参考资料微生物系列实验报告

微生物工程综合性大实验实验内容实验一 谷氨酸发酵系列实验实验二 青霉素发酵系列实验实验三 啤酒发酵系列实验实验四 酸奶发酵系列实验实验一 谷氨酸的发酵系列实验（一）谷氨酸菌种的制备一、实验目的了解发酵工业菌种制备工艺和质量的控制，为发酵实验准备菌种。二、实验原理菌种制备的主要是尽可能培养出高活性能满足大规模发酵需要的纯种，主要纺纱方式为：分离纯化和扩大培养。一般2个月分离纯化一次，分两步进行。平板稀释法分离出单细胞菌落；挑取若干单细胞菌落接种于试管斜面培养基，然后把这些菌株分别用三角瓶进行药瓶发酵实验，比较各菌株产酸的高低，选择产酸高的菌株供生产用。三、实验材料、仪器与试剂材料 谷氨酸棒杆菌仪器 试管；三角瓶；烧杯；量筒；玻棒；PH试纸（PH5.59.0）；天平；立式高压蒸汽灭菌锅；培养箱；显微镜等试剂 无水乙醇；牛肉膏；葡萄糖；蛋白胨；可溶性淀粉；胰蛋白胨；酵母提取物；NaCl;5mol/L NaOH;1mol/L HCl;KNO3;K2HPO4H2O;MgSO47H2O;MnSO4H2O 。四、实验步骤（一）培养基的制备1）平板培养基葡萄糖0.1%；蛋白胨1%；牛肉膏1%；NaCI0.5%；琼脂2%（pH=7.0）配置50ml培养基，灭菌后倒2个平板。2) 一级种子培养基蛋白胨1%；酵母浸出粉0.5%；NaCI1%；（pH=7.0）用三角瓶配置100ml，高压灭菌20min。3）二级种子培养基葡萄糖2.5%；尿素0.34%；3水磷酸氢二钾0.16%；7水硫酸镁0.043%；7水硫酸哑铁0.0002%；1水硫酸锰0.0002%（pH=7.0）用三角瓶配置100ml，高压灭菌20min。（二）菌种的制备1）用平板稀释法在平板培养基进行画线，分离出单细胞菌落；2）用接种环挑取若干个单细胞菌落接到一级种子培养基，置于控温摇床200r/min，振荡培养12h，温度为32。3）取10ml一级种子培养基接到二级种子培养基中，置于控温摇床200r/min，振荡培养12h，温度为33-34。附：二级种子质量要求1） pH在7.2左右；2） 残糖量在1.5%以下，其他同一级种子；3） OD值净增加0.6。（二）谷氨酸发酵及控制一、实验目的了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程操作。二、实验原理培养基、温度、pH值、通风、搅拌、泡沫等因素会对发酵过程产生重要影响，因此对重要的参数进行控制是顺利进行发酵的前提和保证。根据发酵菌种对温度、pH值的要求不同，因此在发酵过程中要采取不同的温度和pH，以使发酵过程能够顺利进行，从而达到预期的目标。适当的溶氧对微生物菌株的发酵过程具有重要的影响，保证一定的溶氧就必须对通风量及搅拌转速进行适当的调节。三、实验材料、仪器与试剂材料：谷氨酸发酵二级种子培养液；发酵培养基；谷氨酸发酵液不同发酵时间所取样品；谷氨酸发酵液。仪器：蒸汽发生器；发酵罐及控制系统；空气压缩机；补料瓶；补料针；硅胶管；滴定管；滴定管架；电炉；烧杯；1000mL容量瓶、150mL锥形瓶；高速离心机；分光光度计；恒温水浴锅；三角瓶；小试管；烧杯；玻棒等。试剂：无水乙醇；葡萄糖；硫酸镁；磷酸氢二钾；氢氧化钾；糖蜜；硫酸亚铁；硫酸锰；尿素、消泡剂；去离子水；硫酸铜；亚甲基蓝；酒石硫钾钠；氢氧化钠；亚铁氢化钾；盐酸；L-谷氨酸分析纯；茚三酮；丙酮；酒精等。四、实验步骤（一）谷氨酸的中糖发酵及控制1清洗发酵罐，配制好5L发酵培养基，灭过菌的400ml40%尿素及400ml消泡剂；2对发酵罐进行空消；3加入5L的发酵培养基，对发酵罐进行实消；4在接种槽中加好酒精并点燃，把二级种子培养基从接种口倒进发酵罐中进行发酵；5对谷氨酸发酵过程中各项指标进行测定及控制。u 温度的控制u 溶氧量的控制u 通气量的控制u OD值的测定 直接用分光光度计，在波长600nm下测得OD值；u pH值的测定 用pH试纸进行测定，pH要控制在7.1-8.2这个范围内；u 谷氨酸含量的测定u 还原糖含量的测定（二）谷氨酸发酵过程还原糖含量的测定a试剂配制（斐林试剂）甲液：五水硫酸铜3.5g，亚甲基蓝0.005g，用水溶解并稀释至100ml；乙液：酒石酸钾钠11.7g，氢氧化钠12.64g，亚铁氢化钾0.94g，用水溶解并稀释至100ml；0.1%标准葡萄糖溶液：取葡萄糖1g，用少量水溶解，转至1000ml容量瓶中，加入5ml盐酸，用水稀释定容至1000ml，摇匀；b斐林试剂的标定甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加水10ml，从滴定管中预先加入约20ml0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀。于电炉上加热至沸腾，在沸腾的状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的总体积。同法平行操作3次，取接近两次体积的平均值为V0。c滴定甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加入0.1mlV1发酵液，摇匀后于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录消耗的标准葡萄糖溶液的总体积V2.d计算公式还原糖（以葡萄糖计g/100ml）=（V0- V2）C1/ V1100【V0 =29.1mL；C=0.1%；V1=0.1mL】（三）谷氨酸含量的测定a谷氨酸标准曲线的绘制u 标准样品的制备 L-谷氨酸纯品梯度稀释溶液：分别称取0.05-0.5g分析纯L-谷氨 酸,并分别溶解到100ml蒸馏水中，调节pH5.5-6。u 茚三酮试剂的制备 称取0.5g茚三酮溶于100ml丙酮。u pH调节试剂的制备 2mol/LNaOH溶液：称取80gNaOH溶于100mL蒸馏水中；1mol/L HCL溶液：量取36mL蒸馏水中。u 标准溶液OD569值的测定 取20支试管，分别加入3ml配制好的（0. 05-0.50）g/100ml的L-谷氨酸纯品溶液各两管，每支试管分别沿试管壁加入茚三酮试剂0.5ml，摇匀，迅速置于80水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至569nm处，以蒸馏水为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。以OD569值为纵坐标，绘制标准曲线。b发酵液谷氨酸含量测定谷氨酸发酵液11400r/min，离心5min，取上清，蒸馏水稀释100倍，调节pH值5.5-6，取3ml预处理好的发酵液加入15mm150mm试管，调整pH值5.5左右，沿试管壁加入0.5ml茚三酮试剂，混匀，迅速置于80水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至569nm处，以100稀释的空白发酵培养基为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。从标准曲线上查出相应L-谷氨酸浓度。结果与分析1、谷氨酸菌种的制备结果一级菌液OD600=0.239 pH=6.5二级菌液OD600=0.106 pH=7.02、谷氨酸含量的测定结果1）标准曲线数据：时间（h）013457891112131516温度3232323235.9pH6.426.567.388.578.94DO值102.082.22.72.62.3通风量2.52.42.43.023OD6000.2080.6411.3817.458.65还原糖含量滴定用量（ml）10.8还原糖含量（g/100ml）9.21谷氨酸含量（OD569）0.4谷氨酸含量（g/100ml）0.0892时间（h）1719202123242527282931323335温度35.935.936.036.0pH9.029.059.039.12DO值12.117.529.149.9通风量6.85.2504.8OD60010.1310.3510.6310.33还原糖含量滴定用量（ml）13.3014.6615.49还原糖含量（g/100ml）6.715.354.42谷氨酸含量（OD569）1.11.92.22.9谷氨酸含量（g/100ml）0.20560.33860.38840.5047时间（h）363719404143444547484950温度35.835.935.935.9pH8.739.179.128.15DO值63.067.975.165.1通风量0.60.60.60.6OD6009.7411.849.339.66还原糖含量滴定用量（ml）16.5016.6217.9619.09还原糖含量（g/100ml）3.513.392.050.92谷氨酸含量（OD569）4.05.43.41.9谷氨酸含量（g/100ml）0.68760.92020.58790.33362）标准曲线绘制如下：3、谷氨酸发酵过程1）谷氨酸发酵上罐谷氨酸棒杆菌4、实验分析:4.1实验通过平板划线分离菌种的方法获得单个菌落，图中可以看出，单菌落的形态、大小、颜色比较一致，可以用作一级、二级种子的培养。4.2谷氨酸发酵是建立在容易变动的代谢平衡上，受多方面的环境条件支配。环境适应，谷氨酸产生菌能将50%以上的糖转化为谷氨酸，副产品较少。如果环境条件不适宜，谷氨酸几乎不产生，可能会合成乳酸、琥珀酸等代谢产物。因此，需要对发酵过程进行严格控制。4.3温度对于发酵是非常重要的，从酶反应动力学来看，温度升高，反应速度加快，代谢产物速度提前。由谷氨酸发酵中温度及还原糖随时间变化曲线图可以看出，发酵过程中，温度严格控制在3036之间，在3236h内，温度大都接近36，符合谷氨酸发酵中温度的要求。从而，可以排除温度在发酵过程中对谷氨酸代谢产物合成的影响。4.4发酵过程中，营养成分的利用和代谢产物的积累，使发酵液的PH不断变化，若阴离子氮源被利用后产生NH3 ，则pH上升。有机酸的积累，使pH下降，培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。而PH的变化又会间接影响到膜渗透性，进而影响到营养物质的吸收和代谢产物的分泌。所以，在谷氨酸发酵过程中，需控制好PH。谷氨酸发酵中PH及通风量随时间的变化曲线表明，PH通过尿素流加法，严格控制在6 8之间，在发酵过程中，由于没有PH电极，不能及时得知发酵液的PH值，所以难以控制在68之间。4.5供氧对菌体的生长和谷氨酸的积累都有很大的影响，若在生长期，供氧不足，会抑制菌体的生长，从而导致副产物乳酸的积累。有图标看出，在前8小时左右，DO值不断下降，这是由于发酵前期，谷氨酸棒杆菌增殖耗氧的缘故。第18小时左右DO值开始回升，谷氨酸棒杆菌增殖减缓。4.6还原糖是谷氨酸发酵过程中的主要检测控制参数，当还原糖的含量降至1%以下，表明谷氨酸的发酵已经完成。图表看出还原糖含量不断降低，但是谷氨酸含量有个先增长后降低的趋势，可能是发酵后期，谷氨酸分解的缘故。4.7谷氨酸的等电回收，并未得到谷氨酸的结晶体，可能是人工操作失误，无法结晶。总结：此实验比较失败实验二 啤酒发酵工程系列实验（一）协定法糖化试验一、实验目的了解协定法糖化试验的原理，并掌握这种糖化法的操作。二、实验原理利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解成可发酵性糖类，蛋白质分解为氨基酸，碘遇淀粉显蓝色，从而判断可发酵性糖类的浓度。三、实验材料、仪器与试剂材料 麦芽、麦芽汁仪器 水浴锅、烧杯、瓷板、玻棒、温度计、纱布、胶头滴管、恒温水浴锅试剂 碘化钾四、实验步骤A实验室糖化器的准备 由水浴锅和1000ml的烧杯组成糖化仪器，杯内用玻璃棒搅拌。实验时杯内液面应始终低于水浴液面。B碘溶液配制 2.5g碘化钾溶于水中，稀释到100ml；C协定法糖化麦芽汁的制备1）用植物粉碎机将麦芽粉碎，称取75g；2）在已知质量的糖化杯中放入75g麦芽粉，加300ml46-47的水，于不断搅拌下在45水浴中保温1h；3）使酶液以每分钟升温1的速度，升温加热水浴锅，在25min内升至70，此时于杯内加入150ml70的水；4）70保温2h；5）每隔10min用玻璃棒取麦芽汁一滴，置于白滴板上，再加1滴碘液，混匀，观察颜色变化，直至碘液不变色为止；6) 在10-15min内急速冷却到室温； 7) 用纱布将麦芽汁进行过滤，将滤液转移到蓝口瓶中；8) 用八层纱布将瓶口封好；9) 高压灭菌30min。(二)啤酒酵母的扩大化培养一、实验目的学习酵母菌种的扩大培养方法，为实验室啤酒的发酵准备菌种。二、实验原理在啤酒发酵中，接种量一般应为麦芽汁量的10%（使发酵液中的酵母量达1107个酵母/毫升），因此，要进行大规模的发酵，首先必须进行酵母菌种的扩大培养，扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母，另一方面是使酵母由最适生长温度（28）逐步适应为发酵温度（10）。三、实验材料、仪器与试剂材料 啤酒酵母发酵菌种培养液仪器 恒温培养箱；生化培养箱；显微镜等。试剂 麦芽汁平板；麦芽汁培养液四、实验步骤利用糖化后的麦芽汁50ml+1g的琼脂粉配制成固体培养基，灭菌后倒两个平板。另外将50ml的麦芽汁倒到100ml的锥形瓶中，高压灭菌1）接种：将不同品牌的啤酒酵母用划线法接到麦芽汁培养基中；2）培养：在28中培养48h后挑取若干个菌落接到50ml麦芽汁中；3）28中培养12h后，每隔一小时摇5min，并将温度调低1，知道温度降到12为止。（三）啤酒主发酵及各项指标的测定一、实验目的学习啤酒发酵的过程，掌握酵母发酵规律；学习用血球计数板计数酵母数量的方法；学习酵母菌种的质量鉴定方法；学习用糖锤度计测定糖度的方法；掌握PH的测定方法，监测啤酒发酵的进程；了解用目视比色法的、测定啤酒色度的方法，监测发酵液的质量。二、实验原理 啤酒主发酵时静置培养的典型代表。是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中，早一定温度下培养的过程。由于酵母菌是一种兼性厌氧微生物，先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长，然后利用EMP途径进行厌氧发酵生成酒精。定期摇动容器既能增加溶氧，也能改善液体各成分的流动，最终加快菌体的生长过程。分析其他指标，应从取样口取样测定。三、实验材料、仪器与试剂材料 啤酒酵母；啤酒酵母发酵菌液。仪器 玻璃缸；生化培养箱；显微镜；恒温水浴锅；恒温箱；高压蒸汽灭菌锅；带刻度的锥形离心管；PH计；糖锤度计；100mL比色管；白瓷板；吸管；玻璃杯等试剂 麦芽汁培养基；灭菌水；0.1mol/L碘标准溶液；美篮；葡萄糖；蛋白胨；醋酸钾；琼脂等。四、实验步骤1）将糖化好的的麦芽汁装在蓝口瓶中，加葡萄糖调节糖度到10Bx，定容至600ml，用八层纱布封好口之后，灭菌30min；2）在接种前先将麦芽汁培养基摇匀；3）将扩大培养中的50ml酵母培养液转接到麦芽汁培养基中，摇匀；4）将接好种的麦芽汁培养基放到10的生化培养箱中培养，每6小时摇瓶充氧5min，每24h取样测量啤酒发酵的各项指标，指标包括：糖度、细胞浓度、出芽率、细胞死亡率、还原糖、色度、pH。5）糖度达到4Bx后停止发酵；（一）啤酒酵母的计数1）取清洁的血球计数板一块，平放于桌面，在计数室上方加盖盖玻片；2)取酵母菌液（发酵液）10um加190um水稀释20倍（根据实际需要稀释所稀释倍数），用移液枪吸取稀释后的菌液滴至盖玻片边缘，让菌液渗入计数室内，计数室内不能有气泡；3)静置5min，让酵母细胞稳定附着于计数室内；4)将计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室的方格网，并移至视野中间；5)转用高倍镜，找到计数室位置开始计数；6)计算公式：酵母细胞数/ml=大格中的细胞总数10000稀释倍数7)用完血球计数板后马上清洗干净。（二）啤酒酵母的质量检查1)试剂配制 0.025%美蓝水溶液100ml，0.025g美蓝溶于100ml水中。2)死亡率检查 取一滴稀释后的菌液加一滴的0.025%美蓝水溶液混匀，在将其滴至血球计数板盖玻片边缘，使其渗入，取5个视野计算被染色的细胞与总细胞数，计算死亡率。3)出芽率检查 可以跟检查死亡率一起进行，在检查死亡率的视野中数出出芽的细胞个数，计算出芽率。（三）还原糖的测定1）试剂配制(斐林试剂)：甲液：五水硫酸铜3.5g，亚甲基蓝0.005g，用水溶解并稀释至100ml；乙液：酒石酸钾钠11.7g，氢氧化钠12.64g，亚铁氢化钾0.94g，用水溶解并稀释至100ml；0.1%标准葡萄糖溶液：取葡萄糖1g，用少量水溶解，转至1000ml容量瓶中，加入5ml盐酸，用水稀释定容至1000ml，摇匀；2）斐林试剂的标定甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加水10ml，从滴定管中预先加入约20ml0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀。于电炉上加热至沸腾，在沸腾的状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的总体积。同法平行操作3次，取接近两次体积的平均值为V0。3）滴定甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加入0.1mlV1发酵液，摇匀后于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录消耗的标准葡萄糖溶液的总体积V2.4)计算公式 还原糖（以葡萄糖计g/100ml）=（V0- V2）C1/ V1100（四）糖度的测定 用糖度仪测出发酵液的糖度，再根据公式换算出plato值。(五)pH值的测定 直接用pH试纸进行测定（六）色度的测定 取2支比色管，一支中加入5ml蒸馏水，另一支加入5ml离心后的啤酒发酵液，用白色纸张为背景，用1ml移液管吸取1.00ml碘液，逐滴滴入装水的比色管中，并不断振荡比色管使其混匀，直至从轴线方向观察其颜色与样品比色管相同为止，记下所消耗的碘液体积（ml，精确至小数点后两位）样品的色度=10MV，M为碘标准溶液物质的量浓度。（四）结果与分析1、啤酒质量品评表1 淡色啤酒的给分扣分标准类别项目满分要求缺点扣分标准样品外观10分透明度5分迎光检查清亮透明，无悬浮物或沉淀物清亮透明0-2光泽略差1轻微失光2有悬浮物或沉淀34严重失光5色泽5分呈淡黄绿色或淡黄色色泽符合要求0-1色泽较差13色泽很差45评语由成品看来，不够透明，沉淀也比较多，颜色有点暗沉。泡沫性能15分起泡2分气足，倒入杯中有明显泡沫升起气足，起泡好0-1起泡较差1不起泡沫2形态4分泡沫洁白洁白0-1不太洁白1不洁白2泡沫细腻细腻0-1泡沫较粗1泡沫粗大2持久6分泡沫持久，缓慢下落持久4min以上0-334min123min312min51min以下6挂杯3分杯壁上附有泡沫挂杯好0-1略不挂杯1不挂杯23喷酒缺陷开启瓶盖时，无喷涌现象没有喷酒00略有喷酒12有喷酒35严重喷酒68评语本组做的啤酒泡沫有点少但泡沫质量基本还是符合要求的。啤酒香气20分酒花香气4分有明显的酒花香气明显酒花香气0-1酒花香不明显12没有酒花香气34香气纯正12分酒花香纯正无生酒花香酒花香气纯正0-1略有生酒花味12有生酒花味34香气纯正无异香纯正无异香0-1稍有异香味14有明显异香58无老化味4分新鲜，无老化味新鲜无老化味00略有老化味12有明显老化味34评语啤酒香气虽然有，但是不浓烈，也不够清醇。酒体口味55分纯正5分应有纯正口味口味纯正，无杂味00有轻微的杂味12有较明显的杂味35杀口力5分有二氧化碳刺激感杀口力强0-2杀口力差14没有杀口力5苦味5分苦味爽口适宜，无异常苦味苦味适口，消失快0-4苦味消失慢1有明显的后苦味23苦味粗糙45淡爽或醇厚5分口味淡爽或醇厚，具有风味特征淡爽，不单调0-2醇厚丰满0酒体较淡薄12酒体太淡，似水样35酒体腻厚15柔和协调10分酒体柔和、爽口、谐调，无明显异味柔和、爽口、谐调0-2柔和、谐调较差12有不成熟生青味12口味粗糙12有甜味、不爽口12稍有其它异杂味12口味缺陷25分不应有明显口味缺陷（缺陷扣分原则：各种口味缺陷分轻微、有、严重三等酌情扣分）没有口味缺陷0-2有酸味15酵母味或酵母臭15焦糊味或焦糖味15双乙酰味15污染臭味15高级醇味13异脂味13麦皮味13硫化物味13日光臭味13醛味13涩味13评语口味上真正的纯生，但是始终有一点杂味，口感不是很纯 总体评价：总的来说，此次啤酒实验成品还是一般。总计减分25总计得分752、实验分析啤酒发酵数据统计一级麦芽二级麦芽第一天(12.3)第二天（12.4）第三天（12.5）第四天（12.6）第五天（12.7）PH4.33.04.42.22.04.04.0OD2.644.292.383.153.952.392.55计数无3.121071.2121074.01074.8107质检死亡率1%2%5%5%0.1%糖度12.812.711.511.110.1出芽率无无无无无2.1 啤酒酵母在一定条件下，以麦汁所含的可发酵性营养物质为底物而进行一系列生物化学反应合成啤酒。因此，麦汁的糖化结果直接影响到发酵效果。在协定法糖化过程中，出现糖化时间过长以及糖度不够的现象。因素有：A、-淀粉酶活力偏低，不能使淀粉快速液化以造成-淀粉酶分解的条件，也能造成糖化时间延长。B、麦芽虽然酶活力正常，但脆度低、粗细粉差高，在粉碎度不够的情况下仍会导致糖化时间延长。2.2酵母的生理状态将会影响整个发酵过程的质量，本小组选用的是珠江啤酒酵母，通过平板划线，得到较多的酵母菌落，可以用于一级种子和二级种子的制备（忘了拍照）2.3 酵母发酵过程，各生化指标的变化直接反应出发酵的质量。酵母的浓度可影响啤酒发酵时间的长短。由于操作误差，酵母死亡率计数不准确2.4 发酵结束后，由于糖度仪出现问题，最后的唐都不确定多少，但是啤酒色泽，香味都比较不错，口感也还可以，总体比较成功。实验三 青霉素发酵一、 实验目的1、通过青霉素发酵，对抗生素发酵有一个初步了解。2、掌握抗生素发酵过程中一些重要生理指标。二、实验原理抗生素产生菌在发酵过程中，利用培养基中的各种营养成分进行一系列的代谢变化，同时分泌出许多代谢产物。抗生素发酵过程中生产菌株的代谢研究是提高抗生素产量的一个重要环节，有很多工作都与菌株的代谢研究密切相关。本实验以青霉素发酵为例，介绍进行微生物生理研究的几个基本内容。例如，不同菌株、不同营养源、不同前体以及不同发酵条件对抗生素生物合成的影响等。三、实验材料1、菌种 产黄青霉，金黄色葡萄球菌2、PDA培养基（自然PH）马铃薯（去皮）200g 琼脂粉20g 蔗糖20g 去离子水1000mlLB培养基（PH7.0）蛋白胨10.0g 氯化钠10.0g 酵母提取物5.0g 琼脂粉20g四、实验步骤1、菌种的培养 将产黄青霉接种到PDA斜面培养基上，26培养。2、发酵 从PDA斜面培养基上移种一接种环青霉菌孢子，接种到三角瓶发酵PDA培养液中，然后将三角瓶置于摇瓶机上进行振荡培养（261）。自零小时起，每隔24h取出一瓶，在冰箱低温保存。3、分析、测定 1）金黄色葡萄球菌悬液的制备 取琼脂培养基上的金黄色葡萄球菌，置于10ml的离心管，用0.85%的生理盐水洗下，离心沉淀，倾去上层清液，菌体沉淀后再用生理盐水洗12次，最后将菌液稀释至，用比色计测定，OD值为0.2左右（波长650nm处）。2）青霉素标准溶液的配置 准确称取纯苄青霉素钠盐1520mg，溶解在一定量的PH6.0的磷酸缓冲液中，使成2000单位ml的青霉素溶液。然后依次稀释，配制成102000单位ml青霉素标准工作液。3)青霉素标准曲线的制备 取灭菌培养基15套每组，每皿倒入适量的下层培养基，水平放置，待凝固之后，在加入含菌上层培养基，将培养皿来回倾侧，使含菌的上层培养基均匀分布。上层培养基在使用前先冷却至50左右，每100ml培养基内加入50%葡萄糖溶液1ml及金黄色葡萄球菌悬液ml，充分摇匀。待上层培养基完全凝固之后，在每个琼脂平板上轻轻的放置34个牛津小杯，小管之间的距离应相等，然后用移液枪将青霉素标准溶液加于小管内，每一浓度做3皿重复，盖上培养皿盖，将培养皿移至37恒温箱内培养1824h后，一区小管，精确地量取抑菌圈直径并记录数据。4)青霉素浓度的测定 将不同时间检品稀释液使用青霉素标准曲线的制备的方法，测出不同时间检品稀释液抑菌圈的校正直在标准曲线上分别查出个检品稀释液的效价，在乘以检品的稀释倍数，即可算出各个检品的效价。五、实验结果与分析1 实验结果青霉素PDA培养基的PH时间12.212.312.412.512.612.712.8PH4.34.54.44.44.34.34.4pH变化趋势图抑菌圈标准：100U 2.7 2.6 2.4 200U 3.5 3.6 3.4 300U 2.9 2.9 2.8 400U 3.7 3.5 3.6 500U 3.7 3.5 3.6 600U 3.4 3.7 3.9标准曲线：12.5：抑菌圈直径：1.2 1.9 1.512.6：抑菌圈直径：2.5 2.7 2.612.7：抑菌圈直径：2.3 2.5 2.4由上图可看出菌种培养出来，数量比较多。在显微镜下面可以清楚看到扫把头形状的菌体2 实验分析2.1上图有本组培养的青霉菌图片，几天后，可以看到平板布满了青色以及丝状的菌体。2.2通过利用青霉素能抑制金黄色葡萄球菌所形成的抑菌圈的直径的大小，并利用青霉素标准曲线图，对应出发酵液中所含青霉素的含量。本组连续三天得到比较小的抑菌圈，其他时间并未得到抑菌圈，可能是以下的问题导致的1、青霉素发酵是采用摇瓶发酵的方式，由于发酵瓶没封好，早成部分发酵液溢出，从而影响青霉菌利用营养物质合成代谢产物。2、发酵过程中，出现大量青霉