酶工程 第十节 酶与现代生命科学ppt课件

第十一讲 酶与现代生命科学 20世纪以来，现代生物科学发展已经日益深入到分 子水平，日益深入到以生物大分子结构与功能关系来说 明生命现象的本质和规律，现代生命科学的前沿课题如 生物信息学、基因组学、结构生物学等无一能离开酶。 一、酶是分子生物学研究的重要工具 二、酶是生命科学研究的重要对象 一、酶是分子生物学研究的重要工具 酶是分子生物学研究的重要工具。特别是限制性 核酸内切酶的发现提供了特异剪切DNA的工具,促进了 DNA重组技术诞生,推动了基因工程发展,成为分子生物 学研究的不可缺少的工具. Hind 的识别序列和切割位点 5 - GTPy PU AC - 3 3 - CAPU Py TG - 5 限制性内切酶在基因工程中的应用限制性内切酶在基因工程中的应用 基因工程基因工程（genetic engineering），也叫基因操 作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是根据人们 预先设想，采用酶学的方法，将目的基因（所需要 的基因）重组到一个适宜的载体上组成重组子，再 将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以 达到改造生物细胞的目的的技术。 基因工程的整个过程由工程菌（细胞） 的设计构建和基因产物的生产两大部分组成 。前者主要在实验室里进行，其单元操作过 程如下： 基因工程的单元操作过程如下： （1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性 核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载 体分子切开。 （2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到 载体分子上，形成DNA重组分子。 （3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受 体细胞中。 （4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子 或使其整含到受体细胞的基因组中。 （5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高 效稳定表达的基因工程菌或细胞。 关于限制性内切酶 Restriction endonueleases 限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一 类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切 割位点的脱氧核糖核酸水解酶。 主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到1000 种以上，搞清识别序列的有300种以上。 Meselson和Yuan实验 噬菌体 K12和 C 的DNA分别 与由K12菌 体制备的细 胞抽提物保 温，并藉蔗 糖密度梯度 离心观察两 种DNA沉降 速度的变化 。 K12 DNA C DNA 加入K12菌体制备的细 胞抽提物 蔗糖密度梯度离心 实验表明，这种限制的本质是宿主细胞 K12中存在有能使外来DNA( CDNA)有限 降解的核酸水解酶。 此后，又进一步证实了大肠杆菌K12中 的修饰体系即为甲基化酶，该酶修饰了 K12 DNA上的特异部位，使其不被限制体系 的酶切割。 结论表明： n1965年阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在着一种 具有切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分 离出I型限制性内切酶与修饰酶。证实在细菌内存在两种 不同功能但又相关的酶。 n1970年史密斯从流感噬血杆菌d株中分离出了II型限制性 内切酶；同年内森斯使用该酶降解猕猴肿瘤病毒SV40的 DNA，首次完 成了对基因的切割，排列了酶切图谱。从 此成为分子克隆技术中不可缺少的工具酶，推动了基因工 程的发展。 n1978年，上述三人因对限制性内切酶的贡献获得诺贝尔 奖。 阿尔伯(1929) 瑞士微生物遗传 学家 H.O.史密斯(1931) 美国分子生物学家 、遗传学家 内森斯(1928) 美 国微生物遗传学家 限制性内切酶命名规则 限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘 取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第 一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶 的产生菌有株系之分，则有4个或4个以上拉丁字 母组成，其第四个字母之后表示株系。 如 EcoRI来源于Echerichia.coli RY13 BamHI来源于B.amyloliquefaciens H in d II Haemophilus(属名 ) Influenzae(种名 ) d(株系) 罗马数字 限制性内切酶命名举例 限制性内切酶分类 已发现的限制酶可以分为三类或称 作三型：I、II、III型。他们在酶反应中 所需要的辅因子和切割DNA的位点都不 相同，而且酶蛋白分子的大小和组成上 也有差别。 类别类别反应应必须须因子专专一性 活性 I型S-腺苷基蛋氨酸 ，ATP，Mg2+ 识别 部位和切点不同 ， 无特定切割位点 内切 甲基化 II型 Mg2+切断识别 部位或其附 近的特定部位 只有限制酶 活性 III型ATP，Mg2+识别 部位和切点不同 ，但切断特定部位 内切 甲基化 限制性内切酶分类 二、二、 II 型限制性内切酶的特性型限制性内切酶的特性 II型限制酶的识别特异性 回文识别序列 II型限制酶的识别序列大多是具有 双重对称结构性结构,或称回文序列 (Palindromic Sequence) 非典型回文识别序列 回文识别序列被一至几个其他核苷酸（N ）所间隔，得到的是非典型的双轴对称性序列 。 Bgl I GCCNNNNNGGC Mst II CCTNAGG 非回文识别序列 也有些限制酶识别序列非回文结构，切割位 点在距识别序列5至13个bp处。 5 GACGCNNNNN 3 3 CTGCGNNNNNNNNNN 5 例：Hgn I GACGC 有些限制酶可识别多重序列。如：Hind II，识别 序列为GTPyPuAC，可识别三三种序列。 GTPyPuAC GTCAAC GTCGAC GTTAAC GTTGAC 嘌呤（Purine） 嘧啶（Pyrimidine） 类似的内切酶还有 Acc I 、Ava I 、Ban I 、Hae I 等，它 们的特异性低于单一识别序列的酶。 识别序列的长度与剪切频率 大部分II型限制性内切酶的识别序列长度为4-8个 核苷酸。识别长度决定了剪切DNA的频率（1/4n，n 为识别的长度）。识别长度愈长，则切点少、产生片 段少而长度长，酶特异性高。 限制酶的切割特异性和酶切片段的末端结构 切割位点专一 作为工具酶的限制性内切酶有固定的切割位点； 产物具有特定的末端结构 当一个DNA分子被限制酶切开后形成两个末端，全部 产物具有相同的末端结构。即一种限制性内切酶切割任何 DNA只产生一种固定形式的末端结构，在DNA连接酶的作 用下，磷酸二酯键可以修复而成为一个重组的DNA分子； 而不同限制酶则形成不同末端结构。 5 - G 3 - CTTAA + AATTC - 3 G - 5 5 - GAATTC - 3 3 - CTTAAG - 5 DNADNA 连接酶连接酶 5 - GAATTC - 3 3 - CTTAAG - 5 任何一种限制酶切割DNA链时，总是水解核苷酸 3、5-磷酸双酯键的3位磷酸酯键，使产物的5端带磷 酸单酯基团，而3为游离羟基。 由于切割位点不同，所有的限制酶可产生两类末端结构 平末端（Blunt End）指酶切片段为齐头末端结构 。 粘性末端（Cohesive End）酶切后DNA片段末端带有 1-4个核苷酸残基长度的单链结构 ，而片段 两端突出的单链具有互补的序列。 粘性末端又可分为 5-粘性末端与 3-粘性末端 。 5 NOH 3 5PO4N 3 粘性末端 3-粘性末端5-粘性末端 平末端 5 - GAATTC - 3 3 - CTTAAG - 5 EcoR I 5 -G AATTC - 3 3 -CTTAA G - 5 5 - CTGCAG - 3 3 - GACGTC - 5 Pst I 5 - CTGCA G - 3 3 - G ACGTC - 5 5 - CCCGGG - 3 3 - GGGCCC - 5 Sma I 5 - CCC GGG - 3 3 - GGG CCC - 5 有没有例外？ （1 1）相同的限制性内切酶不总是产生匹配的片段）相同的限制性内切酶不总是产生匹配的片段 A） 含多重识别序列的限制酶 如 Hind II 在顺序GTPyPuAC 剪切，可产生3种不同 类型片段，互相连接的可能性为 1/3。 B） 含非典型识别序列的限制酶 如 EcoN I 在顺序CCTNNNNNAGC 剪切，N可以是任何核 苷酸，由于N的随意性，往往会产生不广泛匹配的片段。 C） 在次理想条件下，限制酶表现出星状活性，影响正常匹配 。 （2 2）不同的限制性内切酶）不同的限制性内切酶有时可以产生匹配的片段可以产生匹配的片段 例： BamH I GGATCC Bcl I TGATCA Bgl II AGATCT 这类能产生相同粘性末端而识别特异性不同的限制酶称作 同尾限制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶产生的DNA片段可 借DNA连接酶互相重组，但新产生的杂合序列将不再被原有的 限制酶所识别。 5 - G GATCT - 3 DNA 5 - GGATCT - 3 3 - CCTAG A - 5 连接酶 3 - CCTAGA - 5 (BamH I 片段) (Bgl II 片段) (产生杂合识别序列) 酶反应条件酶反应条件 按手册或商品说明书 反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。 常用的缓冲液选择 Tris-Hcl 。同时还 要加入 Mgcl2 和 2-巯基乙醇。 反应温度： 一般限制性内切酶的反应温度是 37 c。 酶活性单位： 1个酶活性单位是指一种酶在其最适宜的 反应条件下，1小时使 1g 噬菌体DNA 底物完全水解的酶量。但由于许多因素可 影响内切酶的水解反应和用量，实际用量 需比所需用量多加一倍左右。 第二活性 在次理想条件下,一些限制性内切酶的特异型会被降 低,只有部分正常识别位置被识别,此称为第二活性（ Secondary Activity），也称星号活性（Star Activity）， 加以“ *”表示，如 EcoR I*。酶的第二活性将引起底物 DNA链上切口增多，酶解片断变小，造成特异性降低。 例：理想条件下 （PH=7.5） EcoR I GAATTC 次理想条件下 （PH=8.5） EcoR I * AATT 次理想条件：通常包括不适合的离子强度、过高的PH、 二价金属离子的替换、较高的甘油浓度等 。 限制酶的保质期 一般是在检定日以后的一年内，但几乎 所有的限制酶在超过保质期后都不会急剧失 活, 因此购入后即使是经过长时间保存的酶, 也完全可以使用，但这些酶在使用前最好再 测一次活性。另外，保存酶时即便让其冻结 ，大部分酶也不会急剧失活。 EcoRI PstI SmaI return 研究酶的理化性质及其作用原理，对于阐明生 命现象的本质和规律具有十分重要的意义（包括酶 的结构功能、酶与代谢调节、酶与生物的生长、发 育、进化、疾病等） 。 从酶分子水平去探讨酶与生命活动、与代谢调 节、与疾病、生长发育等等的关系，对阐明某些生 命活动的本质和规律，无疑也具有十分重要的意义 。 二、酶是生命科学研究的重要对象 同功酶 n同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同， 而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质 不同的一组酶,存在于生物的同一种属或同一个 体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。 n目前已发现有150多种酶具有同工酶，如6-磷酸 葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性和碱性磷酸酶 、谷丙转氨酶和谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶、核 糖核酸酶、过氧化酶和胆碱酯酶等。其中，发现 最早，研究最多的是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶. 例：LDH同工酶的两种亚基以不同比例组成五种四聚体： LDH1(H4)、LDH2(H3M)、LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)和 LDH5(M4)。 Dogfish LDH M4结构图 同功酶与物种进化 同工酶是生物进化过程中为适应愈趋复 杂的代谢而引起的一种分子进化，以适应不 同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要. 同功酶在各器官和组织中的分布不同。 这样就可以根据同工酶酶谱差异并配合其它 方法从分子水平探讨物种进化、遗传变异等 一些生命现象。 在正常情况下血清中同功酶谱是相对稳定 的。当某一组织或器官发生病变时，就有某 种特殊的同工酶释放出来，引起血清中同功 酶活性的改变。对病人及正常人同工酶电泳 图谱进行比较，有助于上述器官疾病的诊断 。 在临床上已应用同工酶做诊断指标,例如 : 冠心病及冠状动脉血栓引起的心肌受损者血 清中LDH(H4)及LDH2(MH3)含量增高; 而肝细胞受损患者血清中LDH5(M4)增高。 同功酶与其它 同工酶的研究不仅在临床血液病、 肿瘤及其它疾病的诊断方面占有重要 地位，而且在分子遗传学、物种鉴定 、法庭取证、亲子鉴定、优生优育等 领域中也具有广阔的应用前景。 肿瘤的酶异常 肿瘤酶异常原因： 1、肿瘤过多或过少产生酶 2、肿瘤阻塞了酶通过的导管系统 3、肿瘤诱导酶产生 4、细胞通透性改变使可溶性酶进入血液循环 临床诊断还没有单一指标可确诊癌， 所以酶测定可作为一种辅助手段，如： n测定血清淀粉酶胰腺癌 n酸性磷酸酶前列腺癌 n亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脱氢酶等同 工酶谱变化肝癌、结肠癌、直肠癌。 端粒酶 l端粒、端粒酶与肿瘤发生的关系是近年 来肿瘤研究领域的热点之一。有研究表 明,端粒酶在85%95%的恶性肿瘤 组织中有阳性表达,而在正常体细胞则 一般为阴性。因此端粒酶抑制剂的研究 为恶性肿瘤的早期诊断、预后估计及基 因治疗开辟了一个新的途径。 端粒(telomere) l真核细胞染色体末端以 TTAGGG 6个碱基序列重 复组成的DNA结构 l人体细胞染色体端粒长度约为515Kb,其功能在 于保护染色体免受核酶降解,防止断端融合重排 或降解。如果端粒长度缩短到极限如4Kb以下时, 细胞则会丧失分裂增殖能力而发生凋亡,该过程 称为监控点激活(checkpoint activation)。 l端粒缩短被认为是正常细胞分裂与老化的分子信 号,端粒被称为细胞寿命的“分裂钟”。 端粒的保护机制 在真核细胞,端粒DNA的富G链较富C链超出 约1216bp,形成3端的突出单链结构,而 端粒蛋白质能够特异地识别这一突出区域并 与之结合,再通过进一步的折叠、盘曲,从而 形成染色体末端具有保护功能的“帽子”,在防 止染色体互相融合、重组等方面都发挥着十 分重要的作用 端粒酶(telomerase) l依赖RNA的DNA聚合酶,其实质是一种核糖核蛋白酶 (ribonucleo protein,RNP),能识别特定的端粒重 复序列,以自身RNA的