体积 的倍增时间。一般而言，实体瘤的细胞周期时间比的倍增时间。一般而言，实体瘤的细胞周期时间比 其母体组织为长。其母体组织为长。 1.21.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识 在肿瘤组织中，肿瘤细胞分为增殖细胞和不在肿瘤组织中，肿瘤细胞分为增殖细胞和不 增殖细胞。增殖细胞包括增殖能力有限的肿瘤增殖细胞。增殖细胞包括增殖能力有限的肿瘤 细胞和增殖能力无限的肿瘤干细胞。不增殖细细胞和增殖能力无限的肿瘤干细胞。不增殖细 胞包括胞包括G G 0 0 期细胞和期细胞和G G 1 1 、G G 2 2 期阻断细胞。其中肿期阻断细胞。其中肿 瘤干细胞和瘤干细胞和G G 0 0 期细胞具有重要的生物学意义。期细胞具有重要的生物学意义。 肿瘤的间质成分包括纤维母细胞、血管内皮肿瘤的间质成分包括纤维母细胞、血管内皮 细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等。一般而言，间细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等。一般而言，间 质成分不断改变以适应肿瘤的生长。质成分不断改变以适应肿瘤的生长。 肿瘤细胞能够产生肿瘤血管生成因子（肿瘤细胞能够产生肿瘤血管生成因子（TAFTAF ），），TAFTAF能够诱导新生的毛细血管生成，为快速能够诱导新生的毛细血管生成，为快速 增长的肿瘤组织提供营养，若阻断肿瘤毛细血增长的肿瘤组织提供营养，若阻断肿瘤毛细血 管的生成，则肿瘤组织仅停留于直径管的生成，则肿瘤组织仅停留于直径23mm23mm大大 小而无法增长。小而无法增长。 20 1.2 1.2 实验动物模型与肿瘤学的基本知识实验动物模型与肿瘤学的基本知识 n n 1.2.3 1.2.3 抗肿瘤药物药效学研究的主要内容抗肿瘤药物药效学研究的主要内容 21 (1) (1) 对肿瘤细胞杀伤作用的评价对肿瘤细胞杀伤作用的评价 (2) (2) 对肿瘤预防作用的评价对肿瘤预防作用的评价 (3) (3) 对肿瘤细胞分化诱导作用的评价对肿瘤细胞分化诱导作用的评价 (4) (4) 抑制肿瘤细胞转移、侵袭作用的评价抑制肿瘤细胞转移、侵袭作用的评价 (5) (5) 对抗肿瘤细胞耐药作用的评价对抗肿瘤细胞耐药作用的评价 (6) (6) 对化疗药物增加治疗效果作用的评价（增效对化疗药物增加治疗效果作用的评价（增效 作用）作用） (7) (7) 降低化疗药物毒性作用的评价（减毒作用）降低化疗药物毒性作用的评价（减毒作用） 1.3 1.3 抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要 n n 1.3.11.3.1恶性肿瘤研究的历史恶性肿瘤研究的历史 10001000多年前多年前 肿瘤的临床观察，分类与治疗。肿瘤的临床观察，分类与治疗。 17751775年年 发现阴囊癌与接触煤焦油密切相关。发现阴囊癌与接触煤焦油密切相关。1919世纪后半叶发现膀胱癌世纪后半叶发现膀胱癌 与苯胺染料接触相关，引起人们对化学致癌的关注。与苯胺染料接触相关，引起人们对化学致癌的关注。 18561856年年 制定判断肿瘤细胞的标准。制定判断肿瘤细胞的标准。 18761876年年 建立肿瘤的研究模型。建立肿瘤的研究模型。 19001900年年 成功的培育纯系动物，使得肿瘤学研究得以大踏步的向前迈进成功的培育纯系动物，使得肿瘤学研究得以大踏步的向前迈进 。 19081908年年 发现鸡白血病。发现鸡白血病。 19111911年年 发现发现RousRous肉瘤病毒，确定了病毒致癌的病因，该发现获得肉瘤病毒，确定了病毒致癌的病因，该发现获得19661966 年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。 19181918年年 发现兔耳长期涂抹煤焦油诱发皮肤肿瘤。发现兔耳长期涂抹煤焦油诱发皮肤肿瘤。 19331933年年 成功分离得到煤焦油中的致癌成分苯并芘，后又分离得到促癌成功分离得到煤焦油中的致癌成分苯并芘，后又分离得到促癌 成分佛波酯，化学致癌学说得以确立。成分佛波酯，化学致癌学说得以确立。 22 1.3 1.3 抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要 19691969年年 癌基因假说提出。癌基因假说提出。 19731973年年 基因重组技术成功。基因重组技术成功。 19751975年年 第一个病毒癌基因第一个病毒癌基因SreSre分离成功，并因此获得诺贝尔奖。分离成功，并因此获得诺贝尔奖。 19811981年年 从人的肿瘤中分离得到从人的肿瘤中分离得到RasRas癌基因，迄今为止已发现癌基因癌基因，迄今为止已发现癌基因100 100 多个）多个） 19861986年年 第一个抗癌基因第一个抗癌基因RbRb被克隆。被克隆。 19891989年年 明确明确p53p53基因为抗癌基因。（基因为抗癌基因。（19831983年发现以来一直没有定性；年发现以来一直没有定性； 该基因为目前已知的在恶性肿瘤中突变率最高的抗癌基因）该基因为目前已知的在恶性肿瘤中突变率最高的抗癌基因） 。 19971997年年 NCINCI开始执行开始执行“ “肿瘤基因索引计划（肿瘤基因索引计划（tumor gene index program, tumor gene index program, TGIP TGIP）” ” 2121世纪以来世纪以来 分子生物学技术高速发展加速了人们对肿瘤本质的认识，分子生物学技术高速发展加速了人们对肿瘤本质的认识， 人们正在一步一步的揭开肿瘤神秘的面纱。人们正在一步一步的揭开肿瘤神秘的面纱。 23 1.31.3抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要 n n 1.3.21.3.2抗肿瘤药物的研究抗肿瘤药物的研究 肿瘤的药物治疗是肿瘤三大经典（即手术肿瘤的药物治疗是肿瘤三大经典（即手术 、化疗和放疗）治疗手段之一。经典的化、化疗和放疗）治疗手段之一。经典的化 疗药物（细胞毒类药物及对肿瘤细胞具有疗药物（细胞毒类药物及对肿瘤细胞具有 直接杀伤作用的药物）的研究大致起步于直接杀伤作用的药物）的研究大致起步于2020 世纪三、四十年代。世纪三、四十年代。 24 1.3 1.3 抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要 n n 具有重要意义肿瘤化疗药物的内容具有重要意义肿瘤化疗药物的内容： 19461946年年 研制成功烷化剂类抗肿瘤药物噻替哌、苯研制成功烷化剂类抗肿瘤药物噻替哌、苯 丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥。（耶鲁大学丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥。（耶鲁大学GlmanGlman等人，等人， 后于后于19581958年德国研制成功另一个烷化剂环磷酰胺）年德国研制成功另一个烷化剂环磷酰胺） 1947 1947年年 研制成功抗代谢药物甲氨喋呤、研制成功抗代谢药物甲氨喋呤、6-6-巯基嘌巯基嘌 呤。（呤。（HitchingsHitchings and and Elion Elion，并以此而获得，并以此而获得19981998年诺年诺 贝尔医学奖，后又陆续研制成功贝尔医学奖，后又陆续研制成功5-5-氟尿嘧啶、阿糖胞氟尿嘧啶、阿糖胞 苷等）苷等） 25 1.3 1.3 抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要 1954 1954年年 研制成功第一个抗生素类抗肿瘤药物放线研制成功第一个抗生素类抗肿瘤药物放线 菌素菌素-D-D（FarberFarber，亦称更生霉素，后又分别研制成功，亦称更生霉素，后又分别研制成功 丝裂霉素、博来霉素、阿霉素等）丝裂霉素、博来霉素、阿霉素等） 1955 1955年年 植物中分离得到第一个天然药物有效成分植物中分离得到第一个天然药物有效成分 并使之成为抗肿瘤药物并使之成为抗肿瘤药物长春花碱和长春新碱。（长春花碱和长春新碱。（ 加拿大的加拿大的NobleNoble和美国和美国LillyLilly公司的公司的JohnsonJohnson，后又研制，后又研制 成功三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、喜树碱、紫杉醇、成功三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、喜树碱、紫杉醇、 VP-16VP-16等）等） 1965 1965年年 成功研制抗肿瘤药物顺铂。（成功研制抗肿瘤药物顺铂。（RosenbergRosenberg ，后又研制成功卡铂等），后又研制成功卡铂等） 26 1.3 1.3 抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要 19801980s s 紫杉醇紫杉醇 具有干扰细胞微管装配功能的抗肿瘤具有干扰细胞微管装配功能的抗肿瘤 药物。最初提取自短叶红豆杉（药物。最初提取自短叶红豆杉（T. T. brevifolia brevifolia 1971 1971 WaniWani），后来又研制成功（半人工合成）紫杉特尔等。），后来又研制成功（半人工合成）紫杉特尔等。 19801980s s 喜树碱喜树碱 具有主要以拓扑异构酶具有主要以拓扑异构酶为作用靶为作用靶 点的抗肿瘤药物。点的抗肿瘤药物。 提取自喜树（提取自喜树（Camptetheca Camptetheca acuminato Decne acuminato Decne 1966 Wall M E1966 Wall M E，19851985年前后为王倬年前后为王倬 和刘芳证实其作用靶点），其同类药物包括羟基喜树碱、和刘芳证实其作用靶点），其同类药物包括羟基喜树碱、 拓扑特肯等。拓扑特肯等。 27 1.3 1.3 抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要 19801980s s 干扰素和白细胞介素干扰素和白细胞介素-2 -2 具有抗肿瘤活性的细具有抗肿瘤活性的细 胞因子。干扰素胞因子。干扰素19571957年由年由IssacsIssacs和和LindemannLindemann发现，发现，19791979 年获得人白细胞干扰素年获得人白细胞干扰素 的基因并开始基因工程技术的研的基因并开始基因工程技术的研 究工作，究工作，1970s1970s末至末至1980s1980s初开始在临床使用。白细胞介素初开始在临床使用。白细胞介素 -2-2于于19761976年（年（GalloGallo）首次发现并证实其具有抗肿瘤活性）首次发现并证实其具有抗肿瘤活性 ，19831983年其基因重组技术获得成功，由年其基因重组技术获得成功，由RosenbergRosenberg首次用首次用 于恶性肿瘤治疗，于恶性肿瘤治疗，19921992年通过年通过FDAFDA批准。批准。 28 1.3 1.3 抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要 19901990s s 赫赛汀（赫赛汀（HerceptinHerceptin） 一种针对酪氨酸蛋白激一种针对酪氨酸蛋白激 酶受体酶受体HER2/HER2/neuneu设计人源化单克隆抗体，由美国旧金山基设计人源化单克隆抗体，由美国旧金山基 因技术公司和罗氏药厂联合研制开发，因技术公司和罗氏药厂联合研制开发，19981998年上市的抗肿年上市的抗肿 瘤药物。瘤药物。 20002000s s 格列卫（格列卫（GleevceGleevce） 一种根据结构一种根据结构- -活性关系活性关系 设计的针对酪氨酸蛋白激酶设计的针对酪氨酸蛋白激酶BcrBcr-Ab1-Ab1特异性抑制剂，属于特异性抑制剂，属于 苯胺喹唑啉类化合物，瑞士诺华公司开发研制，苯胺喹唑啉类化合物，瑞士诺华公司开发研制，20022002年上年上 市。市。 29 1.3 1.3 抗肿瘤药物研究的历史概要抗肿瘤药物研究的历史概要 n n 十年来与肿瘤学和肿瘤药物学相关的诺贝尔生理十年来与肿瘤学和肿瘤药物学相关的诺贝尔生理 学与医学奖学与医学奖 2011年 Jules A. Hoffmann法、Bruce A. Beutler美和Ralph M. Steinman 加，免疫系统激活机制，发现树突状细胞。 2009年 Elizabeth H.Blackburn美、Carol W.Greider美、 Jack W.Szostak美，发现端粒及端粒酶功能。 2008年 Harald Zur Hausen德，发现人乳突淋瘤病毒引发子宫颈癌。 2006年 Andrew Z. Fire美和Craig C. Mello美，发现RNA干扰机制。 2003年 Paul Lauterbur美和Peter Mansfield英，核磁共振成像研究。 2002年 Sydney Brenner英、H. Robert Horvitz美和John E. Sulston 英，细胞凋亡及其调控机理研究。 2001年 Leland H. Hartwell美、R. Timothy Hunt英和Paul M. Nurse 英，发现细胞周期中的关键调节因子。 30 2. 2.样品抗肿瘤活性的确证（一）样品抗肿瘤活性的确证（一） 体内筛选实验体内筛选实验 n n 经典的体内、体外抗肿瘤实验是其它肿瘤经典的体内、体外抗肿瘤实验是其它肿瘤 学基础研究以及抗肿瘤药物作用机制研究学基础研究以及抗肿瘤药物作用机制研究 的基础。的基础。 n n 抗肿瘤药物体内筛选评价的基本原理是：抗肿瘤药物体内筛选评价的基本原理是： 首先建立肿瘤的实验动物模型，在成功建首先建立肿瘤的实验动物模型，在成功建 立肿瘤动物模型的基础上，给以动物实验立肿瘤动物模型的基础上，给以动物实验 样品进行抗肿瘤治疗，最后通过观察治疗样品进行抗肿瘤治疗，最后通过观察治疗 效果对药物的有效性、安全性以及作用特效果对药物的有效性、安全性以及作用特 点做出正确的评价。点做出正确的评价。 31 2.1 2.1 概述概述 n实验动物肿瘤模型根据获取肿瘤组织的不同，可以分为自发性肿瘤 、诱发性肿瘤以及移植性肿瘤。 n自发性肿瘤的特点是病程与人类肿瘤发生最为接近，发病年龄很大 ，发生率尽管很高，但是大多不能够达到百分之百。 32 动物品系肿瘤组织类 型发生率月龄 C3H DBA/1 A AKR PBA C57BL 乳腺癌 乳腺癌 肺瘤（癌） 淋巴细胞性白血病 淋巴瘤 网织细 胞肉瘤 99% 75% 90% 91% 100% 74.5% 7.2 12 18 10 8.7 14 小鼠常见高自发性肿瘤举例 2.1 2.1 概述概述 n诱发性肿瘤的因素主要包括化学因素（例如各种化学物质、毒素 等）、物理因素（如放射线）和生物因素（如病毒）。 n诱发肿瘤的方法包括口服法、注射法、涂抹法、植入法、辐照法 等。 33 诱 癌 物方 法动物肿瘤类型 甲基胆蒽 甲基苄基亚硝胺 4-二甲基氨基偶氮苯 黄曲霉毒素B1 二乙基亚硝胺 苯并芘+三氧化铁 二亚硝基哌嗪 植入（棉线穿入） 灌胃 饲喂 饲喂 皮下注射 气管灌注 皮下注射 小鼠 小鼠 大鼠 大鼠 小鼠 仓鼠 大鼠 食管癌 胃癌 肝癌 肝癌 肺癌 肺癌 鼻咽癌 常见的动物诱发肿瘤模型举例 2.1 2.1 概述概述 n n 诱发肿瘤的特点诱发肿瘤的特点是基本符合人类肿瘤发病的过程，造模时是基本符合人类肿瘤发病的过程，造模时 间较长，发病率接近间较长，发病率接近100%100%，但是，肿瘤组织类型较为复，但是，肿瘤组织类型较为复 杂（不单纯，各种组织类型或各部器官的肿瘤同时存在于杂（不单纯，各种组织类型或各部器官的肿瘤同时存在于 一只动物体内或一群动物不同个体内）。一只动物体内或一群动物不同个体内）。 n n 动物移植性肿瘤动物移植性肿瘤来自于自发或诱法的肿瘤，经过体内传代来自于自发或诱法的肿瘤，经过体内传代 培育而成的实验动物肿瘤模型。它的特点是肿瘤接种的成培育而成的实验动物肿瘤模型。它的特点是肿瘤接种的成 功率为功率为100%100%，可在同一时间内获得大量生长均匀的肿瘤，可在同一时间内获得大量生长均匀的肿瘤， 肿瘤组织学类型单纯，接种肿瘤的动物成模时间短，可以肿瘤组织学类型单纯，接种肿瘤的动物成模时间短，可以 在短时间内对药物的生物活性做出评价。一般而言，药物在短时间内对药物的生物活性做出评价。一般而言，药物 抗肿瘤活性的筛选主要选择使用移植性肿瘤模型。抗肿瘤活性的筛选主要选择使用移植性肿瘤模型。 34 2.2 2.2 动物的选择及肿瘤接种动物的选择及肿瘤接种 动物的选择中主要包括动物的种类、品系、体重动物的选择中主要包括动物的种类、品系、体重 、 性别等。性别等。 （1 1）种类）种类 使用较多的是小鼠和大鼠，而小鼠的使使用较多的是小鼠和大鼠，而小鼠的使 用占有绝对的优势。用占有绝对的优势。 （2 2）品系）品系 根据肿瘤（瘤株）的不同选择不同品系根据肿瘤（瘤株）的不同选择不同品系 的动物。的动物。 35 n n 2.2.12.2.1动物的选择动物的选择 36 不同瘤株对实验动物品系的要求 肿瘤名称与类型代号所需动物（宿主） 艾氏腹水癌 肝癌腹水型 肉瘤180 肉瘤180腹水型 宫颈癌 肺癌 肺癌 乳腺癌 黑色素瘤 白血病 白血病 白血病 癌肉瘤 EAC Hep A S180 S180 A U14 Lewis LA795 MA737 B16 L615 P388 L1210 W256 昆明种小白鼠或其它种系小白鼠 同上 同上 同上 同上 C57BL/6小鼠 AT739小鼠 津白小鼠 C57BL/6小鼠 615小白鼠 DBA/2小白鼠 同上 Wister大白鼠或其它种系大白鼠 C57小鼠 接种Lewis肺癌 AT739小鼠 接种LA795肺 癌 昆明种小白鼠 接种艾氏腹水癌 2.2 2.2 动物的选择及肿瘤接种动物的选择及肿瘤接种 （3 3）体重）体重 小鼠的体重小鼠的体重1818至至2222克，具体实验时，体重最好控制克，具体实验时，体重最好控制 在在1 1克以内（实际工作中一般为克以内（实际工作中一般为11克）。克）。 大鼠的体重应该在大鼠的体重应该在5050至至100100克。具体实验时，体重克。具体实验时，体重 最好控制在最好控制在5 5克之内（实际工作中一般为克之内（实际工作中一般为55克）。克）。 （4 4）性别）性别 动物的性别一般没有特别的要求，某些特殊的肿瘤动物的性别一般没有特别的要求，某些特殊的肿瘤 ，例如乳腺癌、卵巢癌等则考虑使用雌性动物。，例如乳腺癌、卵巢癌等则考虑使用雌性动物。 39 2.2 2.2 动物的选择及肿瘤接种动物的选择及肿瘤接种 n n 2.2.22.2.2移植瘤的接种（肿瘤的移植）移植瘤的接种（肿瘤的移植） （ 1 1）接种的一般要求。在无菌条件下完成接种的实验操作）接种的一般要求。在无菌条件下完成接种的实验操作 。肿瘤组织的污染往往是肿瘤接种失败的主要原因，所以。肿瘤组织的污染往往是肿瘤接种失败的主要原因，所以 应该特别引起注意。应该特别引起注意。 （2 2）实体瘤瘤块的制备（瘤块接种法）。）实体瘤瘤块的制备（瘤块接种法）。7 7至至1010天的荷瘤动天的荷瘤动 物，肿瘤生长及动物生长状况良好。切取肿瘤组织，剪成物，肿瘤生长及动物生长状况良好。切取肿瘤组织，剪成 2 2至至3 3 立方毫米的小块，塞入套管针中，接种于动物的右侧立方毫米的小块，塞入套管针中，接种于动物的右侧 腋窝皮下，从肿瘤组织取出至接种完毕应该在腋窝皮下，从肿瘤组织取出至接种完毕应该在3030分钟内完分钟内完 成。成。 （3 3）瘤细胞悬液的制备（细胞悬液接种法）瘤细胞悬液的制备（细胞悬液接种法） 取出的肿瘤组取出的肿瘤组 织剪成小块，放入玻璃的组织匀浆器中，按照肿瘤组织（织剪成小块，放入玻璃的组织匀浆器中，按照肿瘤组织（ g g） 生理盐水（生理盐水（mLmL）=1=1 3 13 1 4 4。制备细胞悬液，按。制备细胞悬液，按 照照0.2mL/0.2mL/只进行接种。全部操作的时间控制在只进行接种。全部操作的时间控制在3030分钟之内分钟之内 。 40 2.2 2.2 动物的选择及肿瘤接种动物的选择及肿瘤接种 （4 4）腹水型肿瘤细胞悬液的制备（腹水型瘤源接种法）腹水型肿瘤细胞悬液的制备（腹水型瘤源接种法） 主主 要操作包括要操作包括抽取腹水。抽取腹水。细胞计数，载玻片推片，瑞氏细胞计数，载玻片推片，瑞氏 或基姆萨染色，分类计数，要求肿瘤细胞数的比例不小于或基姆萨染色，分类计数，要求肿瘤细胞数的比例不小于 95%95%。将腹水用生理盐水稀释。将腹水用生理盐水稀释10 10010 100倍，以拒染法计数活倍，以拒染法计数活 细胞的比例，要求活细胞数不少于细胞的比例，要求活细胞数不少于95%95%。接种，将稀释接种，将稀释 好的腹水细胞悬液接种于动物的腹腔（好的腹水细胞悬液接种于动物的腹腔（0.1 0.2mL/0.1 0.2mL/只）只） 或接种于皮下（或接种于皮下（0.2mL/0.2mL/只），全部操作（取出腹水至肿瘤只），全部操作（取出腹水至肿瘤 接种完毕）要求在接种完毕）要求在6060分钟内完成。分钟内完成。 （5 5）白血病株的接种）白血病株的接种 腹水型的白血病例如腹水型的白血病例如L1210L1210和和P388P388的接的接 种方法与腹水型肿瘤的接种方法相同。种方法与腹水型肿瘤的接种方法相同。L615L615小鼠白血病的小鼠白血病的 接种方法是：接种方法是：摘取脾脏，制备组织匀浆；摘取脾脏，制备组织匀浆；细胞计数，细胞计数， 将细胞浓度调整为将细胞浓度调整为410410 7 7 个个/ /mLmL；接种，每只动物皮下接种，每只动物皮下 接种细胞悬液接种细胞悬液0.1 0.2mL0.1 0.2mL。 41 2.3 2.3 移植性动物肿瘤的质量鉴定移植性动物肿瘤的质量鉴定 n n （1 1）每年进行一次实验动物瘤株的组织学）每年进行一次实验动物瘤株的组织学 检查。检查。 n n （2 2）定期进行细菌培养检测，以鉴别污染）定期进行细菌培养检测，以鉴别污染 情况。情况。 n n （3 3）肿瘤生长潜力的检查。）肿瘤生长潜力的检查。 42 下述情况判断为肿瘤生长不良：下述情况判断为肿瘤生长不良： n n 实体瘤实体瘤 小鼠小鼠20%20%的肿瘤重量小于的肿瘤重量小于0.40.4克，或平均瘤重小于克，或平均瘤重小于1 1克；克； 大鼠肿瘤平均重量小于大鼠肿瘤平均重量小于2 2克。克。 n n 腹水型肿瘤腹水型肿瘤 荷瘤动物生存期超出范围（不同肿瘤生存期不同）仍然存活荷瘤动物生存期超出范围（不同肿瘤生存期不同）仍然存活 ； 经过一定的稀释接种之后无肿瘤生长。经过一定的稀释接种之后无肿瘤生长。 n n （4 4）瘤株相容性的鉴别）瘤株相容性的鉴别 n n （5 5）死亡分析）死亡分析 n n （6 6）阳性对照药品对肿瘤生长的作用）阳性对照药品对肿瘤生长的作用 考察动物移植肿瘤对临床常用化疗药物的敏感性，观察肿瘤考察动物移植肿瘤对临床常用化疗药物的敏感性，观察肿瘤 细胞是否出现耐药。细胞是否出现耐药。 43 附表：临床常用化疗药物对动物移植肿瘤的敏感性附表：临床常用化疗药物对动物移植肿瘤的敏感性 44 药药物名称 P388L121 0 S180 A EACL615ESCS180HepB16U14W256 米妥蒽醌醌 5-氟尿嘧啶嘧啶 阿糖胞苷 环环磷酰酰胺 秋水仙碱 长长春新碱 喜树树碱钠钠 丝丝裂霉素 阿霉素 紫杉醇 顺铂顺铂 2.4 2.4 待筛样品的制备待筛样品的制备 n n 样品制备过程中应该注意的问题样品制备过程中应该注意的问题： 对于化学性能不稳定的样品一定要新鲜配置，对于化学对于化学性能不稳定的样品一定要新鲜配置，对于化学 性能是否稳定不清的样品应该按照不稳定来处理。性能是否稳定不清的样品应该按照不稳定来处理。 对于水溶性较差的样品应该采用某些助溶剂尽可能使其对于水溶性较差的样品应该采用某些助溶剂尽可能使其 溶解成为真溶液，特别是给药途径为注射给药时。灌胃溶解成为真溶液，特别是给药途径为注射给药时。灌胃 给药者可以配制成混悬液。选择溶解方法时应该考虑对给药者可以配制成混悬液。选择溶解方法时应该考虑对 机体不应产生不良反应。机体不应产生不良反应。 在实验室中配置好的样品一般均为在实验室中配置好的样品一般均为4 4（冰箱）保存。（冰箱）保存。 生物制剂样品一般均需要低温保存，同时还要避免反复生物制剂样品一般均需要低温保存，同时还要避免反复 冻融，因此，样品配制过程中应该考虑进行适当的分装冻融，因此，样品配制过程中应该考虑进行适当的分装 。 需要避光保存的样品因该使用棕色器皿。需要避光保存的样品因该使用棕色器皿。 45 2.5 2.5 剂量的选择、动物分组及数量剂量的选择、动物分组及数量 n n 2.5.12.5.1剂量的选择剂量的选择 为了对样品的生物活性做出十分客观的评价，就必须保证在筛选实验中为了对样品的生物活性做出十分客观的评价，就必须保证在筛选实验中 剂量要给足，对于细胞毒类药物一般是最大耐受剂量（动物可以耐受剂量要给足，对于细胞毒类药物一般是最大耐受剂量（动物可以耐受 的，不至产生明显毒性反应的剂量）。给药剂量的设计一般有以下几的，不至产生明显毒性反应的剂量）。给药剂量的设计一般有以下几 种方法：种方法： （1 1）依据样品的毒性资料设计给药剂量）依据样品的毒性资料设计给药剂量 如果已知样品的如果已知样品的LDLD5050可以考虑使用可以考虑使用1/3 1/51/3 1/5的的LDLD5050作为给药剂量作为给药剂量 （1 1次次/ /日），或者以日），或者以LDLD 5 5 或或LDLD1010作为给药剂量。作为给药剂量。 如果不知道样品的如果不知道样品的LDLD5050，动物实验摸索，找到可至动物全部死亡，动物实验摸索，找到可至动物全部死亡 的最小剂量和可使动物全部存活的最大剂量。以可至部分动物死亡的剂的最小剂量和可使动物全部存活的最大剂量。以可至部分动物死亡的剂 量的量的1/5 1/31/5 1/3或或1/10 1/51/10 1/5作为治疗剂量。应该注意的是，细胞毒类药物作为治疗剂量。应该注意的是，细胞毒类药物 的致死作用往往表现的很迟缓，因此，给药后观察的时间要够长，至少的致死作用往往表现的很迟缓，因此，给药后观察的时间要够长，至少 要观察要观察1 1周。周。 样品本身毒性很小，无法测定其致死剂量时。采取最大浓度药液样品本身毒性很小，无法测定其致死剂量时。采取最大浓度药液 的最大允许给药容积给药。的最大允许给药容积给药。 46 大、小鼠各种途径最大允许给药容积 n供参考，实际实验中可有差异。若注射剂为油 剂时，容积均为0.2mL。 47 动动 物各种途径最大允许给药许给药 容积积（单单位：mL） igipsc 小鼠（20g） 大鼠（100g） 0.8 3.0 1.0 3.0 1.0 3.0 2.5 2.5 剂量的选择、动物分组及数量剂量的选择、动物分组及数量 n n （2 2）结合筛选（预）实验设计给药剂量）结合筛选（预）实验设计给药剂量 合成药物或天然药物提取成分可以考虑先试用合成药物或天然药物提取成分可以考虑先试用 500mg/kg500mg/kg的剂量，疗程结束时，若动物死亡率超的剂量，疗程结束时，若动物死亡率超 过过34%34%，并且没有见到明确的抗肿瘤活性，则认，并且没有见到明确的抗肿瘤活性，则认 为该药没有继续实验的价值，停止实验。若见到为该药没有继续实验的价值，停止实验。若见到 抗肿瘤效果但动物死亡超过抗肿瘤效果但动物死亡超过34%34%，则可按照下表，则可按照下表 减低剂量，进一步实验。减低剂量，进一步实验。 48 确定动物治疗剂量简表 49 动物死亡率（%）下一步实验剂 量 0 34 35 75 76 100 100（24小时之内） 不变 乘以0.5 乘以0.25 乘以0.2 常用化疗药物的常用化疗药物的LDLD5050、LDLD1010及实验参考给药剂量及实验参考给药剂量 50 药药物名称物名称LDLD50 50（ （mg/kgmg/kg）LDLD10 10（ （mg/kgmg/kg）单单次 次剂剂量（量（mg/kgdmg/kgd） ） 米妥蒽米妥蒽醌醌 5-5-氟尿氟尿嘧啶嘧啶 环环磷磷酰酰胺胺 秋水仙碱秋水仙碱 长长春新碱春新碱 喜喜树树碱碱钠钠 丝丝裂霉素裂霉素C C 阿霉素阿霉素 紫杉醇紫杉醇 顺铂顺铂 卡卡铂铂 1515（iviv） 185185 472472 2.32.3 6.56.5 6.86.8 8.48.4（iv5iv5） 14.214.2 131.5131.5 92.692.6 2.022.02 1.91.9 5959 104.05104.05 1 1、1.51.5、2 2、3 3 1515、2020、2525 8 8、2020、3030、5050、100100、150150 0.30.3、0.40.4、1 1、2 2 0.10.1、0.20.2、1 1、2.22.2 0.60.6、1 1、4 4、8 8 1 1、1.51.5、2 2 1.251.25、1.51.5、2 2、2.52.5 2.62.6、4.34.3、7.27.2、1212 0.50.5、1 1、2 2 1010、2020、3030 2.5 2.5 剂量的选择、动物分组及数量剂量的选择、动物分组及数量 n n （3 3）给药次数的确定）给药次数的确定 一般给药次数多为每日一次，连续一般给药次数多为每日一次，连续7 107 10天天 ，但是根据具体情况也可以调整为间隔给，但是根据具体情况也可以调整为间隔给 药或每日多次给药。药或每日多次给药。 51 2.5 2.5 剂量的选择、动物分组及数量剂量的选择、动物分组及数量 n n 2.5.22.5.2动物分组动物分组 n n 一般筛选实验主要设立对照组（给予生理盐水），不同一般筛选实验主要设立对照组（给予生理盐水），不同 剂量的各剂量的各 给药组，阳性药品对照组。必要的时候还要设给药组，阳性药品对照组。必要的时候还要设 置赋形剂（溶媒）对照组。除对照组之外，一般每组动置赋形剂（溶媒）对照组。除对照组之外，一般每组动 物数为物数为8 108 10只，如果选择近交系小鼠作为实验对象，只，如果选择近交系小鼠作为实验对象， 由于近交系动物的遗传特点，可以适当减少动物每组数由于近交系动物的遗传特点，可以适当减少动物每组数 量，例如每组量，例如每组6 86 8只。对照组的动物数量应该多于实验只。对照组的动物数量应该多于实验 组，对照组的动物数可以根据下述公式进行计算：组，对照组的动物数可以根据下述公式进行计算： n n 对照组动物数对照组动物数 = = 试验组动物数试验组动物数(组数组数) )1/2 1/2 n n 动物分组应该按照随机的原则，另外需要注意的是，如动