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文档简介
金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 一、生物学特性菌体形态及培养特征 革兰氏阳性球菌,直径为0.5-1.0微米,镜检时呈单个、成 对、四联或不规则的簇群,如葡萄状,故称为葡萄球菌。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 大多数菌株产生类胡罗卜素,使细胞团呈现出深橙色 到浅黄色,色素的产生取决于生长的条件,故称金黄 色葡萄球菌。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 大多数菌株最适生长温度30-37,最适pH为7.0-7.5; 兼性厌氧菌,在好氧条件下生长最好; 可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。 一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5% 氯化钠肉汤增菌。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 所有的毒株产生血浆凝固酶,人和动物来源的菌 株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。 金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和 溶菌酶等,大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放 脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 生物学特性 致 病 性 金黄色葡萄球菌为条件致病菌,菌株致病力的强弱主 要取决于其产生的毒素和侵袭性酶: a.溶血素:外毒素,能损伤血小板,破坏溶酶体,引起肌 体局部缺血和坏死;在血平板培养出现溶血环。 b.杀白细胞素:可破坏人的白细胞和巨噬细胞; c.血浆凝固酶:当金黄色葡萄球菌侵入人体时,该酶使血 液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固,阻碍吞噬 细胞的吞噬作用。 d.脱氧核糖核酸酶(DNA酶) e.肠毒素:引起急性胃肠炎。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌 ,临床表现多种多样,可引起局部化脓感染,也可引起 肺炎、心包炎等,甚至败血症、脓毒症等全身感染。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 葡萄球菌皮肤感染 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾 病,可引发不同程度的急性胃肠炎症状,恶心、呕吐最 为突出而且普遍,腹痛、腹泻次之。 当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品 ,如牛奶和奶制品、肉、蛋等,在温度条件适宜时,经8 -10小时即可相当数量的肠毒素。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 二、检验程序与操作方法 根据中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准: 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB 4789.10-94 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分)检样 25g(ml)+225ml灭菌生理盐水 国标:金黄色葡 萄球菌检验程序 直接计数方法增菌培养方法 Baird-parker(贝尔德- 帕克) 0.3ml、0.3ml、0.4ml 75氯化钠肉汤或 胰酪胨大豆肉汤 血平板 血平板 ,Baird-parker 涂片染色 观察溶血 血浆凝固酶试验 报 告 36 1 24hr 36 1 24hr 36 1 24hr 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 检验程序 增菌培养 利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性(可耐受15%的 氯化钠),用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤或7.5% 氯化钠肉汤增菌。 置37摄氏度培养箱培养24小时。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 检验程序 分离培养 血平板:金黄色葡萄球菌可以产生溶血素,因此在血 平板上产生明显的溶血环。 典型菌落:呈金黄色,有时也为白色,大而突起,圆 形,不透明,表面光滑,有溶血环。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 大而突起,圆形,不透明, 表面光滑,有溶血环 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 血平板制作 成分:豆粉琼脂(或营养琼脂)100mL,脱纤维 羊血(或兔血)5-10mL。 制法:加热融化琼脂,冷至50,以无菌操作加 入脱纤维羊血或兔血,摇匀,倾注平板。或分装 灭菌试管,摆成斜面。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) BP(贝尔德- 帕克)平板: 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素 和矿物元素 丙酮酸钠是一种生长促进剂 亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有 毒性,并使菌落产生黑色 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制 作用。 检验程序分离培养 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 在BP平板上典型菌落为:灰色到黑玉色,圆形,光 滑突起,湿润,直径2-3mm,边缘常为淡色(米黄色或 灰色),周围为一混浊带,在其外缘常有一透明圈。用 接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。 长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落,其黑 色常较典型菌落淡些,且外观可能粗燥,质地较干燥。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) B-P平板 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 革兰氏阳性,球形,组成葡萄状 检验程序 鉴定之革兰氏染色镜检 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 检验程序 鉴定之凝固酶试验 金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶,因此对其鉴别 的主要试验是测定其凝固酶。 方法一:试管法 吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL,放入小试管中,再加入培 养24h的金黄色葡萄球肉浸液肉汤培养物0.5mL,振荡摇 匀,放361恒温箱或水浴内,每半小时观察一次,观察 6h,如呈现凝固,即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块者, 被认为阳性结果。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 试管法 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 阳性反应 阴性反应 不凝固 少量、 零散凝 固 明显的块 状凝固 巨大块 凝固 完全凝固, 倒置不流动 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 有凝块 血浆 均匀混浊 生理盐水 方法二:玻片法 在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水,用接种环取 待检培养物与其混合(设阳性和阴性对照)制成菌悬液 ,若经1020s内无自凝现象发生,则加入人或兔新鲜血 浆1环(不用稀释),与菌悬液混合,观察结果 。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 兔血浆制备 成分:柠檬酸钠0.106 mol/L (31.3g Na3C6H5O72H2O溶于1L蒸馏水中) 制法:一份加兔血9份混合后离心2000rpm, 10min吸取上清液即为兔血浆。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 葡萄糖肉浸液肉汤的制备 成分:绞碎牛肉500g,氯化钠5g,蛋白胨10g,磷酸氢二 钾2g,葡萄糖10g,蒸馏水1000mL,pH7.47.6。 制法:将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g,与蒸馏水混合后 放冰箱24h,除去液面之浮油,隔水煮沸半小时,使肉渣 完全凝结成块,用绒布过滤,并挤压收集全部滤液,加水 补足原量。加入蛋白胨、葡萄糖,氯化钠和磷酸盐,溶解 后校正pH,煮沸并过滤、分装,12130min高压灭菌。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 25g样品+ 225ml 生理盐水 5mL样品匀液(1:10)+ 50mL胰酪胨大豆肉汤 血平板 36 1 24hr 镜 检 与 肉浸液肉汤培养 血浆凝固酶 试验 报告结果 定性定性 检测检测 36 1 24hr 36 1 24hr 36 1 6hr BP平板 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 25g样品+ 225ml 生理盐水 选三个连续梯度,每个梯度分别取1mL接种之至表面 干燥的BP平板(如0.4mL,0.3mL,0.3mL) 平板计数(分别记录每种 类型的菌落数) 36 1 48hr 血平板、镜 检与 肉浸液肉汤培养 血浆凝固酶试验 报告结果 金葡菌数 /g(mL) 定量定量 检测检测 (平板法)(平板法) 每种类型选取一个菌落 36 1 24hr 36 1 6hr 适用于检测金黄色葡萄球菌 数不小于10/g(mL)的食品 计算办法:(三个平板中疑 似金黄色葡萄球菌黑色菌落 数相加)血浆凝固酶阳性 数5 稀释倍数 梯度稀释 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术(微生物部分) 第一天 器材准备、样品处理、增菌培养和BP平板分离接种 上午:准备的器材第一天下午 规格名称数量1、样品处理:鱼干、 腊肉 2、增菌培养 3、BP平板制备及分 离接种 4、采集兔血的准备: 抗凝剂制备、灭过菌 的容器和玻璃珠 250ml三角瓶 1个 10100mm试管 6支 1ml移液管2支 10ml移液管2支 直径为90mm平皿8套 2
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