微生物金黄色葡萄球菌课件

金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 一、生物学特性菌体形态及培养特征 革兰氏阳性球菌，直径为0.5-1.0微米，镜检时呈单个、成 对、四联或不规则的簇群，如葡萄状，故称为葡萄球菌。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色 到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄 色葡萄球菌。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 大多数菌株最适生长温度30-37，最适pH为7.0-7.5； 兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好； 可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。 一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5% 氯化钠肉汤增菌。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 所有的毒株产生血浆凝固酶，人和动物来源的菌 株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。 金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和 溶菌酶等，大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放 脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 生物学特性 致 病 性 金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主 要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌 体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。 b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血 液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬 细胞的吞噬作用。 d.脱氧核糖核酸酶（DNA酶） e.肠毒素：引起急性胃肠炎。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌 ，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起 肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 葡萄球菌皮肤感染 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾 病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最 为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。 当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品 ，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8 -10小时即可相当数量的肠毒素。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 二、检验程序与操作方法 根据中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准： 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB 4789.10-94 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）检样 25g(ml)+225ml灭菌生理盐水 国标：金黄色葡 萄球菌检验程序 直接计数方法增菌培养方法 Baird-parker（贝尔德- 帕克） 0.3ml、0.3ml、0.4ml 75氯化钠肉汤或 胰酪胨大豆肉汤 血平板 血平板 ，Baird-parker 涂片染色 观察溶血 血浆凝固酶试验 报 告 36 1 24hr 36 1 24hr 36 1 24hr 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 检验程序 增菌培养 利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的 氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤或7.5% 氯化钠肉汤增菌。 置37摄氏度培养箱培养24小时。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 检验程序 分离培养 血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血 平板上产生明显的溶血环。 典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆 形，不透明，表面光滑，有溶血环。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 大而突起，圆形，不透明， 表面光滑，有溶血环 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 血平板制作 成分：豆粉琼脂（或营养琼脂）100mL，脱纤维 羊血（或兔血）5-10mL。 制法：加热融化琼脂，冷至50，以无菌操作加 入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装 灭菌试管，摆成斜面。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） BP（贝尔德- 帕克）平板： 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素 和矿物元素 丙酮酸钠是一种生长促进剂 亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有 毒性，并使菌落产生黑色 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制 作用。 检验程序分离培养 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 在BP平板上典型菌落为：灰色到黑玉色，圆形，光 滑突起，湿润，直径2-3mm，边缘常为淡色（米黄色或 灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用 接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。 长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑 色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） B-P平板 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 革兰氏阳性，球形，组成葡萄状 检验程序 鉴定之革兰氏染色镜检 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 检验程序 鉴定之凝固酶试验 金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶，因此对其鉴别 的主要试验是测定其凝固酶。 方法一：试管法 吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培 养24h的金黄色葡萄球肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇 匀，放361恒温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察 6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者， 被认为阳性结果。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 试管法 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 阳性反应 阴性反应 不凝固 少量、 零散凝 固 明显的块 状凝固 巨大块 凝固 完全凝固， 倒置不流动 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 有凝块 血浆 均匀混浊 生理盐水 方法二：玻片法 在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取 待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液 ，若经1020s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血 浆1环（不用稀释），与菌悬液混合，观察结果 。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 兔血浆制备 成分：柠檬酸钠0.106 mol/L （31.3g Na3C6H5O72H2O溶于1L蒸馏水中） 制法：一份加兔血9份混合后离心2000rpm， 10min吸取上清液即为兔血浆。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 葡萄糖肉浸液肉汤的制备 成分：绞碎牛肉500g，氯化钠5g，蛋白胨10g，磷酸氢二 钾2g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH7.47.6。 制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g，与蒸馏水混合后 放冰箱24h，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣 完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水 补足原量。加入蛋白胨、葡萄糖，氯化钠和磷酸盐，溶解 后校正pH，煮沸并过滤、分装，12130min高压灭菌。 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 25g样品+ 225ml 生理盐水 5mL样品匀液（1:10）+ 50mL胰酪胨大豆肉汤 血平板 36 1 24hr 镜 检 与 肉浸液肉汤培养 血浆凝固酶 试验 报告结果 定性定性 检测检测 36 1 24hr 36 1 24hr 36 1 6hr BP平板 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 25g样品+ 225ml 生理盐水 选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面 干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL） 平板计数（分别记录每种 类型的菌落数） 36 1 48hr 血平板、镜 检与 肉浸液肉汤培养 血浆凝固酶试验 报告结果 金葡菌数 /g(mL) 定量定量 检测检测 （平板法）（平板法） 每种类型选取一个菌落 36 1 24hr 36 1 6hr 适用于检测金黄色葡萄球菌 数不小于10/g（mL）的食品 计算办法：（三个平板中疑 似金黄色葡萄球菌黑色菌落 数相加）血浆凝固酶阳性 数5 稀释倍数 梯度稀释 金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分） 第一天 器材准备、样品处理、增菌培养和BP平板分离接种 上午：准备的器材第一天下午 规格名称数量1、样品处理：鱼干、 腊肉 2、增菌培养 3、BP平板制备及分 离接种 4、采集兔血的准备： 抗凝剂制备、灭过菌 的容器和玻璃珠 250ml三角瓶 1个 10100mm试管 6支 1ml移液管2支 10ml移液管2支 直径为90mm平皿8套 2