理学微生物学课件营养生理与代谢

第 六 章 微生物营养和代谢多样性 Microbial Nutrition and Metabolism Diversity 第一节 微生物的营养、营养类型和培养基 0微生物营养的功能 l参与微生物细胞的组成 l提供微生物机体进行各种生理活动所需的能量 l形成微生物代谢产物的来源 细胞从外界环境中摄取化学物质，使其 在生长过程中获取生命活动所需的能量及其结 构物质的生理过程称为营养或营养作用 。外 界环境中可为细胞提供结构组分、能量、代谢 调节物质和良好生理环境的化学物质称为营养 物质或养料 。 1微生物细胞的化学组成 l元素 大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫 其他元素：钾、钠、钙、镁、铁、锰、铜、 钴、锌、钼等 l存在方式 有机物：蛋白质、糖、脂、核酸、维生素， 降解产物、代谢中间产物 无机盐灰分 水细胞干重的70%90% 微生物细胞中几种主要元素的 相对含量（%干重） 2微生物细胞的营养物质 1.碳源（Carbon source） 2.氮源（Nitrogen source) 3.能源（Energy source) 4.生长因子（Growth factor ) 5.无机盐(Inorganic salt) 6.水(Water) 3微 生 物 的 碳 源 凡能共给微生物碳素营养的物质称为碳源。 碳素的主要作用是组成菌体细胞物质和供 给微生物生长发育所需的能量。 碳源分无机（CO2及碳酸盐）和有机碳源 （糖类、有机酸类、油脂及烃类） 。 异养微生物：利用有机碳源的微生物。 自养微生物：利用无机碳源的微生物。 实验室培养微生物常用的碳源主要有：葡 萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘油和一些有机 酸等。 *微 生 物 的 能 源 l 化能异养微生物：有机物（同碳源） 化学物质 l化能自养微生物：还原态无机物能源谱 （不同碳源） NH4+,NO2-, S, H2S, H2,Fe2+ 等 l能源：光能自养和光能异养微生物 4微 生 物 的 氮 源 能被微生物利用的含氮物质为氮源。氮素是 构成微生物细胞基本物质蛋白质和核酸的主要 成分，一般不提供能源（硝化细菌能利用氨作为 氮源和能源）。 氮源分无机（分子态氮、硝酸盐、铵盐等）和 有机（尿素、氨基酸、蛋白质、蛋白胨、肉膏等 ）两大类。 实验室培养微生物常用的氮源主要有：铵盐、 硝酸盐、尿素、蛋白胨和牛肉膏等。发酵工业上 常以豆饼粉、花生饼粉和玉米浆等作为微生物的 氮源。 氨基酸自养型生物：能把尿素、铵盐、硝酸 盐甚至氮气自行合成所需的一切氨基酸的生物。 如绿色植物和不少的微生物。 氨基酸自养型生物：需从外界吸收现成的氨 基酸作为N源的生物。 如所有的动物和大量的微生物。 l意义：利用氨基酸自养型微生物把人类或动物无 法利用的廉价的尿素、铵盐、硝酸盐甚至氮气转 化为菌体蛋白或含N代谢产物，丰富人类食物资 源。 l食物中的蛋白质必须经过肠胃道消化，分解成氨基酸才能被人 体吸收利用，人体对蛋白质的需要实际就是对氨基酸的需要。 吸收后的氨基酸只有在数量和种类上都能满足人体需要身体才 能利用它们合成自身的蛋白质。营养学上将氨基酸分为必需氨 基酸和非必需氨基酸两类。 l必需氨基酸指的是人体自身不能合成或合成速度不能满足人体 需要，必须从食物中摄取的氨基酸。对成人来说，这类氨基酸 有8种，包括赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、 缬氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。对婴儿来说，组氨酸也是必需氨 基酸。 l非必需氨基酸并不是说人体不需要这些氨基酸，而是说人体可 以自身合成或由其它氨基酸转化而得到，不一定非从食物直接 摄取不可。这类氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等。有些非 必需氨基酸如胱氨酸和酪氨酸如果供给充裕还可以节省必需氨 基酸中蛋氨酸和苯丙氨酸的需要量。 5微生物的生长因子 l狭义：维生素 l广义：维生素、氨基酸、碱基、脂肪酸等 l 1).生长因子自养型微生物（auxoautotrophs) 自养微生物和一些腐生性细菌、霉菌，能自己合成这自养微生物和一些腐生性细菌、霉菌，能自己合成这 类物质，不需外界供给；类物质，不需外界供给； l 2).生长因子异养型微生（auxoheterotrophs) 而有些微生物而有些微生物( (根瘤菌、乳酸杆菌等根瘤菌、乳酸杆菌等) )因缺乏合成这类因缺乏合成这类 物质的能力，必须外界供给才能生长。物质的能力，必须外界供给才能生长。 l 3).生长因子过量合成型微生物 少数微生物在其代谢活动过程中，能合成并大量分 泌某些维生素等生长因子。 4).营养缺陷型微生物（nutritional deficiency) l l 营养缺陷型（auxotroph突变型）与原养 型（protoroph） 营养缺陷型：某些菌株发生突变（自然突 变或人工诱变）后，失去合成某种或某 些对该菌生长必不可少的物质（通常是 生长因子，如氨基酸、维生素）的能力 ，必须从外界环境获得该物质才能生长 繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型 。其相对应的 野生型菌株称为原养型。 某些微生物生长所需的生长因子 6微 生 物 的 无 机 盐 矿质元素也是微生物生命活动所不可缺 少的营养物质，可分为两大类，即大量元 素(P、K、Mg、Ca、S、Na等)和微量元素 (Fe、B、Cu、Zn、Mo、Co)。 其主要功能是：其主要功能是： 构成微生物细胞的组成成分；构成微生物细胞的组成成分； 作为酶的组成部分或维持酶的活性；作为酶的组成部分或维持酶的活性； 调节细胞的渗透压、氢离子浓度、调节细胞的渗透压、氢离子浓度、EhEh等；等； 作为自养微生物的能源。作为自养微生物的能源。 生理功能 7水 (1)(1)作用：作用： 是细胞的主要组成成分；是细胞的主要组成成分； 直接参加各种代谢反应直接参加各种代谢反应; ; 是细胞吸收营养物质和排泄废物的介质；是细胞吸收营养物质和排泄废物的介质； 可调节菌体内的温度可调节菌体内的温度( (水比热大有利吸热水比热大有利吸热, , 散热散热) ) ； 水维持细胞膨压水维持细胞膨压(控制细胞形态) ； 可供给菌体营养。可供给菌体营养。 微生物细胞含水约占细胞鲜重的7090，水 作用是多方面的。 水的特性： 、水是极性分子 -最好的溶剂、有利于物质 的运输。 、水的比热为1 -有利于保持正常的体温和代 谢速率。 、固态水(冰)比液态水的密度低-有利于水生 生物的低温生存。 、ph=7- 水的可利用性 l 用水活度表示 l水活度w(water activity)=P/Po P: 溶液的蒸汽压 Po:纯水的蒸汽压 l在常温常压下，纯水的aw为1.00 几种溶液的水活度值 一些微生物生长所需的最低aw值 0.97-0.960.97-0.96革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌 假单胞菌属（假单胞菌属（PseudomonasPseudomonas） 不动杆菌属（不动杆菌属（AcinetoacterAcinetoacter） 大肠埃希氏菌（大肠埃希氏菌（E.coliE.coli） 0.97 0.97 0.90-0.860.90-0.86革兰氏阴性球菌革兰氏阴性球菌 微球菌属（微球菌属（MicrococcusMicrococcus） 0.90 0.90 金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus）0.860.86 0.94-0.870.94-0.87酵母菌产朊假丝酵母（酵母菌产朊假丝酵母（Candida Candida utilisutilis） 酿酒酵母（酿酒酵母（Candida Candida utilisutilis）0.940.94 德巴利酵母属（德巴利酵母属（DebaryomycesDebaryomyces）0.940.94 0.93-0.80霉菌 黑根霉（Rhizopus nigricans）0.93 扩展青霉（Penicillium expansum）0.77 展青霉（Penicillium patullum）0.80 黄曲霉（Aspergillus flavus） 0.90 黑曲霉（Aspergillus niger）0.84 0.95-0.910.95-0.91大多数细菌大多数细菌 枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacillus Bacillus subtilissubtilis） 梭菌属（梭菌属（ClostridiumClostridium） 微细菌属（微细菌属（MicrobacteriumMicrobacterium）0.950.95 乳杆菌属（乳杆菌属（LactobacillusLactobacillus） 链球菌属（链球菌属（StreptococcusStreptococcus）0.940.94 几种微生物生长的最适aw值 大家知道把新鲜蔬菜晒干就不容易腐 烂。这是因为蔬菜的水分减少了，引起蔬 菜腐烂的微生物就不容易生长。微生物的 生长必需水，但结合在分子内的水不能被 微生物利用，只有游离的水才能被利用。 采用“水活度”（ aw ）值这一概念来表示能 被微生物利用的实际含水量。微生物所需 要的水活度越高，在干燥的环境下就越不 容易生长。 二、微生物吸收营养物质的方式 l简单扩散（Simple diffusion) l促进扩散（Facilitated diffusion） l主动吸收（Active transport） l基团转位（Group translocation) 1.简 单 扩 散 l物质扩散的动力: 膜内外的浓度差 l特点： 不消耗能量 不发生化学变化 非特异性。仅依膜上小孔的大小 和形状对被 扩散的物质分子的大小和形状具有选择性 l被运输的物质是小分子量和脂溶性物，水， 气体、甘油和某些离子 自由扩散 1. 单纯扩散 2.促 进 扩 散 l 借助膜上的载体蛋白，具有高度的立体专一性。 载体蛋白能促进物质运输，但不能进行逆浓度梯度运 输。 膜载体在膜外与营养物质亲合力强，与这种物质结合膜载体在膜外与营养物质亲合力强，与这种物质结合 ，进入细胞后亲合力降低释放营养物质。像渡船一样，进入细胞后亲合力降低释放营养物质。像渡船一样 ，膜外装货，膜内卸货，这种扩散方式比单纯扩散速，膜外装货，膜内卸货，这种扩散方式比单纯扩散速 度快。度快。 膜内外亲合力的改变与载体分子构型改变有关。膜内外亲合力的改变与载体分子构型改变有关。 l常见于真核微生物，如厌氧生活的酵母菌中。 l特点： 需要特异性的载体蛋白 不消耗能量 可加快运输速度，但不能逆浓度运输 主 动 吸 收 有特异性的载体蛋白参与 需要消耗能量 可以逆浓度梯度运输 微生物的主要物质运输方式 主动运输特点： 被运送的物质可被运送的物质可 逆浓度梯度进入细逆浓度梯度进入细 胞内。胞内。 要消耗能量，必要消耗能量，必 需有能量参加。需有能量参加。 有膜载体参加有膜载体参加 ，膜载体发生构，膜载体发生构 型变化型变化 被运送物质不被运送物质不 发生任何变化。发生任何变化。 微生物主动运输示意图 基 团 转 位 l一种主动运输类型 l需复杂的运输酶系参与 l底物在运输过程发生化学变化 l主要存在于厌氧和兼性厌氧细菌中 l主要用于糖及脂肪酸、核苷、碱基等物质的 运输，如葡萄糖（见图） 4.基团移位(group translocation) 基团转位：是在研究糖的运输时发现的一基团转位：是在研究糖的运输时发现的一 种种主动运输主动运输方式。方式。 运输过程中运输过程中需要能量需要能量，被运输的物质发生，被运输的物质发生 化学变化的运输叫基团移位。化学变化的运输叫基团移位。 许多糖就是靠基团移位进行运输的。许多糖就是靠基团移位进行运输的。 这种运输方式是微生物通过这种运输方式是微生物通过磷酸转移酶系磷酸转移酶系 统统来运输营养物质的。来运输营养物质的。 膜外 内 Ec 糖 糖-P F F-P P-HPr HPrPEP 丙酮酸 E 基团移位 磷酸转移E系统（PTS） 酶（非特异性） 酶: 酶c,酶a,酶b 热稳定蛋白HPr（特异性） 葡萄糖通过基团转位 运输过程的化学反应 l1）PEP+HPr 酶I 磷酸HPr + 丙 酮酸 l磷酸HPr + 葡萄糖 酶II 6-磷酸葡萄糖 +HPr 基团转位运输葡萄糖示意图 三、微生物的营养类型 根据微生物所需要的能源和碳源的不同，可将微生 物的营养类型分为四大类： 营营 养 类类 型 光能无 机营营养 型 光能有 机营营养 型 化能无 机营营养 型 化能有 机营营养 型 能 源 主要碳源 氢氢或电电子 供体 光能 CO2 水或还还 原态态无 机物 光能 CO2 有机物 化学能 CO2 还还原 态态无机 物 化学能 有机物 有机物 1.1.光能无机营养型光能无机营养型( (或称光能自养型或称光能自养型) ) 这类微生物是利用光作为生活所需要的能源，以 CO2作为唯一或主要碳源，以无机物作为供氢体来还 原CO2合成细胞 的有机物质。如藻类和少数细菌(红 硫细菌、绿硫细菌)，它们都含光和色素(叶绿素或细 菌叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素)，可以在完全无机 的环境中生长，所以称光能无机营养型。 但应注意，三大色素中，叶绿素或细菌叶绿素是但应注意，三大色素中，叶绿素或细菌叶绿素是 主要的光合色素，而类胡萝卜素和藻胆素因不主要的光合色素，而类胡萝卜素和藻胆素因不 能单独进行光合作用而称为辅助色素，其主要能单独进行光合作用而称为辅助色素，其主要 功能是捕获光能转移到光反应中心，并保护膜功能是捕获光能转移到光反应中心，并保护膜 系统免遭光氧化的破坏。系统免遭光氧化的破坏。 COCO 2 2 + H + H 2 2O O CH CH 2 2 O + OO + O 2 2 光光 能能 叶绿素叶绿素 COCO 2 2 + 2H + 2H 2 2S S CHCH 2 2 O + 2S + HO + 2S + H 2 2O O 光能光能 细胞叶绿素细胞叶绿素 COCO2 2 + 2H+ 2H 2 2A A CHCH 2 2 O + HO + H 2 2 O + 2AO + 2A 光能光能 光合色素光合色素 光能自养型念珠蓝细菌 2.2.光能有机营养型光能有机营养型( (光能异养型光能异养型) ) 这类微生物利用光作为能源，利用简这类微生物利用光作为能源，利用简 单有机物作为供氢体以还原单有机物作为供氢体以还原COCO 2 2 合成细合成细 胞有机物质。如红螺细菌：胞有机物质。如红螺细菌： CHCH 3 3 CHCH 3 3 CHOHCHOH+ +CO2CO22CH2CH 3 3 COCHCOCH 3 3 + +CHCH 2 2 OO+ +H H 2 2O O 光光 能能 光合色素光合色素 ( (异丙醇异丙醇) ) ( (丙酮丙酮) ) 3.3.化能无机营养型化能无机营养型( (化能自养型化能自养型) ) 能从无机物氧化过程中获得能量，并以能从无机物氧化过程中获得能量，并以COCO 2 2 作为唯一或主要碳源进行生长的微生物。作为唯一或主要碳源进行生长的微生物。 如铁细菌、亚消化细菌、消化细菌、硫细如铁细菌、亚消化细菌、消化细菌、硫细 菌和菌和H细菌。 FeFe+2 +2 - Fe - Fe+3 +3 + e + + e + Q 2NH2NH3 3 + 3O+ 3O2 2 - 2HNO - 2HNO2 2 + 2H+ 2H 2 2 O + O + Q 2HNO2HNO 2 2 + O + O 2 2 - 2HNO3 + - 2HNO3 + Q 2S + 3O2S + 3O 2 2 + H + H 2 2 O - 2HO - 2H 2 2 SOSO 4 4 + + Q COCO 2 2 + 4H -CH + 4H -CH 2 2 O + HO + H 2 2O O 4.4.化能有机营养型化能有机营养型( (化能异养型化能异养型) ) 这类微生物以有机化合物为碳源，利用有机化合 物氧化过程中产生的能量为能源，以有机或无机含氮 化合物为氮源，合成细胞物质。这类微生物称为化能 异养微生物。其包含的种类最多。就已知的微生物中其包含的种类最多。就已知的微生物中 绝大多数细菌、全部真菌、原生动物及病毒都属于这绝大多数细菌、全部真菌、原生动物及病毒都属于这 一营养类型。一营养类型。 由于栖息场所和摄取养料不同，可将异养微生物 分为腐生型和寄生型两大类： 腐生型：利用无生命的有机物获得营养物质。 寄生型：从活的寄生体内获取营养物质，如d 病毒衣原体、立克次氏体等。 中间类型（兼性腐生或兼性寄生）如结核杆 菌、痢疾杆菌就是兼性寄生菌。 四、培 养 基 l培养基： l 是人工配制的适合于不同微生物生长 繁殖或积累代谢产物的营养基质 培养基 约有数千种，依据： l微生物种类不同，所需营养不同 l使用目的不同 l营养物质的来源不同 l培养基的物理状态不同 培养基的培制原则 l（一）、配制培养基的原则 1.选择适宜的营养物质 2.营养物质浓度及配比合适（C/N） 3.控制pH条件 4.控制氧化还原电位（redox potential ） 5.原料来源的选择 6.灭菌处理 1.适宜营养物质的选择 2.营养物质浓度及配比合适（C/N ） l碳氮比（C/N）：培养基中碳元素与氮 元素的物质的量比值，有时也指培养基 中还原糖与粗蛋白之比。 l如谷氨酸发酵生产： C/N=4时菌体大量繁殖，Glu积累少 ； C/N=3时菌体繁殖受抑，Glu大量积 累。 3.控 制 pH 条 件 l细菌: ph7.08.0 l放线菌：pH78.5 l酵母菌: ph3.86.0 l霉菌： pH4.06.0 维持培养基pH的方法 l使用磷酸缓冲剂： K2HPO4 /Na2HPO4 : KH2PO4/NaH2PO4 l采用“备用碱” CaCO3 、CaHCO3 l采用弱酸盐：柠檬酸盐、乳酸盐等 l采用液氨或盐酸 4.控制氧化还原电位 （redox potential） l好氧微生物：+0.1V。一般 +0.3+0.4V l厌氧微生物：+0.1以下 l兼性微生物：+0.1以上好氧呼吸；+0.1 以下进行发酵 5.原料来源的选择 l经济节约原则 l原料来源要广泛 l原料要易处理，处理成本要低 l原料处理后，废物、废液、废气要少 6.灭 菌 处 理 l高压蒸汽灭菌：1.05kg/cm，121.3 ，1530min。 l注意：高温灭菌对营养物质的破坏及pH 变化 （二）、培养基的类型及应用 根据微生物的种类 根据组成分划分 根据物理状态划分 根据使用用途划分 根据微生物的种类 细菌培养基(肉质蛋白胨培养基础) 放线菌培养基（高氏1 号合成培养基） 霉菌培养基（麦芽汁培养基） 酵母培养基（查氏合成培养基） (2)按成分不同划分培养基 l天然培养基（Complex medium;undefined medium) l合成培养基(Synthetic medium; defined medium) l半合成培养基(Semi-defined medium) 按培养基的成分 根据培养基组成物质的化学成分是否完全 了解，可将培养基分为： 合成培养基： 用化学成分已知的营养物质 配制而成的培养基。 天然培养基： 用化学成分未知或不完全知 道其化学成分的有机物质配制而成的培养基。 半合成培养基： 在天然培养基中加入部分 化学成分已知的营养物质或在合成培养基中加 入部分化学成分未知或不完全知道其化学成分 的有机物质配制而成的培养基。 (3)根据物理状态划分培养基 l固体培养基：含琼脂1.52% l半固体培养基：含琼脂0.20.7% l液体培养基 琼脂固体培养基 明胶培养基 硅胶固体培养基 天然固体基质 固体培养基是：在液体培养基中加入凝固 剂(1.5%-2.0 %的琼脂)而制成的培养基。 半固体培养基：是在液体培养基中加入 0.2%-0.7 %的琼脂配制而成。 液体培养基：不加任何凝固剂而按比例 配制成的营养液。 琼脂是由红藻门石花菜江蓠等藻 类中提取的胶体多糖。 琼脂的化学成分为多聚半乳糖硫 酸上下酯，熔点96，凝固点是40 50。 琼脂培养基可反复溶化凝固而不 改变性质。 绝大多数微生物不水解琼脂。 琼脂固体培养基： 培养基固化物琼脂与明胶的比较 按使用用途划分培养基 l基础培养基(Minimum medium) l加富培养基(Enrichment medium) l鉴别培养基(Differential medium) l选择培养基(Selective medium) l其它:分析培养基（Assay medium)、 还原性培养基(Reduced medium)等。 按大多数微生物的营养需要配制一种 培养基，称为基本培养基。再根据各种 微生物的不同需要加入一、二种物质， 应用较广。如培养某种营养缺陷型菌株 ，先配制基本培养基，之后再加入缺陷 型菌珠需要的那种营养成 分即可。 基本培养基： 是在培养基中加入血、血清、动植 物组织提取物。用来培养要求较苛刻的 某些异养微生物。 加富培养基： 纤维分解菌 含石蜡的培养基 用蛋白质做唯一的氮源的培养基 缺氮培养基可分离到固氮微生物 选择培养基： 试拟出从环境中分离解酚细菌菌株的主要 实验步骤。 l答：采用富集培养技术 l（1）配制以酚类化合物为唯一碳源的液体培养基，灭菌备用。 l（2）将少量待分离的样品接种于该液体培养基，培养一定时间 ，原来透明的培养液变得浑浊，说明已有大量的微生物生长。 l（3）取少量上述培养液转移至同样新鲜培养液中从新培养，该 过程重复数次后能利用酚类化合物的细菌在培养物中将大大提高 。 l（4）将最后的培养液涂布以酚类化合物为唯一碳源的琼脂平板 ，培养得到的菌落中大部分都是能降解酚类化合物的细菌。 l（5）挑取一部分单菌落分别接种于含有及缺乏酚类化合物的液 体培养基中进行培养，若在没有酚类化合物的培养液中不能生长 而在含有酚类化合物的培养液中能生长，则该挑取的单菌落即为 能降解酚类化合物的细菌。 l（6）纯化培养保存。 用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加 入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能 产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基的特产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基的特 殊化学物质发生特殊的化学反应，产生明显的特征性变殊化学物质发生特殊的化学反应，产生明显的特征性变 化，根据着种特征性变化，可将该种微生物与其他微生化，根据着种特征性变化，可将该种微生物与其他微生 物区分开来。鉴别培养基主要用于微生物的快速鉴定，物区分开来。鉴别培养基主要用于微生物的快速鉴定， 以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。 如大肠杆菌，接种到葡萄糖肉汤、麦芽糖肉汤和 乳糖肉汤中，它们可以分解这几种糖，并产酸产气。如 在这三种培养基中接种伤寒杆菌。 伤寒杆菌只能发酵葡萄糖和麦芽糖，不发酵乳糖， 只产酸不产气。这样就把大肠杆菌和伤寒杆菌区别开， 产气由产生的气泡观察到，产酸可由指示剂的颜色变化 观察到。 鉴别培养基(Differential medium)(Differential medium) ： 检查乳品和饮用水中是否含有肠道致病检查乳品和饮用水中是否含有肠道致病 菌，所用的伊红美兰培养基，是一种鉴别培菌，所用的伊红美兰培养基，是一种鉴别培 养基。将大肠杆菌接种在伊红美兰培养基养基。将大肠杆菌接种在伊红美兰培养基 上，当大肠杆菌发酵乳糖时，能使伊红美上，当大肠杆菌发酵乳糖时，能使伊红美 兰结合成黑色化合物，所以在这种培养基上兰结合成黑色化合物，所以在这种培养基上 长出来的大肠杆菌，呈紫黑色并带有金属光长出来的大肠杆菌，呈紫黑色并带有金属光 泽的小菌落，而产气杆菌在这种培养基上长泽的小菌落，而产气杆菌在这种培养基上长 出的是较大的棕色菌落。出的是较大的棕色菌落。 一 些 鉴 别 培 养 基 l例题1：设计一个实验，从土壤中筛选一种具有强的分泌某种蛋 白酶能力的霉菌，在此基础上进一步提高该霉菌分泌该蛋白酶的 能力。 （江苏大学2005） 答：一、筛选原理：凡是具有产蛋白酶能力的霉菌水解酪素生成酪 氨酸，在酪素平板上菌落周围出现透明的水解圈，透明水解圈与 菌落直径的比值（H/C）作为蛋白酶活性的定性指标。然后采用 诱变育种方法筛选正突变菌株。 二、培养基：马丁氏培养基、酪素平板培养基 三、实验方法：1.采集土样，用10倍稀释法，选择适宜的稀释度（ 一般为10-210-3）各取1ml用马丁氏培养基稀释倒平板分离培养 ，282培养4-7天。 2.平皿划线分离霉菌单菌落：282培养4-7天。 3.分别点接种酪素平板培养基，培养后，观察平板上透明水解圈的 有无与及其大小，根据透明水解圈与菌落直径的比值（H/C）作 为蛋白酶活性的定性指标，确定所筛选的目的霉菌（H/C最大） 。 4.斜面保存目的霉菌。 5.诱变育种：取10ml目的霉菌孢子悬液于平皿中，进行适宜时间和 强度的紫外线诱变，然后接种于酪素平板培养基，并作未诱变比 较，筛选明水解圈与菌落直径的比值（H/C）最大的菌株，此外 还可重复进行诱变育种 lx-1欲从土壤中筛选一株抗大肠杆菌高活性的芽孢杆 菌菌株，请拟出实验方案。(2004) l答：1.采集土样，用10倍稀释法根据芽孢杆菌耐热的 性能，选择适宜的稀释度，加热处理稀释液以杀死无 芽孢细菌，浓缩芽孢杆菌。 l2、在固体培养平板（营养琼脂）上涂布适宜数量的 E.coli，在37培养5h，用灭菌过的玻璃棒把平板上 的微落从新均匀涂布一遍，然后喷上1所处理的稀释 液。 l3、在37培养24-48h后，在固体培养平板观察独立 的菌落以及其抑菌圈的大小，挑取表面干燥、粗糙、 不透明、污白色或微带黄色的菌落，进行平板划线纯 分离单菌落。 l4、通过芽孢染色，判别所选菌落是否为芽孢杆菌。 l5、再用所选芽孢杆菌重复2进行筛选抑菌圈最大的菌 落，在进行平板划线纯分离的单菌落即为抗大肠杆菌 高活性的芽孢杆菌菌株。 lx-2因科研需要从自然界筛选一株胞外多糖的高产酵母菌株，请 拟出实验方案。（2005） l答：1.采集样品，用10倍稀释倒平板法，培养基采用查氏培养 基，在28下选择培养48h，即可观察到酵母菌菌落。 l2.进行平板划线纯分离单菌落即为酵母菌不同的菌株。 l3.将已分离的每种菌株分别接于已装有种子培养基的三角瓶中 ，于28、180rmin摇床培养48h进行种子的扩大。将扩大培 养的种子接种于已装有发酵培养基的三角瓶中，置于22、 120rmin摇床培养48h。每种菌做2个平行，进行酵母菌的发酵 培养。测定多糖含量。 l4.胞外多糖测定(苯酚硫酸法)：先用苯酚一硫酸法制作标准曲线 ，找出多糖浓度与吸光度之间的线形范围。然后进行酵母菌胞 外多糖的测定，发酵液中加入2倍体积95的乙醇后放置12h， 于3500rmin离心10min后得沉淀。沉淀于37真空干燥12h后 用水溶解并定容至500mL。用苯酚一硫酸法测其多糖含量，用 吸光度来比较多糖含量。 l5、根据测定结果确定多糖含量最高的酵母菌株并进行斜面保存 。 对于生产中使用的菌种保藏培养 基，要求比较丰富的氮源，以防止菌 种退化变质。 保藏菌种培养基： 第 二 节 微 生 物 的 产能代 谢 Microbial metabolism 微生物的代谢 一、能量代谢中的贮能与递能分子 二、微生物的主要产能方式 三、化能异养代谢中糖的降解 四、微生物合成细胞物质 五、次级代谢产物 产能代谢与分解代谢 l产能代谢与分解代谢密不可分。任何生物体的 生命活动都必须有能量驱动，产能代谢是生命 活动的能量保障。微生物细胞内的产能与能量 储存、转换和利用主要依赖于氧化还原反应。 l化学上，物质加氧、脱氢、失去电子被定义为 氧化，而反之则称为还原。 l发生在生物细胞内的氧化还原反应通常被称为 生物氧化。 微生物的产能代谢 l微生物的产能代谢即是细胞内化学物质经过一系列 的氧化还原反应而逐步分解，同时释放能量的生物 氧化过程。 l营养物质分解代谢释放的能量，一部分通过合成 ATP等高能化合物而被捕获，另一部分能量以电子 与质子的形式转移给一些递能分子如NAD、NADP、 FMN、FAD等形成还原力NADH、NADPH、FMNH和FADH ，参与生物合成中需要还原力的反应，还有一部分 以热的方式释放。另有一部分微生物能捕获光能并 将其转化为化学能以提供生命活动所需的能量。 l种类繁多的微生物所能利用的能量有两类：一是蕴 含在化学物质（营养物）中的化学能，二是光能。 微生物产能途径与方式 l微生物产能代谢具有丰富的多样性，但可归纳 为两类途径和三种方式，即发酵、呼吸（含有 氧呼吸和无氧呼吸）两类通过营养物分解代谢 产生和获得能量的途径。 l通过底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）、氧化磷酸化(oxidation phosphorylation)也称电子转移磷酸化(electron transfer phosphorylation)和光合磷酸化(photo- phosphorylation)三种化能与光能转换为生物通 用能源物质（ATP）的转换方式。 一、能量代谢中的贮能与递能 分子 lATP ： 在与分解代谢相伴随的产能代谢中，起捕获、 贮存和运载能量作用的重要分子是腺嘌呤核苷 三磷酸，简称腺苷三磷酸（adenosine triphosphate, 即ATP）。ATP是由ADP（腺苷 二磷酸）和无机磷酸合成的。ATP、ADP和无 机磷酸广泛存在于细胞内，起着储存和传递能 量的作用。因此,也称为能量传递系统（energy -transmitting system）。 ATP结构 ATP在细胞中的功能 l 提供生物合成所需的能量。在生物合成过程中， ATP将其所携带的能量提供给大分子的结构元件， 例如氨基酸，使这些元件活化，处于较高能态，为 进一步装配成生物大分子蛋白质等作好准备。 l 是为细胞各种运动（如鞭毛运动等）提供能量来 源。 l 为细胞提供逆浓度梯度跨膜运输营养物所需的自 由能。 l 在DNA、RNA、蛋白质等生物合成中，保证基因 信息的正确传递，ATP也以特殊方式起着递能作用 等等。 l 在细胞进行某些特异性生物过程如固定氮素时提 供能量。 烟酰胺辅酶NAD与NADP l烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadenine dinucleotide, NAD，辅酶I）和烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotidephosphate, NADP，辅酶）为物 质与能量代谢中起重要作用的脱氢酶的辅酶 l作为电子载体，在能量代谢的各种酶促氧化-还 原反应中发挥着能量的暂储、运载与释放等重 要功能。 l其氧化形式分别为NAD和NADP，在能量代 谢氧化途径中作电子受体。还原形式为NADH 和NADPH，在能量代谢还原途径中作电子供体 烟酰胺辅酶的结构和 氧化还原状态 黄素辅酶FMN与FAD l黄素单核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）和 黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）是核黄素(riboflavin，即维 生素B2 )在生物体内的存在形式，是细胞内一类 称为黄素蛋白的氧化还原酶的辅基，因此也称为 黄素辅酶。 l核黄素是核醇与7, 8-二甲基异咯嗪缩合物。 l由于在异咯嗪的1位和5位N原子上具有两个活泼 的双键，故易发生氧化还原反应。因此，它有氧 化型和还原型两种形式。 FMN和FAD的分子结构 FAD和FMN的氧化还原构型 黄素辅酶的生理功能 l黄素辅酶与许多不同的电子受体和供体 一起，通过3种不同的氧化还原状态参与 电子转移反应，在细胞的物质与能量代 谢的氧化还原过程中发挥传递电子与氢 的功能，促进糖、脂肪和蛋白质的代谢 。 分解代谢和合成代谢的关系 二、微生物主要产能方式 (一)发酵(Fermentation) (二)呼吸(Respiration) (三)无机物氧化(Oxidation of inorganics) (四)光能转换(Photoconversion) （一） 发 酵 l发酵: 是微生物在无氧条件下的生长过程中获得能 量的一种方式. 在发酵过程中有机物既是被氧 化的基质又是氧化还原反应过程中的电子最终 受体, 并且这种作为电子最终受体的有机物通 常都是被氧化基质不完全氧化的中间产物 l工业发酵: 是指微生物在有氧或无氧条件下通过物质的 分解与合成两个代谢过程将某些物质转变成某 些产物的整个过程 化能异养代谢中糖的降解 l（一）己糖降解，形成丙酮酸的途径 1.EMP途径（Embden-meyerhof- parnas pathway) 2.HMP途径（Hexose monophospate pathway) 3.ED途径(Enter-doudoroff) 4.WD途径 5.葡萄糖直接氧化途径 EMP 途 径2 lEMP途径的特点: （1）葡萄糖分解是从1，6-二磷酸果糖开始 （2）整个途径仅在第1，3，10步反应是不可 逆的 （3）EMP途径的特征性酶是1，6-二磷酸果糖 醛缩酶 （4）整个途径不消耗氧 （5）有关酶系位于细胞质中 EMP途径的生理功能: M (1)提供ATP和NADH； M (2）中间产物可生物合成提供碳骨架 WD途径1 lWD途径是由沃勃（Warburg）、狄更斯（ Dickens）、霍克（Horecker）等人发现 的，故称WD途径。由于 WD途径中的特征 性酶是磷酸解酮酶（Phosphoketolase） ，所以又称磷酸解酮酶途径。根据磷酸 解酮酶的不同，把具有磷酸戊糖解酮酶 的叫PK途径，把具有磷酸已糖解酮酶的 叫HK途径。 WD途径2 由Warburg, Dickens & Horecker等人 发现 PK途径：具磷酸戊糖解酮酶 HK途径：具磷酸己糖解酮酶 WD途径 PK途径 HK途径 HK途径:含磷酸己糖解酮酶 两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) 利用此途径分解葡萄糖。 每mol葡萄糖经HK途径产生1mol乳酸、 1.5mol乙酸和2.5mol ATP。 HK途径图 葡萄糖直接氧化途径 l有些假单胞菌属（Pseudomonas)、气杆 菌属(Aerobacter)、醋杆菌属(Acetobacter) 的某些菌不具备己糖激酶，不能将葡萄 糖磷酸化，但具有葡萄糖氧化酶，能利 用空气中的氧，把葡萄糖直接氧化成葡 萄糖酸再经磷酸化进行降解。 葡萄糖直接氧化途径图 Stickland反应 l某些厌氧梭菌如生孢梭菌（Clostridium sporogenes）等，可把一些氨基酸当作碳源、 氮源和能源。这是以一种氨基酸作氢供体，另 一种氨基酸作为氢受体进行生物氧化并获得能 量的发酵产能方式。后将这种独特的发酵类型 ，称为Stickland反应。 lStickland反应是经底物水平磷酸化生成ATP， 其产能效率相对较低。在Stickland反应中，作 为供氢体的有多种氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸 、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丝 氨酸和色氨酸等，作为受氢体的主要有甘氨酸 、脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸和精氨酸等。 lClostridium sporogenes中 以丙氨酸为供 氢体和以甘氨 酸为受氢体的 Stickland反 应 发酵(Fermentation) l广义的发酵是指微生物在有氧或无氧条 件下利用营养物生长繁殖并生产人类有 用产品的过程。 l狭义的发酵仅仅是指微生物生理学意义 上的，它一般是指微生物在无氧条件下 利用底物代谢时，将有机物生物氧化过 程中释放的电子直接转移给底物本身未 彻底氧化的中间产物，生成代谢产物并 释放能量的过程。 丙酮酸的厌氧去路 l在葡萄糖转化为丙酮酸后，厌氧微生物和无氧条件下的 兼性厌氧微生物可以不同的途径将丙酮酸转化为多种发 酵产物。 l乳酸细菌可以将丙酮酸还原为乳酸。 l酵母菌将丙酮酸脱羧形成乙醛，再由乙醛还原形成乙醇 。 l丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、真杆菌属(Eubacterium) 和羧状芽孢杆菌属（Clostridium）的一些种如丁酸羧 菌（C.butyricum）、克氏羧菌(C.kluyveri)等，通过 将丙酮酸脱羧并辅酶A化形成乙酰-CoA，然后2个乙酰- CoA缩合为乙酰乙酰CoA，在经过多个步骤形成丁酸。也 可由多种肠道细菌将丙酮酸发酵为包括甲酸、乙酸、乳 酸、琥珀酸、乙醇、丙三醇、2, 3-丁二醇、3-羟丁酮 等多种有机酸和醇的混合酸。 酵母菌的乙醇发酵 lC6H12O6 + 2ADP + 2 H3PO4 2CH3OH + 2 ATP + 2CO2+2H2O 乳酸细菌的正型乳酸发酵 C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP + 2H2O 发酵过程中底物水平磷酸化 微生物发酵代谢的多样性 l在无氧条件下发酵时，不同微生物在以 糖类为底物的重要代谢途径中，其终端 产物或中间产物进一步发酵产能代谢的 途径呈现出丰富的多样性，即使同一微 生物利用同一底物发酵时也可能形成不 同的末端产物。 酵母发酵代谢的多样性 l型发酵：酵母菌将葡萄糖经EMP途径降解生成2分子终端 产物丙酮酸，后丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛作为氢受体使 NADH2氧化生成NAD+，同时乙醛被还原生成乙醇，这种发酵 类型称为酵母的型发酵。 l型发酵：当环境中存在亚硫酸氢钠时，亚硫酸氢钠可与 乙醛反应，生成难溶的磺化羟基乙醛，该化合物失去了作 为受氢体使NADH2脱氢氧化的性能，而不能形成乙醇，转而 使磷酸二羟丙酮替代乙醛作为受氢体，生成-磷酸甘油， -磷酸甘油进一步水解脱磷酸生成甘油。 l型发酵：葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸，后脱羧生成乙醛 ，如处于弱碱性环境条件下(pH 7.6)，乙醛因得不到足够 的氢而积累，2个乙醛分子间发生歧化反应，1分子乙醛作 为氧化剂被还原成乙醇，另1个则作为还原剂被氧化为乙酸 。而磷酸二羟丙酮作为NADH2的氢受体，使NAD+再生，产物 为乙醇、乙酸和甘油。 （二）呼吸产能代谢 l有氧呼吸: 以分子氧作为质子和电子的最 终受体的呼吸 作用 C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 36ATP l无氧呼吸: 又称无氧呼吸,作为最终的电子受体物质不是 分子氧,而是NO3-、SO42-或CO2等无机物，或延 胡索酸等有机物，作为呼吸基质的物质一般是 有机物。通过无氧呼吸基质可被彻底氧化成 CO2，并伴随有ATP的生成。 微生物好氧呼吸中的电子传递 典型的好氧性电子传递链 电子传递链上氧化磷酸化合成 ATP的机制 l电子在呼吸链传递产生的自由能，在特定的部位被 称为质子泵（proton pump）驱动H+从基质跨过内 膜到达膜间隙的一边，从而形成内膜两边电化学电 势差，使基质的H 浓度低于膜间隙，因而基质形 成负电势，而膜间隙形成正电势。这样就形成了电 化学梯度即电动势（electromotive force, EMF）， 此可称为质子动势或质子动力（protonmotive force, PMF），这种质子动势蕴含的自由能作为动 力，驱动位于内膜中的ATP合成酶（复合体V）将 H+从膜间隙一边经质子通道泵回至基质一边，在这 一过程中将能量转移给ADP与Pi合成ATP。同时降 低内膜两边的电化学电势差，并实现H+的跨膜循环 。 微生物中呼吸链的多样性 l尤其是异养与自养这两大类微生物的呼吸链组成与 结构在某些种属间有较明显的不同。 l真核微生物酵母菌具有组成与结构完整的呼吸链， 而一些营有氧或无氧呼吸获得能量的自养微生物中 的某些代谢类型，其呼吸链较短，有的甚至只有 12类氧化还原酶系组成，它们把简单的无机物作 为电子供体，这些电子供体直接与位于细胞质膜中 的呼吸链组分偶联传递电子，进行氧化磷酸化生成 ATP。其呼吸链组分不全、长度较短，结果是氧化 磷酸化生成ATP的偶联位少，因此，电子流经呼吸 链时产能少，根本原因是它们所能利用的无机电子 供体所载有的能量大多数较少，这是导致自养型微 生物生长比较缓慢的重要原因。 有氧呼吸产能途径 有氧呼吸也称好氧呼吸，它是自然界最为普遍的 生物氧化产能方式。 微生物能量代谢中的有氧呼吸可根据呼吸基质即 能源物质的性质分为两种类型：一是主要以有机 能源物质为呼吸基质的化能异养型微生物中存在 的有氧呼吸，二是以无机能源物质为呼吸基质的 化能自养型微生物的有氧呼吸。 这两种类型的呼吸作用的共同特点是它们的最终 电子受体均为氧。 以有机物为呼吸基质的有氧呼吸 l常见的异养微生物最易利用的能源和碳源有葡 萄糖等。葡萄糖经EMP途径酵解形成的丙酮酸 ，在无氧的条件下经发酵转变成不同的发酵产 物，如乳酸、乙醇和CO2等，并产生少量能量 。 l在环境有氧的条件下，细胞行有氧呼吸，丙酮 酸先转变为乙酰CoA（acetyl-coenzymeA， acetyl-CoA），随即进入三羧酸循环 (tricarboxylic acid cycle，简称TCA循环)，被彻 底氧化生成CO2和水，同时释放大量能量。 lTCA 循环 以无机物为呼吸基质的有氧呼吸 l以无机物作为氧化基质，并利用该物质氧化过程中 释放的能量进行生长。这类微生物主要是好氧型的 化能自养型微生物 l它们能以无机物如NH4、NO2-、H2S、So、H2和Fe2+ 等为呼吸基质，把它们作为电子供体，氧为最终电 子受体，电子供体被氧化后释放的电子，经过呼吸 链和氧化磷酸化合成ATP，为还原同化CO2提供能 量。 l这类好氧型的化能无机自养型微生物主要属于氢细 菌、硫化细菌、硝化细菌和铁细菌等。 l它们广泛分布在土壤和水域中，并对自然界的物质 转化起着重要的作用。 无机物呼吸反应及其产能 无氧呼吸 l无氧呼吸亦称厌氧呼吸。某些