三维氮掺杂石墨烯葡萄糖生物传感器制备及表征

学号 密级 武汉大学本科毕业论文武汉大学本科毕业论文 三维氮掺杂石墨烯葡萄糖生物传感器三维氮掺杂石墨烯葡萄糖生物传感器 制备及表征制备及表征 院（系）名 称：化学与分子科学学院 专 业 名 称 ：化学基地班 学 生 姓 名 ： 指 导 老 师 ： 年月 BACHELORS DEGREE THESIS OF WUHAN UNIVERSITY THE PREPARATION AND CHARACTERATION OF THREE-DIMENSIONAL NITROGEN- DOPED GRAPHENE GLUCOSE BIOSENSOR College: College of Chemistry and Molecular Science Subject: Chemistry Name: Jingxing Guo Directed by: Prof. Lei Fu 郑郑 重重 声声 明明 本人呈交的学位论文，是在导师的指导下，独立进行研究工作所 取得的成果，所有数据、图片资料真实可靠。尽我所知，除文中已经 注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含他人享有著作权的 内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已 在文中以明确的方式标明。本学位论文的知识产权归属于培养单位。 本人签名： 日期： 摘摘 要要 石墨烯，由于其具有良好的导电性能、较高的电催化性能以及大的比表面积, 使得它在生物电化学和生物传感方面倍受青睐。其中，利用葡萄糖氧化酶构建的 石墨烯葡萄糖生物传感器已经成为了研究的一大热门。然而，近年来这类生物传 感器的灵敏度却总是被电极与酶之间低效的电子传递、较小的催化反应面积和电 极材料本身较差的导电性等因素所限制。为了解决这个问题，我们利用化学气相 沉积方法，以镍泡沫为基底，在生长过程中引入氨气，生长出电学性能极佳的高 质量的三维氮掺杂石墨烯。为了加强石墨烯与酶的结合力，我们用壳聚糖对其表 面进行了修饰，成功制备出了三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖/葡萄糖氧化酶复合物电 极,并对其葡萄糖传感的能力进行了测定和评估。三维孔结构大的比表面积、氮掺 杂石墨烯优异的电学性能，使得该传感器具有从未报道过的极高的传感灵敏度 （高达 224.24 AmM1cm2） 。此外，还兼具有低检出限、高选择性等优点。不 仅如此，这种设计还可以推广到其他生物传感器体系。因此，这种全新的葡萄糖 生物传感器是一种具有极大潜力的高效葡萄糖生物传感材料，在未来具有极好的 应用前景。 关键词：关键词：三维氮掺杂石墨烯；葡萄糖氧化酶；葡萄糖生物传感器 ABSTRACT Graphene, which owns good conductivity, favorable electron-catalysis and high surface area, showed its excellent application in bioelectronics and biosensing. In recent years, the study of glucose sensors based on graphene and glucose oxidase becomes more and more popular. However, its sensing sensitivity is often limited by inefficient electron transfer between the enzyme and the electrode, as well as small active catalytic reaction area and poor conductivity of electrode. To solve these problems, we used nickel foam and ammonia as substrate and nitrogen source respectively, prepared three- dimensional nitrogen-doped graphene, which has high quality and fine electrical property. To improve the interaction between enzyme and the graphene, chitosan was employed and assembled into the 3D N-doped graphene/chitosan/GOx composite biosensor. The performance of this biosensor was also studied. Taking advantage of the porous conductive network of N-doped graphene, the sensor possesses extremely high sensitivity of glucose sensing (224.24 AmM1cm2), which has never been reported before. In addition, it also has low detection limit and good selectivity. Furthermore, the design can also extend to other enzyme biosensors. So, this kind of composite electrode is a brand-new potential material of effective glucose biosensor, and will be in good application in the future. Key words: Three-dimensional nitrogen-doped graphene; Glucose oxidase; Glucose biosensor 目 录 第一章 绪论.1 1.1 氮掺杂三维石墨烯简介.1 1.1.1 氮掺杂三维石墨烯结构与性质1 1.1.2 氮掺杂三维石墨烯的制备方法2 1.1.3 氮掺杂三维石墨烯的表征方法5 1.1.3.1 拉曼光谱（Raman Spectra）.5 1.1.3.2 扫描电子显微镜（SEM） .6 1.1.3.3 X 射线光电子能谱（XPS） .7 1.2 葡萄糖生物传感器简介.8 1.3 论文选题及研究思路.10 第二章 新型三维氮掺杂石墨烯葡萄糖生物传感器制备.11 2.1 实验设备及材料.11 2.2 实验方案设计.11 2.3 镍泡沫上 CVD 法制备三维氮掺杂石墨烯.11 2.3.1 实验过程12 2.3.1.1 CVD 生长过程.12 2.3.1.2 三维氮掺杂石墨烯的转移13 2.3.2 Raman 表征.13 2.3.3 XPS 表征.14 2.4 三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖/GOX生物传感器制备15 2.4.1 三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合物制备.15 2.4.2 GOx 在复合物表面的吸附15 2.4.3 生物传感电极制备15 第三章 三维氮掺杂石墨烯葡萄糖生物传感器性质研究.17 3.1 复合物的 SEM 表征.17 3.2 三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖/GOX复合物表面 GOX的直接电子传递18 3.2.1 GOx 直接电子传递机理18 3.2.2 复合物表面 GOx 直接电子传递情况18 3.2.3 氮掺杂与未掺杂情况对比19 3.2.4 不同扫描速度下的电子传递情况20 3.3 壳聚糖作用的机理探讨.21 3.3.1 PAA 体系的电子传递情况对比22 3.3.2 PEI 体系的电子传递情况对比23 3.4 三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖/GOX复合物电极对葡萄糖的生物传感24 3.4.1 电极对葡萄糖的生物传感机理24 3.4.2 电极对不同葡萄糖浓度的响应25 3.4.3 电极传感选择性26 第四章 总结与展望.28 参考文献.30 致谢.35 1 第一章 绪论 1.1 氮掺杂三维石墨烯简介 1.1.1 氮掺杂三维石墨烯结构与性质氮掺杂三维石墨烯结构与性质 2004 年，英国曼彻斯特大学的科学家 A. K. Geim 和 K. S. Novoselov 利用一 种简便的方式胶带机械剥离法1制备出了具有划时代意义的新型碳材料 石墨烯。石墨烯作为零带隙的半导体，在室温下具有极高的载流子迁移率；此外， 石墨烯具有反常的量子霍尔效应，使得其成为量子点动力学理论研究的一个很优 异的模型；再者，石墨烯还拥有优异的光学性能和超高的导电性，这也使得其在 电学器件研究和柔性电子学领域都有出类拔萃的表现。石墨烯一经问世，就激起 了科学家们对它的狂热兴趣。但是，众所周知，常规制备的粉末状状石墨烯填充 密度极小（比如水热法制备的氧化石墨烯），杂乱堆积；CVD 生长、机械剥离的 的石墨烯膜机械强度差，无法单独实现弯折等操作，因此在很多场合下直接利用 石墨烯比较困难。为了满足这些场合对石墨烯的要求，我们需要构筑具有一定结 构的石墨烯基材料。就像石墨一样，石墨烯很难直接制备成型，需要用一定的方 法将石墨烯组装成各种各样的宏观的 三维结构。于是，三维石墨烯的制备得到 了极大的发展。为了支撑其三维结构， 它本质上是由许多的石墨烯层叠而成， 而非均一的单层或双层2。这样，使三维石墨烯兼具单层和多层的特点。除了具 有一般石墨烯的优良特性外，由于其独特的结构，它的导电性能会显著增加、比 表面积增大、力学强度加强，在化学催化和电容器方面也表现出优良的性能3。 由于其具有的优异物理和电学性能，三维石墨烯已成为目前研究领域的一大热点。 元素掺杂是指在已有的材料原子中利用化学手段掺杂入其它原子，以期获得 原材料不具有的性质的一种方法。该方法在石墨烯上也有许多应用，比如将石墨 烯进行各种元素掺杂。其中，较为重要的就是氮掺杂石墨烯。在近期的一些研究 中发现，对石墨烯进行氮元素掺杂会明显改善其电学稳定性以及电催化活性4。 此外，氮掺杂石墨烯会具有更佳的电子传递效率5。更重要的是，引入的氮原子 在水相中可以产生一个潜在的氢键作用，因此氮掺杂对石墨烯在生物电化学传感 器中的应用起到了积极作用。清华大学的李景虹等已经报道过，当被应用在生物 2 电极上时，氮掺杂石墨烯会具有更好的生物相容性和更高的响应电流6。因此， 我们有理由相信，氮掺杂是改善石墨烯电学性能的有用手段。 综上所述，我们若能将上述三维结构与氮掺杂结合起来，那么三维氮掺杂石 墨烯会是一种更优良的碳材料，在电学器件应用方面会具有更大的优势。 1.1.2 氮掺杂三维石墨烯的制备方法氮掺杂三维石墨烯的制备方法 我们整理了近年来一些相关工作，特在此简要介绍一些热门的三维石墨烯和 氮掺杂石墨烯的制备方法。其中，有代表性的三维石墨烯制备方法主要可分为以 下两大类： （1） 化学改性石墨烯的自组装 氧化石墨烯（GO）和还原氧化石墨烯（rGO）通常合称为化学改性石墨烯 （CMGs）。CMGs具有高化学反应性、低成本、可大量制备等优点7，因此得到 了广泛应用。由于CMGs表面具有许多反应基团（比如羟基和羧基），这些基团 会存在范德华力和静电作用力之间的亲水疏水平衡。因此在水相中，CMGs原本 二维的结构可以通过相互作用自组装成三维结构。为了完成这一过程，前人设计 了许多巧妙的方法，比如：GO凝胶化8（图1.1a）、GO离心蒸发诱导自组装9、 rGO原位自组装10（图1.1b）、呼吸图像模板化自组装11（图1.1c）以及电化 学沉积12（图1.1d）等。这些方法构建的三维石墨烯往往都具有小孔径、多层堆 积、形貌不规则等特点，兼具化学反应活性好、成本低，具有在油水分离器、疏 水材料等应用方面的优势。 （2） 模板法 与自组装法不同的是，模板法是利用现有的三维材料作为模板，在上面生长 或负载石墨烯。当除去三维材料后，石墨烯会复制模板的形貌，从而使自己也具 有三维结构。该类方法最大的特点是可以构建出具有规则形状的孔状网格结构， 而且可以通过调控模板形貌来人为改变三维石墨烯的结构。由于模板法具有其独 特的优点，近年来该方面的研究也是层出不穷，比如化学气相沉积（CVD）模板 法2、PS胶体模板法13和干涉光刻法14等。由于CVD法制备的石墨烯具有良好的 电学性能，而且层数规整可控，对于电学器件的制备具有较大优势，因而在此着 重介绍。 3 图1.1 （a）GO凝胶化的原理示意图及SEM图像；（b）rGO原位自组装 前后样品形貌和其SEM图像；（c）呼吸图像模板化自组装的原理示意 图及SEM图像;（d）rGO电化学沉积的SEM图像。 CVD法的原理简单来说，就是指反应物质在气态条件下发生化学反应，生成 的固态物质沉积在衬底或者催化剂表面，进而制得固体材料的方法。早在2009年 初，麻省理工学院的J. Kong研究组15与韩国成均馆大学的B. H. Hong研究组16就 利用沉积有多晶镍的硅片作为衬底制备出大面积少层石墨烯，从而掀起了CVD石 墨烯制备的热潮。如今，CVD法已经成为了制备大面积均匀石墨烯的重要方法。 该方法的主要原理分为两种：（1）渗碳析碳机制：高温下碳源裂解产生的碳可 以溶解在镍等金属中，而在降温过程中，碳原子在金属中的溶解度减小，从而从 基底内部析出成核，进而形成石墨烯；（2）表面生长机制：碳在铜等金属中溶 解度差，高温下碳源裂解产生的碳原子只吸附在衬底表面，从小石墨烯岛逐渐生 长连成连续的石墨烯。具体原理示意见图1.2。 这种方法同样适用于三维石墨烯的制备。中国科学院金属研究所的成会明等 2利用镍泡沫作为生长基底，以甲烷为碳源，在1000 下制备出了高质量的三维 孔结构石墨烯（如图1.3所示） 。这种三维石墨烯很好地复制了基底镍泡沫的形貌， 具有高比表面、高导电性、良好力学性能等一系列优点，而且孔结构尺寸和石墨 烯层数都可控，很适合应用于气体传感、超级电容器、太阳能电池等电学器件上。 4 图1.2 CVD原理的（a）渗碳析碳机制和（b）表面生长机制的示意图。 图1.3 附着在镍泡沫表面CVD生长的三维石墨烯的SEM图像。可以观察到 其表面的褶皱。 除了这两大类之外，还有许多其他有趣的制备方法1719，此处就不一一详述 了。 另一方面，对石墨烯进行氮掺杂的方法也有很多，常用的有联氨处理法20、 等离子体处理法21、热处理法22、水热法23和 CVD 法24等几种。其中，CVD 法 有着自身独特的优势。该方法的基本原理是在 CVD 制备石墨烯的基础上，利用 电子束蒸发或者高温将氮源（主要是 N2或 NH3）分解，分解后产生的氮原子与 5 碳原子一同沉积在基底表面，从而完成氮掺杂石墨烯的生长。这样做可以将石墨 烯生长与氮掺杂结合起来（不同于等离子体法需要先制备 GO 再进行氮掺杂）， 在生长过程中就引入氮原子，从而尽量避免对石墨烯结构大的破坏，保证了其优 良性质。图 1.4 为一种 CVD 法氮掺杂的示意图。该方法是利用电子束蒸发将氮气 分解为氮原子，与硼原子混合后沉积在 SiO2/Si 表面，再在其表面镀上一层镍用 于溶解碳原子；在降温过程中，氮和溶解在镍中的碳一起在基底表面析出，从而 得到高质量的氮掺杂石墨烯。 图 1.4 一种 CVD 法生长氮掺杂石墨烯的原理示意图。 综合前人研究结果可以看出，CVD 能够将制备三维石墨烯和石墨烯氮掺杂结 合起来，成为一种有前途的制备三维氮掺杂石墨烯的方法。 1.1.3 氮掺杂三维石墨烯的表征方法氮掺杂三维石墨烯的表征方法 1.1.3.1 拉曼光谱（拉曼光谱（Raman Spectra） 拉曼（Raman）光谱是一种基于光散射的无损表征方法。在鉴别石墨烯方面， 它已经成为了一种高效、快速的鉴别其质量的手段5。对于石墨烯而言，在 Raman光谱图中我们关注的主要散射峰为G峰、D峰和2D峰，分别位于1350 cm 1，1580 cm1和2700 cm1处。其中，D 峰是在碳环中的sp2键的呼吸振动模式导 致的，而G 峰则是在碳环和碳链中的碳原子的sp2键的伸缩模式导致。一般来说， D峰的存在与石墨烯的缺陷有关，而G峰与2D峰的比值则更多地给我们提供了关 于石墨烯层数的一些信息（如图1.5所示） 。 而对于氮掺杂石墨烯而言，D峰代表的缺陷是由于所掺杂的氮原子在石墨烯 晶格中带来的缺位所引起的24。此外，峰强度的比值同样对表征有着重大意义。 D峰和G峰强度的比值可以用来判定掺杂所带来的缺陷程度，而2D峰和G峰强度的 比值则有助于人们了解掺杂氮量的多少。因此，Raman光谱是一种很好的表征氮 掺杂石墨烯的方法（如图1.6所示） 。 6 图1.5 石墨烯随层数变化的Raman谱图。n为层数，HOPG为高定向热解石 墨。 图1.6 CVD法生长石墨烯，低氮含量氮掺杂石墨烯和高氮含量氮掺杂石墨 烯的Raman光谱。D、G和2D分别代表了石墨烯的D、G和2D特征峰。插 入图是高氮含量氮掺杂石墨烯的2D峰的放大图。 1.1.3.2 扫描电子显微镜（扫描电子显微镜（SEM） 扫描电子显微镜（SEM）是一种快速有效的对样品形貌进行高分辨率观察的 手段。它的原理主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭 窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生二次电子发射，而二 次电子能够产生样品表面放大的形貌像，从而达到高分辨成像的目的。不同于光 7 学显微镜的聚焦作用，通过二次电子成像不会被凸凹不平的样品表面所影响，使 得该方法特别适合观察具有三维结构的石墨烯及其表面形貌情况。图1.7为不同分 辨率下的三维石墨烯的SEM图像，可以很清晰地看出其结构和表面形貌信息。 图1.7 （a） （b） （c） （d）不同分辨率下的三维石墨烯SEM图像。 1.1.3.3 X射线光电子能谱（射线光电子能谱（XPS） X射线光电子能谱（XPS）的原理基于著名的光电效应。其原理是利用X射线 去辐射样品，使原子或分子的内层电子或价电子受激发射出来，从而产生光电子。 通过测量光电子的能量，就可以获得试样有关信息。作为一种对元素进行定性定 量的方法，它不仅可以用来研究石墨烯所含元素的含量等信息，还可以对单个元 素的化学环境进行深入分析。因此，XPS就常常被用来研究石墨烯的掺杂情况25。 图1.8展示了氮掺杂石墨烯的XPS谱图及分析结果。由图可知，氮元素在石墨烯结 构中主要有三种化学环境，分别为吡啶型氮（N1） ，吡咯型氮（N2）和季氮 （N3） 。这三种N都有着自己独特的结合能（binding energy）范围。在XPS谱图上 我们可以看出，吡啶型氮大致在398.1 eV399.3 eV 范围内, 吡咯型氮则在399.8 eV401.2 eV 范围内, 而最后的季氮大致在401.1 eV402.7 eV处24。 8 图1.8 氮掺杂石墨烯氮元素（N1s）的XPS谱图以及结构示意图。 除了能够提供结构信息，XPS还可以给出氮的相对含量，直接告诉人们氮元 素在石墨烯中含有量的多少。因此，XPS与Raman光谱结合起来就可以对氮掺杂 石墨烯进行一个比较完善的结构分析和表征。 1.2 葡萄糖生物传感器简介 葡萄糖是自然界分布最广泛的一种单糖。众所周知，作为主要的能源物质和 反应中间物，它广泛参与到人体的各项生化反应中（比如著名的三羧酸循环）， 与人体健康有着莫大关联。因此，能够对葡萄糖进行特定响应的葡萄糖生物传感 器的研究应运而生。葡萄糖生物传感器是一种将能与葡萄糖产生特定响应的酶和 电极材料相结合的传感材料，其基本原理是：酶与底物葡萄糖发生催化反应，并 通过一定方式与电极材料之间发生电子传递，从而将响应的化学信号转化成电流 信号。由于采用了酶作为响应物质，因此相比于其他的非生物传感器3,27而言， 具有高选择性、高稳定性和响应范围宽等特点。因此，这方面工作一直是生化分 析的热门领域。它不仅可以应用于基本的血糖检测，而且对于近年来较为火热的 生物燃料电池领域，它也有很好的应用前景26。参与反应的酶可以是葡萄糖脱氢 酶（GDH）和葡萄糖氧化酶（GOx），但是 GDH 参与反应时需要其它物质作为 氧化还原介体，使其在稳定性上不如 GOx，因此 GOx 成为构建生物传感器更理 想的酶28。 从 1962 年 Clark 和 Lyons 工作的初露头角29直至今日，葡萄糖生物传感器研 究已经蓬勃发展了五十多年。总的说来，我们可将其发展分为三代。这三代传感 器在底物响应方面都依赖着同一个反应：葡萄糖通过 GOx 催化作用生成葡萄糖 9 酸内酯，GOx 分子内的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）变成还原型黄素腺嘌呤二核 苷酸（FADH2），葡萄糖酸内酯进一步水解为葡萄糖酸。用方程式表示如下： GOx (FAD) + 葡萄糖 GOx (FADH2) +葡萄糖酸内酯 （1.1） 但是，这三代传感器在 GOx 与电极材料之间电子传递方式有着不同。由于 FAD 位于 GOx 分子内部，难以与电极材料接触，因此如何实现两者之间的电子 传递过程是最需解决的问题。最早的第一代葡萄糖生物传感器是利用该反应生成 的副产物 H2O2作为电子传递介体，H2O2在电极表面还原成 O2，并将电子传递给 电极。第二代则是人为构建一个更高效的电子传递介体，比如二茂铁和铁氰化物 30,31，来完成这一过程。而作为当今葡萄糖生物传感器研究的主体，第三代已经 实现了 GOx 与电极之间的直接电子传递，无需任何传递介体。图 1.9 为传感器的 机理示意图。这三代的发展，目的主要是提高 GOx 与电极之间的电子传递效率； 而效率的提高会明显改善传感性能，比如响应灵敏度和稳定性等。 图 1.9 第一代（A），第二代（B）和第三代（C）葡萄糖酶生物传感器 的电子传递示意图。 除了电子传递方式的改进，电极材料的更新也是推动葡萄糖生物传感器发展 的一大动力。为了提高电极效率，近年来人们研究了一大批用于构建高性能生物 电极的酶载体材料，比如金属氧化物、金属纳米粒子、导电高聚物、碳纳米管等。 石墨烯，作为一种新型的优异电学材料，自然而然也成为了电极材料的一大候选。 从 2009 年至今，已经有大量的石墨烯基葡萄糖生物传感器的报道涌现出来3234， 这些工作都取得了一定的成果。在这类研究中，化学改性石墨烯占据着主导地位， 这不仅因为 GO 和 rGO 上的化学基团具有良好的酶结合力，其低成本、易大规模 10 制备的特点也是原因之一。然而，其较差的电学性能却制约着传感器的改进，在 这方面，CVD 制备的高质量石墨烯具有着较大优势。若能克服其较差的酶结合能 力，将它与 GOx 结合起来，想必会大大改进葡萄糖生物传感器的性能。 1.3 论文选题及研究思路 葡萄糖生物传感器如今虽已经达到了一个较成熟的发展阶段，但是广泛运用 的 GO 和 rGO 电极材料仍然存在许多不可忽视的缺点，比如导电性差、催化反应 面积和酶结合面积小等。针对这些缺点，我们做了以下设计： （1）利用 CVD 生长的高质量氮掺杂石墨烯来制备酶载体电极材料，克服化学改 性石墨烯电学性能较差的缺点，大幅改进生物电极在电学方面的性能； （2）将氮掺杂石墨烯设计成三维孔结构，而不是以往工作中的石墨烯膜。这样 可以使载体材料具有更大的酶吸附面积和催化反应面积； （3）选用壳聚糖这种具有良好酶吸附能力和成膜性的材料与氮掺杂三维石墨烯 结合，以求进一步加强其酶结合能力，使其能够进行高效吸附。 根据以上设计，我们计划制备出高质量的三维氮掺杂石墨烯，并把它作为酶 载体材料，组装成三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖/GOx 生物传感器，并将其制备成葡 萄糖生物电极。由于其综合了 CVD 法生长石墨烯、氮掺杂法和三维孔结构的优 势，我们预计它在葡萄糖传感方面会具有高酶吸附量、高选择性和高灵敏度等一 系列特点，并成为一种有应用潜力的新型生物传感器材料。 11 第二章 新型三维氮掺杂石墨烯葡萄糖生物传感器制备 2.1 实验设备及材料 镍泡沫：1.65mm thick, Alantum Advanced Technology Materials, China 化学气相沉积系统（CVD）：Thermo Scientific，Lindberg Blue M 激光共聚焦显微拉曼（Raman）：Reinshaw，Reinshaw inVia（532 nm 激光器） X 射线光电子能谱分析仪（XPS）：Thermo Scientific，ESCALAB 250Xi 扫描电子显微镜（SEM）：Zeiss Sigma 电化学工作站：CHI 660a 葡萄糖氧化酶（GOx）：源自黑曲霉，Sigma-Aldrich USA 实验所用其他药品皆为分析纯，来自国药试剂有限公司（Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd） 。 2.2 实验方案设计 三维石墨烯（3DG）的生长以及氮的掺杂主要依靠化学气相沉积法来进行。 由于氮源为氨气，而且在生长过程中还有甲烷、氢气和氩气的引入，因此需找出 各个气体最合适的比例来生长出高质量、可用于构建生物传感器的三维氮掺杂石 墨烯（3DNG）。此外，如何利用已有的石墨烯来高效地吸附葡萄糖氧化酶，能 与酶发生高效的直接电子传递并且保持其本身的生物活性，也是需要解决的一大 难题。 结合上述考虑，本实验将从两个方面来进行。第一，利用各个气体流量的最 适宜参数，制备出高质量的三维氮掺杂石墨烯；第二，利用壳聚糖（CS）增强氮 掺杂石墨烯与酶的相互作用，用于高效吸附GOx并构建生物传感器，最后将其制 备成电极并检测电极性能。 2.3 镍泡沫上CVD法制备三维氮掺杂石墨烯 本实验以镍泡沫为基底，用CVD法制备出高质量的三维氮掺杂石墨烯，并借 助Raman和XPS对其进行了表征。 12 2.3.1 实验过程实验过程 2.3.1.1 CVD生长过程生长过程 （1）将镍泡沫剪成 1 cm 1 cm 的小片（如图 2.1a 所示） （2）将剪好的镍泡沫至于石英舟中间部分，小心推入 CVD 炉内（如图 2.2 所示） ； （3）在气体流量控制阀上设置好相应的气体流量参数后，升温开始生长（具体 过程见图 2.3）： 升温过程（30 分钟）：室温1000 ，Ar 500 sccm；H2 200 sccm； 退火过程（5 分钟）：1000 ，Ar 500 sccm；H2 200 sccm； 生长过程（5 分钟）：1000 ，Ar 500 sccm；CH4 10 sccm；NH3 14 sccm； 降温过程（大约 30 分钟）：1000 室温，Ar 500 sccm。 （以上为最佳生长参数，寻找该参数的实验过程此处略去） （4）等待仪器自动降温至室温，关闭气阀，取出样品并关闭仪器电源（生长好 的镍泡沫如图 2.1b 所示）。 图 2.1 未生长镍泡沫、生长完毕未转移和转移之后的 3DNG。 13 图 2.2 本论文所用的气相沉积系统。 图 2.3 3DNG CVD 生长参数及过程示意图。 2.3.1.2 三维氮掺杂石墨烯的转移三维氮掺杂石墨烯的转移 由于 CVD 生长过程主要是碳原子沉积在基底表面，因此石墨烯与基底之间 存在一定的相互作用，而这种相互作用会影响对石墨烯性能的表征。一般采取的 方法是将石墨烯转移到不会产生影响的特定基底上。在本实验中，我们采取了常 规的衬底腐蚀法。将聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）以 2000 rpm 的转速均匀涂抹在 生长好的三维石墨烯表面，在 180 下烘烤至干燥；之后再用 1 M 的 FeCl3溶液 刻蚀一昼夜，刻蚀完毕后，用超纯水浸泡，之后用丙酮除去 PMMA。将洗净的 3DNG 转移到干净的硅片上，就可以进行 Raman 和 XPS 表征（转移后的石墨烯 如图 2.1c 所示）。 2.3.2 Raman 表征表征 我们对生长转移之后的 3DNG 进行了 Raman 表征（如图 2.4 所示）。其中， 象征石墨烯的 G 峰和 2D 峰分别位于 1581.34 cm1 和 2702.47 cm1处。此外，位 于 1353 cm1的明显的 D 峰为引入氮原子之后石墨烯产生的缺陷峰。其中，ID/IG = 0.19:1，暗示了掺杂对石墨烯晶格结构的破坏程度较小24。通过与未掺杂石墨 烯的对比可以明显突出掺杂的影响。 14 图 2.4 3DG 及 3DNG 的 Raman 光谱图。 2.3.3 XPS 表征表征 我们对生长转移之后的 3DNG 进行了 XPS 表征（如图 2.5 所示）。图 2.5a 为 N 峰，它可以被分为三个独立的特征峰：398.9 eV 处为吡啶型氮（N1）， 400.1 eV 处为吡咯型氮（N2），401.5 eV 处为季氮（N3）。这三种类型的氮说明 了氮原子在石墨烯晶格中处于三种不同的化学环境（具体结构可以参考图 1.8）。 图 2.5b 为 C 峰，其中位于 284.8 eV 的是基本的 sp2 CC（C1）作用。而 285.2 eV 和 286.2 eV 分别为 Nsp2 C（C2）和 Nsp3 C（C3），这两个峰都来源于氮的掺 杂作用。三维氮掺杂石墨烯的各个元素含量如表 2.1 所示。相比与不加氮源的非 掺杂石墨烯而言，氮元素的含量大为提高。 表 2.1 C、N、O 三种元素在三维氮掺杂石墨烯中的含量 SampleC1s (%)N1s (%)O1s (%) 3DG86.890.8012.31 3DNG84.655.699.66 15 图 2.4 3DNG 的 XPS 谱图。 2.4 三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖/GOx 生物传感器制备 我们将已经生长好的 3DNG 与 CS 结合，制备出具有更好生物相容性的复合 物材料；再将该材料用于高效吸附 GOx，从而得到可以用于制备葡萄糖生物传感 器的 3DNG/CS/GOx 复合物。 2.4.1 三维氮掺杂石墨烯三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合物制备壳聚糖复合物制备 利用超声手段，可以方便地将 CS 附着在 3DNG 表面。 (1) 配制 0.5 % wt 的 CS 溶液（0.25 g 壳聚糖溶于 2 %冰醋酸溶液中，搅拌）； (2) 将 3DNG 浸入 CS 溶液中，超声 2 h； (3) 将 3DNG 从 CS 溶液中转移出来，用超纯水清洗除去表面的残留醋酸；自然 晾干。 2.4.2 GOx 在复合物表面的吸附在复合物表面的吸附 由于 CS 的存在，GOx 可以更加轻易地吸附在复合物表面。将 3DNG/CS 复 合物浸泡在 10 mg/mL 的 GOx（Sigma-Aldrich，USA）0.01 M PBS 溶液中 24 h， 取出晾干，即可备用。 2.4.3 生物传感电极制备生物传感电极制备 我们将复合物制备成生物传感电极，以便能够进一步研究其性能。 16 (1) 将复合物载在洗净的 PET 膜上，用打好一定孔径小孔的绝缘胶布覆盖在其表 面（下面留出一段以便连接导线）； (2) 将一段导线一头涂上导电银胶，连接在复合物下端，待银胶自然晾干； (3) 用环氧树脂 AB 胶完全覆盖复合物下端，晾干备用。 图 2.6 为制备好的复合物电极示意图。制备好的生物电极无需预处理，即可 使用。 图 2.6 复合物电极示意图。 17 第三章 三维氮掺杂石墨烯葡萄糖生物传感器性质研究 3.1 复合物的 SEM 表征 作为一种方便的微观结构表征方法，SEM 可以直观地表征复合物的表面形貌。 3DNG 和 3DNG 复合物的 SEM 像如图 3.1 所示。其中，图 3.1a 是 3DNG 的 SEM 图像，可以清晰地看出它具有三维孔状结构。3.1b 是 3DNG 的光滑表面的 高分辨 SEM 图像。而当在 CS 溶液中超声 2 h 之后，石墨烯表面发生了明显变化。 三维骨架明显变粗糙，在高分辨率下石墨烯表面也可以看出有一层膜附着 （图 3.1c 和图 3.1d）。图 3.1e 和图 3.1f 展示了 3DNG/CS/GOx 复合物的具体形貌。 复合物表面明显有许多类似酶的小颗粒附着。从直观上看，石墨烯的三维结构给 予了 GOx 巨大的吸附面积。 图 3.1 石墨烯及其复合物的 SEM 图像。（a、b）3DNG 及其表面形貌； （c、d）3DNG/CS 复合物及其表面形貌；（e、f）3DNG/CS/GOx 复合 物及其表面形貌。 18 3.2 三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖/GOx 复合物表面 GOx 的直接电子传递 3.2.1 GOx 直接电子传递机理直接电子传递机理 GOx 结构本质上是一个同型二聚体（homodimer），分子内部含有两分子的 FAD。在外加一定的电压下，它们会与溶液中 H+反应生成 FADH2，从而发生 GOx 本身可逆的化学反应。在我们的电极体系中，石墨烯将电子传递给表面上的 GOx 分子，GOx 分子内的 FAD 便会与 H+发生上述反应，从而形成 GOx 与电极 的直接电子传递过程。该过程可以用下面的方程式来表示： GOx (FAD) + 2e- + 2H+ GOx (FADH2) (3.1) 3.2.2 复合物表面复合物表面 GOx 直接电子传递情况直接电子传递情况 我们利用循环伏安法（CV）在0.8 V 0.2 V 之间研究了复合物传感器表面 的直接电子传递情况。所用溶液为 0.1 M pH 值为 7.40 的磷酸盐缓冲液（PBS）。 在图 3.2 中，黑色曲线和绿色曲线分别代表了裸 3DNG 电极和 3DNG/CS 电极 的 CV 情况。作为葡萄糖生物电极的背景信号，很明显上面没有氧化还原峰出现。 然而，当三维氮掺杂石墨烯直接吸附 GOx（蓝色曲线）时，电极出现了一对近乎 可逆的氧化还原峰，这证明了 3DNG 与 GOx 之间已经可以发生直接电子传递了。 但是同时我们也注意到，其峰电流较为微弱。我们认为的原因是，CVD 生长的石 墨烯并没有像化学合成的氧化石墨烯（GO）和还原氧化石墨烯（rGO）那样具有 极好的与蛋白质之间的直接电化学行为，它与 GOx 之间的吸附比较微弱。但是， 引入壳聚糖后，3DNG/CS/GOx 复合物表现出了极好的一对可逆氧化还原峰（红 色曲线），其表观电位为0.478 V，与 FAD/FADH2的标准电位十分接近35。这 说明：（1）CS 的确在吸附 GOx 方面起到了积极作用；（2）3DNG 与 GOx 之 间具有极好的直接电子传递作用。 19 图 3.2 不同电极材料的循环伏安（CV）曲线：（1）裸 3DNG 电极； （2）3DNG/CS 复合物；（3）3DNG/GOx 复合物；（4）3D NG/CS/GOx 复合物。实验条件为 N2饱和的 pH = 7.40 的 0.1 M PBS 缓冲 液，扫描速度为 0.1 Vs1。 3.2.3 氮掺杂与未掺杂情况对比氮掺杂与未掺杂情况对比 为了研究氮掺杂之后对 GOx 直接电化学的影响，我们在同样参数下在生长 过程中不通入氮源，生长出了非氮掺杂的三维石墨烯，经过相同处理后制备出了 3DG/CS/GOx 复合物，并利用循环伏安法（CV）在0.8 V 0.2 V 之间研究了 两种材料的直接电子传递情况。通过图 3.3 中黑色曲线和红色曲线的对比可知， 氮掺杂之后，氧化还原峰电流增强了近 5 倍。响应电流的增强很可能会带来响应 灵敏度等传感能力的改善。这个现象的原因是由于氮的引入使石墨烯费米能级改 变，从而提高了其电子传递效率6；也可能是氮带来的潜在氢键作用增强了石墨 烯与壳聚糖之间的结合，使 GOx 的吸附效果更好。总之，氮掺杂可以显著改善 GOx 与石墨烯之间的直接电子传递作用。 20 图 3.3 不同电极材料的循环伏安（CV）曲线：（a）3DG/CS/GOx 复合 物；（b）3DNG/CS/GOx 复合物。实验条件为 N2饱和的 pH = 7.40 的 0.1 M PBS 缓冲液，扫描速度为 0.1 Vs1。 酶表面覆盖浓度（）是指材料单位面积上覆盖酶量的多少，该物理量可以 一定程度上描述材料对酶的吸附能力优劣。它可以用公式计算得出： = Q/nFA。 其中，Q 是酶促反应所需的电荷量，n 是反应转移的电子数目，F 为法拉第常数， A 为材料的反应面积。通过计算，我们得出复合物表面的 值为 3.10 109 molcm2。相比已有的电极材料，我们的复合物具有较高的酶表面覆盖浓度（具 体对比见图 4.1）。壳聚糖对 GOx 良好的结合能力，以及氮掺杂石墨烯三维孔结 构大的比表面积（300 m2g1）都是导致高表面覆盖浓度的原因。 3.2.4 不同扫描速度下的电子传递情况不同扫描速度下的电子传递情况 为了证明复合物表面发生的氧化还原反应确实是一个酶的表面控制过程，我 们也研究了扫描速率对电极反应的影响。在 20 mVs1到 300 mVs1之间，我们 用不同的扫描速率对电极进行了 CV 测试，结果如图 3.4 所示。从图中可以看出， 阳极峰电流 Ipa和阴极峰电流 Ipc都随着扫描速率的增大而线性增大。其中，线性 方程分别为：Ipa = 255.804v + 4.835 (R2 = 0.9965)；Ipc = 245.306v 17.283 (R2 = 0.9920)。良好的线性关系说明了电极表面发生的的确是一个表面控制过程。 21 图 3.4 （a）不同扫描速率下 3DNG/CS/GOx 复合物的 CV 曲线。扫描速 率为 20 mVs1，50 mVs1，100 mVs1，150 mVs1，200 mVs1，250 mVs1和 300 mVs1；（b）阳极峰电流 Ipa和阴极峰电流 Ipc与扫描速率 之间的线性关系图线。实验条件为 N2饱和的 pH = 7.40 的 0.1 M PBS 缓冲 液，扫描速度为 0.1 Vs1。 3.3 壳聚糖作用的机理探讨 由之前的实验可知，CS 在结合 GOx 方面起到了不可忽视的作用。因此，我 们也对其作用机理进行了探讨研究。CS 是一种常见的来源于几丁质的天然高分 子，由于其具有良好的生物相容性和成膜性，在许多研究工作中常利用其优点制 22 备高活性的生物材料。因此，我们选择它来提高 3DNG 与 GOx 的结合能力。它 的主要结构如下： 由分子结构式可知，该分子的两侧有许多氨基（NH2）。因此我们推测，这 些氨基会在 pH = 7.40 的 PBS 溶液中带上正电性；而 GOx 的等电点为 4.2，在 PBS 中会显负电性，从而与 CS 上的氨基产生一定的静电作用，起到吸附的效果。 为了验证这一推断，我们引入了两种高分子化合物：聚丙烯酸（PAA）和聚乙烯 亚胺（PEI），将它们进行与壳聚糖同样的处理制成复合物电极，从而研究是否 是静电作用吸附。 3.3.1 PAA 体系的电子传递情况对比体系的电子传递情况对比 PAA，全名为聚丙烯酸，其分子结构如下： PAA 所含有的COOH 在 PBS 中会显负电性，因此理论上并不会与带负电 的 GOx 产生电荷吸附。我们利用 CV 研究了 PAA 复合物表面的 GOx 直接电子传 递情况（如图 3.5 所示），可以明显看到，PAA 复合物的 FAD/FADH2氧化还原 峰电流情况与 3DNG/GOx 复合物相仿，与壳聚糖复合物差别很大。因此我们可 以认为，PAA 并未改善 3DNG 与 GOx 之间的吸附作用。 23 图 3.5 PAA 体系与不同电极材料的循环伏安（CV）曲线对比。实验条件 为 N2饱和的 pH = 7.40 的 0.1 M PBS 缓冲液，扫描速度为 0.1 Vs1。 3.3.2 PEI 体系的电子传递情况对比体系的电子传递情况对比 PEI，全名为聚乙烯亚胺，其分子结构如下： PEI 所含有的NH2在 PBS 中会显正电性，因此理论上会产生与 CS 类似的静 电吸附作用。我们利用 CV 研究了 PEI 复合物表面的 GOx 直接电子传递情况（如 图 3.6 所示），可以明显看到，PEI 复合物的 FAD/FADH2氧化还原峰电流情况与 壳聚糖复合物相仿，都有较明显的直接电子传递情况。因此我们可以认为，PEI 也产生了类似的吸附作用。由以上实验可知得出结论：氨基的存在的确是固定 GOx 的一大原因。这也说明用于固定酶的材料具有可选择性。 24 图 3.6 PEI 体系与不同电极材料的循环伏安（CV）曲线对比。实验条件为 N2饱和的 pH = 7.40 的 0.1 M PBS 缓冲液，扫描速度为 0.1 Vs1。 由 PAA、PEI 与 CS 复合物的 CV 情况对比也可以看出，无论是在氧化还原 峰电流大小，FAD/FADH2电位还是电子传递速率方面，CS 复合物都是表现最好 的。因此，CS 是以一种合适的用于结合 3DNG 和 GOx 的高分子材料。此外我 们也可以推测，如果能够选择合适的材料来增强 3DNG 对特定酶的结合能力， 我们就可以将 3DNG 拓展到更多的酶生物传感器体系中，从而拓宽其应用范围。 3.4 三维氮掺杂石墨烯/壳聚糖/GOx 复合物电极对葡萄糖的生物传感 3.4.1 电极对葡萄糖的生物传感机理电极对葡萄糖的生物传感机理 GOx 对 D-型葡萄糖（-D-G）具有特异性。反应时，葡萄糖通过 GOx 催化 作用生成葡萄糖酸内酯，FAD 变成还原型 FAD，葡萄糖酸内酯进一步水解为葡 萄糖酸。还原型 FAD 与空气中的氧气反应形成 H2O2。该过程可以用下面的方程 式来表示： GOx (FAD) + 葡萄糖 GOx (FADH2) + 葡萄糖酸内酯 (3.2) GOx (FADH2) + O2 GOx (FAD) + H2O2 (3.3) 25 3.4.2 电极对不同葡萄糖浓度的响应电极对不同葡萄糖浓度的响应 由 GOx 的机理反应式可知，催化反应的葡萄糖量与消耗的氧量成正比例关 系，因此在氧饱和的情况下，我们可以通过观测消耗的氧量来间接测定 GOx 对 葡萄糖的催化量。氧气的消耗可以直接表现为负电位还原峰电流的减小。为了研 究 3DNG/CS/GOx 复合物电极对葡萄糖的响应程度，我们在不同葡萄糖浓度下利 用 CV 测定了负电位的氧化还原峰电流情况（如图 3.7 所示）： 图 3.7 3DNG/CS/GOx 复合物在不同葡萄糖浓度下的 CV 曲线。a 到 i 的 葡萄糖浓度依次为：0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM, 0.7 mM, 0.9 mM, 1.1 mM, 1.3 mM, 1.5 mM 和 1.7 mM。实验条件为 O2饱和的 pH = 7.40 的 0.1 M PBS 缓冲液，扫描速度为 0.1 Vs1。 由图 3.7 可以看出，随着葡萄糖浓度的增加，还原峰基线