基因重组与基因工程

第十七章第十七章 重组重组DNADNA技术技术 Genetic Engineering 基因决定性状（一基因决定性状（一） 青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素青霉素 返返 回回 基因决定性状（二）基因决定性状（二） vv家蚕能够吐出蚕丝为人类利用家蚕能够吐出蚕丝为人类利用 定向基因改造设想定向基因改造设想 设想设想 一一 能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮 ？ 能否让细菌能否让细菌“ “吐出吐出” ”蚕丝？蚕丝？ 设想设想 二二 能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等 珍贵的药物？珍贵的药物？ 设想设想 三三 经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于2020世纪世纪7070年代创立了可年代创立了可 以定向改造生物的新技术以定向改造生物的新技术重组重组DNADNA技术技术 DNA重组 DNA重组即基因重组，是将不同来源的 DNA分子通过磷酸二酯键连接而形成新的 DNA分子的过程。 DNA克隆 DNA分子通过体外无性增殖获得的大量拷 贝 重组重组DNADNA技术：技术：在体外对在体外对DNADNA分子按照人工分子按照人工“ “剪切剪切” ” 和和“ “拼接拼接” ”，将重组分子导入受体细胞进行无性繁殖，获，将重组分子导入受体细胞进行无性繁殖，获 得大量得大量DNADNA分子复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的分子复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的 过程，又称基因工程、分子克隆。过程，又称基因工程、分子克隆。 DNADNA重重组组技技术别术别 名名分子克隆或基因工程分子克隆或基因工程 操作操作环环境境生物体外生物体外 操作操作对对象象基基 因因 操作水平操作水平DNADNA分子水平分子水平 基本基本过过程程剪切剪切拼接拼接导导入入表达表达 结结果果人人类类需要的基因需要的基因产产物物 其它工具酶其它工具酶 一一、 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 1.1.分布：分布：主要由细菌产生主要由细菌产生 2.2.特点：特点：特异性，即识别特定核苷酸序特异性，即识别特定核苷酸序 列，切割特定切点列，切割特定切点 3.3.结果：结果：产生具黏性未端（碱基互补配产生具黏性未端（碱基互补配 对）、平端的对）、平端的DNADNA片段片段 限制酶的分类限制酶的分类 1. 1. I I型型：具有限制和：具有限制和DNADNA修饰作用，在识别位点约修饰作用，在识别位点约 10001000bpbp处切割处切割DNADNA，位点不确定，位点不确定 2. 2. IIII型型：基因工程中的常用限制酶，能在：基因工程中的常用限制酶，能在DNADNA分子内部分子内部 的特异位点识别和切割双链的特异位点识别和切割双链DNADNA，切割位点的序列可切割位点的序列可 知、固定知、固定 3. 3. IIIIII型型：具有限制和修饰活性，能在识别位点附近切：具有限制和修饰活性，能在识别位点附近切 割割DNADNA，切割位点不确定切割位点不确定 限制酶的识别和切割位点限制酶的识别和切割位点 1 1）识别）识别-8-8bpbp 2 2）对称性）对称性回文序列回文序列 EcoR IEcoR I 末端种类末端种类 ） - -粘性末端粘性末端 Pst Pst I I ）- -粘性末端粘性末端 EcoEcoRIRI ） 平端平端 SmaSmaI I 限制酶的应用限制酶的应用 1. 1. DNADNA重组重组 2. 2. 限制酶（物理）图谱绘制限制酶（物理）图谱绘制 3. 3. 突变分析（突变分析（RFLPRFLP分析）、同源性分析分析）、同源性分析 4. 4. DNADNA测序测序 二、载二、载 体体 概念概念 能在连接酶作用下和外源能在连接酶作用下和外源DNADNA片段片段 连接连接, , 实现外源实现外源DNADNA的无性繁殖或表达有意义的无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的的蛋白质所采用的DNADNA分子分子。 类型类型 质粒质粒 噬菌体噬菌体 病毒病毒 载体分类载体分类 克隆载体克隆载体 用于克隆和扩增目的基因的载体用于克隆和扩增目的基因的载体 基本特点基本特点: : 1 1、复制起点、复制起点 2 2、克隆位点（多克隆位点），供外源、克隆位点（多克隆位点），供外源DNADNA插入插入 3 3、选择标记基因，以指示载体或重组、选择标记基因，以指示载体或重组DNADNA分子分子 是否进入宿主细胞是否进入宿主细胞 4 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数、具有较小的分子量和较高的拷贝数 5 5、易导入受体细胞、易导入受体细胞 注：前三个特点必不可少注：前三个特点必不可少 表达载体表达载体 用于表达外源基因，合成目的蛋白的载体 除具有克隆载体基本原件外，还应具备表达元件 原核：启动子核糖体结合位点转录终止信号 真核：增强子启动子终止信号oly信号 质粒载体质粒载体 ( (一一) )质粒质粒 质粒的特点质粒的特点 举例举例 质粒质粒 概念概念 游离于细菌染色体外，能自主复制的闭环双链游离于细菌染色体外，能自主复制的闭环双链DNADNA 特点：特点： 1 1、分子量较小，为、分子量较小，为4361bp4361bp，可容纳的外源，可容纳的外源DNADNA较较 大大 2 2、一个复制起点，具氨苄青霉素抗性（、一个复制起点，具氨苄青霉素抗性（ampR)ampR)和和 四环素抗性基因四环素抗性基因(tetR)(tetR) 3 3、克隆位点位于氨苄青霉素抗性（、克隆位点位于氨苄青霉素抗性（ampR)ampR)或四环或四环 素抗性基因素抗性基因(tetR)(tetR)内，插入外源基因后可导致内，插入外源基因后可导致 相应基因失活相应基因失活 pBR322pBR322载体载体 载体载体pBR322pBR322的结构图的结构图 pUCpUC系列系列 （1 1）来自）来自pBR322pBR322，分子量为，分子量为2.7KB2.7KB，含复制起点，含复制起点 （2 2）含氨苄青霉素抗性基因，且无克隆位点）含氨苄青霉素抗性基因，且无克隆位点 （3 3）含标记基因）含标记基因LacZLacZ，编码，编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端端146146个个 氨基酸氨基酸 （4 4）多克隆位点位于）多克隆位点位于LacZLacZ内内 pUC18pUC18和和pUC19pUC19载体载体 第二节第二节 重组重组DNADNA技术的基本原理技术的基本原理 基本操作基本操作 获取获取- -切割切割- -连接连接- -转化转化- -筛选筛选 一一 获取目的基因获取目的基因 制备制备 基因组基因组DNADNA 基因组文库基因组文库 制备制备cDNAcDNA cDNAcDNA文库文库 聚合酶链聚合酶链 反应（反应（PCRPCR） 合成合成 DNADNA模板模板 引物引物 dNTPdNTP Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 人工合成人工合成 二二 目的基因和载体连接目的基因和载体连接 1.1.平端连接平端连接 T4 T4 连接酶连接酶 2.2.互补黏端连接互补黏端连接 3. 3. 加同聚物尾连接加同聚物尾连接 4. 4. 加人工接头连接加人工接头连接 重组重组DNADNA导入宿主细胞的过程称转化导入宿主细胞的过程称转化 细胞类型：细胞类型： 原核细胞原核细胞 大肠杆菌大肠杆菌 链球菌链球菌 枯草杆菌枯草杆菌 真核细胞真核细胞 酵母酵母 昆虫细胞昆虫细胞 哺乳动物细胞哺乳动物细胞 三三 重组重组DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞 1.1.平板筛平板筛 选选 插入失活插入失活 四四 筛选和鉴定重组筛选和鉴定重组DNADNA 2. 2. 酶切鉴定酶切鉴定 3.PCR3.PCR分析分析 4. 4. 核酸分子杂交分析核酸分子杂交分析 美国生物制药产品种类及数量美国生物制药产品种类及数量（ PHRAMPHRAM） q疾病种类 产品数量 疾病种类 产品数量 q感染性疾病 39 心脏病 26 q神经系统疾病 28 呼吸系统疾病 22 q艾滋病及相关疾病 19 自主免疫系统疾病 19 q皮肤病 19 移植 13 q消化系统疾病 11 遗传疾病 11 q血液疾病 9 糖尿病及并发症 7 q不育症 5 眼病 3 q生长发育不良症 3 骨质疏松 2 q妊娠预防 2 肿瘤疾病 175 175 生物技术与传统中药生物技术与传统中药 q中药现代化核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论 q现代中药理论的建立确立中药与基因表达的关系 中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找 中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分 中药临床药效的科学评价与分析方法