免疫细胞学技术课件

1 第十章第十章 免疫细胞学技术免疫细胞学技术 2 第一节第一节 免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术 1 1、自然沉降法、自然沉降法 2 2、聚合物加速沉降法、聚合物加速沉降法 明胶明胶 右旋糖酐右旋糖酐 PVP PVP 一、白细胞分离 3 二、外周血单个核细胞的分离二、外周血单个核细胞的分离 d d2 2 c c - - mm(X) (X) V V (X)(X)= = g g 18 18 (X)(X) 利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法 4 形成密度梯度的介质形成密度梯度的介质 1.BSA1.BSA 2.2.聚蔗糖聚蔗糖 FicollFicoll 3.3.泛影酸盐泛影酸盐 Isopaque HypaqueIsopaque Hypaque 泛影葡胺（泛影葡胺（Urografin)Urografin) 4.4.硅胶颗粒硅胶颗粒 聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮 5 1 1、Ficoll Ficoll 分离法分离法 分离介质：分离介质：Ficoll-HypaqueFicoll-Hypaque 原原 理：理：Ficoll-HypaqueFicoll-Hypaque密度：密度：1.0771.077 主要材料：主要材料： 淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 RPMI1640RPMI1640培养液培养液 离心管等离心管等 肝素抗凝血肝素抗凝血 分离过程：分离过程： 6 7 结结 果：果： 效果评价：效果评价： 得率得率 纯度纯度 活力活力 注意事项：注意事项： 密度的选择密度的选择 加样界面加样界面 活力检查活力检查 8 2 2、PercollPercoll分离法分离法 d d2 2 c c - - mm(X) (X) V V (X)(X)= = g g 18 18 (X)(X) c- m(X)=0 9 n n 原理：原理： n n 主要材料：主要材料： n n 分离过程：分离过程： n n 结果：结果： (1) (1) 连续连续BSABSA密度梯度离心法密度梯度离心法 10 三、三、 淋巴细胞分离技术淋巴细胞分离技术 （一）淋巴细胞的纯化（一）淋巴细胞的纯化 1 1、红细胞的去除、红细胞的去除 低渗裂解法低渗裂解法 氯化铵裂解法氯化铵裂解法 2 2、血小板的去除、血小板的去除 3 3、单核细胞的去除、单核细胞的去除 黏附贴壁法 过柱吸附法 磁铁吸附法 11 尼龙毛分离法尼龙毛分离法 原理：原理： 聚酰胺纤维聚酰胺纤维 主要材料：主要材料： RPMI1640RPMI1640、 HanksHanks液液 尼龙毛柱尼龙毛柱 待分离的材料待分离的材料 分离过程：分离过程： 结果：结果： 12 注意事项：注意事项： 1 1、尼龙毛与尼龙毛柱、尼龙毛与尼龙毛柱 2 2、洗柱速度、洗柱速度 3 3、温度与、温度与pHpH值值 13 （二）淋巴细胞亚群的分离（二）淋巴细胞亚群的分离 1. E1. E花环沉降法花环沉降法 2. 2. 尼龙毛分离法尼龙毛分离法 3. 3. 免疫吸附分离法免疫吸附分离法 4. 4. 免疫磁性微珠分离法免疫磁性微珠分离法 5. 5. 流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法 14 15 1 1、免疫溶解法、免疫溶解法 原原 理：理： 抗抗 Thy-1Thy-1抗体抗体 主要材料：主要材料： HanksHanks、补体、补体、RPMI1640RPMI1640 分离过程：分离过程： 一步法一步法 二步法二步法 结结 果：果： 16 注意事项：注意事项： 1 1、预实验、预实验 2 2、对照组、对照组 3 3、处理细胞的密度、处理细胞的密度 4 4、补体的来源、补体的来源 5 5、缺点：、缺点： 17 18 注意事项注意事项 1 1、盘化法分离细胞的使用范围、盘化法分离细胞的使用范围 2 2、直接法和间接法的比较、直接法和间接法的比较 3 3、包被用抗体可以反复使用、包被用抗体可以反复使用 4 4、包被抗体的瓶皿的保存、包被抗体的瓶皿的保存 5 5、加样体积、加样体积 19 玫瑰花环分离法玫瑰花环分离法 1 1。E E玫瑰花环分离法玫瑰花环分离法 2 2。EAEA玫瑰花环分离法玫瑰花环分离法 3 3。EACEAC玫瑰花环分离法玫瑰花环分离法 20 21 五、流式细胞分选术五、流式细胞分选术 22 免疫磁珠分离技术免疫磁珠分离技术 ( (一一) )、原理：、原理： 免疫磁性微珠免疫磁性微珠 直接法直接法 间接法间接法 分离细胞的方式：分离细胞的方式： 阳性分离（正选）阳性分离（正选） 阴性分离（负选）阴性分离（负选） 23 24 瑞士瑞士DynalDynal公司：公司： 磁珠磁珠 基因公司：基因公司： 磁式细胞分选器磁式细胞分选器 （magnetic activated cell sorter MACS)magnetic activated cell sorter MACS) 25 CD34+CD34+造血干细胞分离试剂盒造血干细胞分离试剂盒 试剂试剂A1A1: : 为人为人IgGIgG 试剂试剂A2:A2: 半抗原偶联的抗半抗原偶联的抗CD34CD34单克隆抗体单克隆抗体 试剂试剂A3A3: : 抗半抗原抗体和磁珠结合物抗半抗原抗体和磁珠结合物 26 Mini MACSMini MACS MACSMACS正选柱正选柱 其他：其他： 淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 HanksHanks液液 27 细胞分离过程：细胞分离过程： 制备外周血单个核细胞制备外周血单个核细胞,10,10 8 8 /300/300 l l 磁标记抗体磁标记抗体 磁性分离细胞磁性分离细胞 结果：结果： 细胞的纯度和活力细胞的纯度和活力95%95% 28 注意事项：注意事项： 标记要快速、低温标记要快速、低温 小心淋洗细胞小心淋洗细胞 缓冲液要除气缓冲液要除气 柱子使用前用柱子使用前用4%BSA4%BSA预处理预处理 29 优点优点: : 1. 1.细胞种类广细胞种类广 2. 2.分离纯度高分离纯度高 3. 3.分选方式灵活分选方式灵活 4. 4.细胞活力好细胞活力好 5. 5.细胞处理量大细胞处理量大 缺点缺点: : 费用大费用大 评价: 30 四、四、 吞噬细胞的分离和收集吞噬细胞的分离和收集 n n 单核细胞单核细胞 n n 巨噬细胞巨噬细胞 n n 1. 1. 巨噬细胞收集巨噬细胞收集 n n 2. 2. 动物腹腔巨噬细胞收集动物腹腔巨噬细胞收集 31 第二节第二节 淋巴细胞标志和功能淋巴细胞标志和功能 检测检测 32 一一、 概述概述 n n 淋巴细胞淋巴细胞 T T B B NK NK 33 T T细胞表面标志细胞表面标志 n n T T细胞受体细胞受体 TCRTCR n n 簇分化抗原簇分化抗原 CDCD CD2 CD2 CD3 CD3 CD4/CD8 CD4/CD8 n n 其他其他 MHC IMHC I类抗原类抗原 有丝分裂原受体有丝分裂原受体:PHA/ ConA:PHA/ ConA 病毒受体病毒受体 34 B B细胞的表面标志细胞的表面标志 n n 表面免疫球蛋白表面免疫球蛋白 SIgSIg n n MHC MHC和和CDCD抗原抗原 n n 其他其他 FcFc受体受体 补体受体补体受体 丝裂原受体丝裂原受体:LPS:LPS 35 NKNK细胞细胞 n n 自然杀伤活性自然杀伤活性 n n 细胞因子活化的杀伤作用细胞因子活化的杀伤作用 n n ADCCADCC n n CD16CD56CD16CD56 36 二二. .淋巴细胞表面标志的检测淋巴细胞表面标志的检测 n n 特异性抗原的检测特异性抗原的检测 n n 特异性受体的检测特异性受体的检测 37 T T细胞表面主要细胞表面主要CDCD抗原及其特异性抗原及其特异性 CDCD抗原抗原 特异性特异性 CD2 ECD2 E受体、全部受体、全部T T细胞和部分细胞和部分NKNK细胞细胞 CD3 CD3 成熟成熟T T细胞细胞 CD4 TCD4 T（辅助（辅助/ /诱导）细胞、诱导）细胞、MM、HIVHIV受体受体 CD8 TCD8 T（杀伤（杀伤/ /抑制）细胞、抑制）细胞、NKNK细胞的亚型细胞的亚型 CD25 CD25 活化活化T T细胞、细胞、IL-2IL-2受体受体 38 特异性抗原的检测特异性抗原的检测 vv标志抗体标志抗体: : 流式细胞仪流式细胞仪 ABCABC法法 vv红细胞致敏红细胞致敏: : 花环试验花环试验 标记抗 体 荧光 金银染色 酶免疫法 亲和素-生物素法 39 间接免疫荧光法 荧光显微镜检测：淋巴细胞+相应单抗 荧光素标记的二抗 观察 A比值，相对值 B.淋巴细胞纯度要求高 C.主观影响较大 D.普通显微镜和荧光显微镜交替使用 40 普通显微镜观察 v间接法: v未标记抗体酶法(以酶作为抗原,制备抗体): APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶）桥联免疫酶 染色法 免疫细胞化学法 41 APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶） 桥联免疫酶染色法 一抗 二抗 APAAP: 特点:抗原和抗体均未被酶标记 42 ABC(avidin-biotin- peroxidase complex )法 亲和素-生物素技术 43 ABC(avidin-biotin-peroxidase complex)法 一抗 亲和素 生物素 生物素化二抗 酶 ABC 显色 特点:亲和素有4个与生物素结合的位点 两者结合的亲和力比抗原抗体强100万倍 44 T T细胞特异性受体的检测细胞特异性受体的检测 n n EtEt花环试验花环试验 n n EaEa花环试验花环试验 45 原理：T-SRBCR+SRBC E花环 （erythrocyte） 特点：Et代表总T细胞，占60-80%，42小时； Ea代表T细胞一亚群，占20-40%，短时间温育 (1)检测T细胞（2）用SRBC（3）E花环结合不牢 固 特异性绵羊红细胞受体（E花环） 46 B B细胞表面标志的检测细胞表面标志的检测 n n 细胞表面抗原的检测细胞表面抗原的检测 n n 细胞受体的检测细胞受体的检测 47 细胞表面抗原的检测细胞表面抗原的检测 细胞 + cAb 间接荧光 酶免疫组化 48 细胞受体的检测细胞受体的检测 n n SmIgSmIg的检测的检测 n n c c受体和补体受体的检测受体和补体受体的检测 49 SmIgSmIg的检测的检测 可采用多价抗可采用多价抗Ig, Ig, 也可用抗各种也可用抗各种IgIg抗体抗体 ，人外周血，人外周血SmIgMSmIgM最多最多 n n 酶免疫组化法（包括法）酶免疫组化法（包括法） n n 荧光免疫法荧光免疫法: : 避免形成帽状结合物避免形成帽状结合物 50 c c受体和补体受体的检测受体和补体受体的检测 n n EAEA花环花环 n n EACEAC花环花环 51 原理 E+A（antibody） EA复合物 +B-FCR EA花环 FC受体的检测（EA花环） v检测B细胞，但单核、巨噬细胞等也有此受体 vRBC可选牛、人、羊等均可 vIgG抗体 52 E+A EA复合物+C EAC +B-CR EAC花环 补体受体的检测（EAC花环） v 检测B细胞 v 可选用牛、鸡等表面无FC受体的RBC v 避免EA花环，选IgM v 补体应新鲜、溶血能力低 53 T T细胞功能的检测细胞功能的检测 n n T T细胞增殖试验细胞增殖试验 n n T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验 54 T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验 n n 原理原理： 淋巴细胞 DNA合成 分化 母细胞 刺激物 细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松 55 淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物 n n 非特异性刺激物非特异性刺激物 PHA -TPHA -T细胞细胞 ConA -TConA -T细胞细胞 PWM -T BPWM -T B细胞细胞 LPS -BLPS -B细胞细胞 n n 特异性刺激物：特异性刺激物：异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原 56 形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h） DNA合成期 + 3HTdR掺入 收集细胞 检测射线 检测方法 测定细胞内的3HTdR 57 T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验 lymphocyte mediated cytotoxicity LMClymphocyte mediated cytotoxicity LMC 靶细胞抗原 T细胞 观察杀伤活力 原理： 致敏CTL 靶细胞 58 方法 形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞 同位素法 ：淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定射线 意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力 59 B B细胞功能的检测细胞功能的检测 n n B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验 n n B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 60 B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验 n n 抗抗IgMIgM n n 细菌脂多糖细菌脂多糖 n n SACSAC的的SPASPA B细胞增殖 形态学 3HTdR掺入法 61 反向空斑形成试验:体外检测人类Ig分泌细胞的方法 酶联免疫斑点法： B细胞分泌功能检测 62 染色计数 离心取上清 测LDH或AKP 离心取沉淀 测活细胞荧光 测发光强度 测CPM值 形态法 酶释法 荧光法 同位素法 化学发光法 自然杀伤细胞的检测自然杀伤细胞的检测 靶 细 胞 溶 解 常用靶细胞: K562细胞株 63 v 趋化 v 吞噬 v 胞内杀灭作用 吞噬细胞功能的检测 64 中性粒细胞功能的检测中性粒细胞功能的检测 v细胞运动功能的检测 v吞噬功能的检测 v杀菌功能的检测 65 细胞运动功能的检测细胞运动功能的检测 琼脂糖凝胶扩散法琼脂糖凝胶扩散法 66 白细胞吞噬功能的检测白细胞吞噬功能的检测 n n 1 12d2d全血等量菌液全血等量菌液 3730min3730min 推片、固定、染色、计数推片、固定、染色、计数 白细胞吞噬率白细胞吞噬率 吞噬细菌的细胞数 200个中性粒细胞数 100 吞噬指数 200个粒细胞吞菌总数 200个中性粒细胞数 100 67 白细胞杀菌功能检测的检测 溶细胞法 NBT还原法 化学发光法 68 n n 白细胞菌液白细胞菌液37培养 定时取定量菌液培养 计算菌落数 溶细胞法 69 中性粒细胞杀菌 耗能 代谢 生成H+ 四氮唑蓝(淡黄色) 甲簪(蓝黑色 ) 原理 操作 四氮唑蓝(NBT)还原试验 抗凝血+NBT应用液 温育 推片 瑞士复染 意义 70 化学发光法化学发光法: : 敏感敏感 发光 中性粒细胞杀菌 NADPH氧化酶激活 过氧化离子 SOD H2O2 髓过氧化物酶 鲁米诺 次氯酸和卤化物 杀菌 杀菌 71 巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测 n n 吞噬功能的检测吞噬功能的检测 n n 巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定 酸性磷酸酶测定酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定非特异性酶的测定 n n 巨噬细胞表面受体的检测巨噬细胞表面受体的检测 72 受检细胞+颗粒性抗原(鸡红细胞等) 涂片、染色、镜检 吞噬率 吞噬指数 吞噬功能的检测 73 酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 -甘油磷酸钠 酸性磷酸酶 磷酸盐 +硝酸铅 磷酸铅 +硫酸铵 黑色的硫化铅 酸性磷酸酶不稳定,细胞涂片需先冷固定, 处理不当,酶活性消失,封片后可保存 + 74 酸性磷酸酶的测定 偶氮法 -萘磷酸钠 酸性磷酸酶 萘酚 + 磷酸盐 +偶氮试剂 棕红色 封片后保存时间短 + 75 非特异性酯酶的测定 -萘醋酸 非特异性酯酶 萘酚 + 醋酸 +偶氮试剂 棕红色 + 非特异性酯酶比较稳定,临床上常用 76 Fc受体 EA花环 C3b受体 EAC花环试验 巨噬细胞表面受体的检测 77 第四节第四节 细胞因子及其受体测细胞因子及其受体测 定技术定技术 78 Cytokines CKCytokines CK 是指由活化的免疫细胞或非免疫细胞（如 骨髓或胸腺中的基质细胞、血管内皮细胞 、成纤维细胞等）合成分泌的、能调节细 胞生理功能、介导炎症反应、参与免疫应 答和组织修复等多种生物学效应的小分子 多肽，是除免疫球蛋白和补体之外的又一 类分泌型免疫分子。 79 80 A：