生物工程专业毕业论文cuc3基因rna干扰载体对烟草的转化及鉴定

摘 要 采用叶盘法通过已导入了构建好的表达载体的根癌农杆菌，对野生型烟草叶片进 行转化。烟草叶片在分化培养基 MS + 0.1mg/L NAA + 1.0mg/L 6-BA + 50mg/L Hyg + 500mg/L Cb 上 4 周后分化出芽；在生根培养基 MS +0.2 mg/L IBA +250mg/L Cb 上，1- 2 周后形成根；叶片 -葡萄糖甘酸酶（GUS）组织化学染色，阳性率为 75%；通过 PCR 检测潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因的 DNA 序列，获得 14 个阳性株系。在烟草 转化阳性株系中获得了 2 种表型：叶片融合和叶片缺失。 关键词关键词 根癌农杆菌；根癌农杆菌；GUS 组织化学染色组织化学染色; 聚合酶链式反应聚合酶链式反应( PCR) Abstract Agrobacterium with expression vector transformed the leaves of Nicotiana tabacum. Regenerated shoots were formed in 4 weeks when the leaves of N. tabacum cultured on shoot- inducing medium MS medium supplemented with 0.1mg/L NAA, 1.0mg/L 6-BA, 50mg/L Hyg and 500mg/L Cb. Shoots rooted on the root induction medium MS medium supplemented with 0.2mg/L IBA and 250mg/L Cb in 1-2 weeks. -glucuronidase(GUS) histochemical assay indicated that the GUS positive rate was 75%. PCR analysis of gene Hygromycin phosphotransferase(HPT) gene indicated that there were 14 positive lines. There were 2 distinct phenotypes in the positive lines: leaf fusion and leaf incompleteness. Keywords：Agrobacterium tumefacien; GUS staining; polymerase chain reaction (PCR) 目目 录录 第一章第一章 前言前言.1 1.1 烟草概述 1 1.1.1 烟草的生物学研究1 1.1.2 烟草的遗传转化研究进展1 1.2 根癌农杆菌转化体系.2 1.2.1 根癌农杆菌介导的分子机制.3 1.2.2 用根癌农杆菌进行基因转化的植物3 1.3 RNA 干扰4 1.3.1 RNA 干扰的定义.4 1.3.2 siRNA 基因沉默原理 4 1.3.3 RNA 干扰在植物中的应用.4 1.3.4 CUC3（Cup-Shaped Cotyledon3）基因.6 1.4 常用分子生物学实验方法 6 1.4.1 GUS 基因检测组织化学染色法6 1.4.2 基因组 DNA 提取（CTAB 法）.7 1.4.4 PCR 技术8 1.4.4 琼脂糖凝胶电泳8 1.5 立题的依据及目的.10 1.6 本研究的目的及实验内容.11 第二章第二章 材料与方法材料与方法.12 2.1 材料.12 2.1.1 植物材料.12 2.1.2 菌株.12 2.1.3 培养基.12 2.1.4 试剂.13 2.1.5 实验仪器.14 2.2 方法 16 2.2.1 烟草无菌苗的培养.16 2.2.2 菌株及培养.16 2.2.3 叶盘法浸泡转化及植株再生.17 2.2.4 烟草转基因植株鉴定.17 第三章第三章 结果与讨论结果与讨论.20 3.1 实验结果.20 3.1.1 转化植株的获得.20 3.1.2 GUS 组织化学染色法鉴定21 3.1.3 PCR 扩增检测阳性转基因植株22 3.2 转基因植株的表型特征分析.22 3.2.1 表型类型叶片融合.22 3.2.2 表型类型叶片缺失23 3.3 讨论 24 3.3.1 分化和筛选培养基的选择.24 3.3.2 报告基因的选择24 3.3.3 表型分析25 第四章第四章 结论与展望结论与展望.26 4.1 结论 26 4.2 展望 26 致致 谢谢.27 附录附录.31 1 第一章 前言 1.1 烟草概述 烟草在植物分类学上属于双子叶植物纲(Dicotyledoneae)、管花目(Tubiflorae)、茄 科(Solanacene)，烟属(Nicotinan)，是许多国家的重要经济作物之一。目前已发现的烟 草属有黄花烟、普通烟、碧烟三个亚属，14个组，共66个种。 烟属植物大多是草本，少数是灌木或乔木状，为一年生或多年生植物。烟属植物 大多数都能产生一种特有的植物碱烟碱，含量 0.510。烟碱是烟草中最具有生 理作用的物质，烟碱含量的多少直接影响烟制品的吃香味和劲头。烟草在世界上分布 很广，遍布亚洲、南美洲、北美洲、非洲及东欧的广大地区。从北纬 60到南纬 50 ，从低于海平面到海拔 2500m 的高原山地都有烟草分布。我国大部分地区都有烟草种 植，每年种植而积为 100 万 hm2左右，烟叶生产约为世界总量的三分之一， 是世界上 最大的烟草种植国1。 1.1.1 烟草的生物学研究 一年生草本，高 12 米。茎直立，粗壮，基部木质化，上部分枝，被有粘质毛。 叶互生；叶片甚大，呈椭圆状披针形，长 1030 厘米，宽约 815 厘米，先端渐尖， 基部稍下延成翅状柄，或稍呈心耳状，多少抱茎，全缘或带微波状，上面绿色，下面 淡绿色，被粘毛。圆锥花序或总状花序，顶生；花有苞和柄，柄长 45 厘米；萼绿色， 长圆形，长约 2 厘米，裂片披针形，先端尖锐；花冠漏斗形，长约 35 厘米，喉部稍 膨大，筒部粉红色，罕有白色，外面被软毛，裂片 5，先端锐尖，红色；雄蕊 5，花丝 与花冠等长或稍短；雌蕊 1，花柱长，柱头圆形，子房上位，2 室，胚珠多数。蒴果卵 圆形，长约 15 厘米，略超出宿存萼。种子细小，多数，黄褐色。花期 810 月。分布 于温带、热带地区。我国各地栽植者很多。主产山东、安徽、福建、湖南、湖北、山 西、四川及贵州等地。 1.1.2 烟草的遗传转化研究进展 烟草作为基因工程的模式植物，具有操作容易、培养周期短、遗传转化效率高、 生产成本低等优点。在过去的十几年里，烟草作为遗传转化的受体系统，在研究基因 功能，抗病毒基因工程，代谢产物合成等方面都有很多报道。 2 1.1.2.1 基因功能研究 孙建波等2将棉花生长素结合蛋白基因 cDNA（Ghabp1）导入烟草基因组，研究 目的基因的表达对烟草细胞的影响，发现转基因烟草与对照相比叶细胞增大，结果表 明，棉花生长素结合蛋白基因的表达影响了烟草叶细胞的发育。梁海泳等10将源于紫 穗槐的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）基因、反义 4-香豆酸辅酶 A 连接酶 （4CL）基因以及两者的双价基因分别转移至烟草中，观察这 2 个基因对烟草中纤维素 和木质素合成的影响，测定全纤维素和 Klason 木质素含量的结果显示，增强 UGPase 基因的表达可提高转基因植株的纤维素含量，但对木质素含量没有影响；抑制 4CL 基 因的表达可显著降低转基因植株的木质素含量，但对纤维素含量没有影响；转移双价 基因的转基因植株中纤维素含量增加而木质素含量降低。 1.1.2.2 抗病毒基因工程 王燕萍等3利用 RT-PCR 方法克隆商陆抗病毒蛋白（PAP）的 cDNA，获得了能够 抵抗多种病毒侵染的工程植株。颜培强等4：利用烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基 因构建 RNAi 干涉载体，通过叶盘法转化至烟草 K326 和龙江 911 两个栽培品种，抗病 性鉴定结果证实，转基因 K326 和龙江 911 两个栽培品种的转基因材料分别有 83和 90转基因株系对 TMV 呈现免疫级抗性。 1.1.2.3 生物反应器 利用转基因植物作为生物反应器生产有用蛋白，具有比细菌、真菌和动物反应器 系统更低耗能的优点5-7。与原核表达系统比较，烟草的表达产物可以进行正确的糖基 化等转录后的修饰。金赫日等8利用农杆菌介导法，将大熊猫生长激素基因（AmGH） 导入烟草进行表达，探讨植物基因工程生产大熊猫生长激素的可行性。余有本等9将茶 树咖啡碱合成酶基因cDNA通过导人烟草植株中，表达具有正常生物学活性的酶蛋白， 并能在烟草中合成咖啡碱，以期为利用生物反应器生产天然咖啡碱提供参考。孙艳香 10等人用根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系研究，并获得再生体系。 1.2 根癌农杆菌转化体系 根癌农杆菌及发根农杆菌同属于根瘤菌科，都是革兰氏阴性菌，均可侵染植物但引 起不同病症。根癌农杆菌诱导植物生成冠瘿瘤，而发根农杆菌使植物生成很多不定根， 不定根生长迅速，分支能力强。对根癌农杆菌的 Ti 质粒研究较多。 3 1.2.1 根癌农杆菌介导的分子机制 Ti（tumor-inducing）质粒是农杆菌细胞的质粒，为农杆菌染色体外的遗传物质， 正是它的存在可诱导植物产生冠瘿瘤。 Ti 质粒为双链共价闭合环状 DNA 分子，大小 约 200-250 kb。依据 Ti 质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根瘤农杆菌或 Ti 质粒可分为 4 种类型：章鱼碱型（Octopine） 、胭脂碱型（Nopaline） 、农杆碱型 （Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine） 。原始的 Ti 质粒根据其功能的不同，可分为 4 个区： （1）T-DNA 区(Transfer-DNA region)：它是在农杆菌侵染细胞时，从 Ti 质粒上切割下 来转移到植物基因组中的一段 DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与 T-DNA 本身的转移与整合无关。 （2）毒性区(Virulence region，vir 区)：该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组 中，但对 T-DNA 的转移和整合非常重要，这些基因也称为 Ti 质粒编码毒性基因(vir)。 （3）接合转移区(Region encoding conjucations，Con 区)： 该区段存在有与细菌间接合 转移有关的基因(tra)，调控 Ti 质粒在农杆菌间转移。 （4）复制起始区(Origin of replication，ori 区)：该区段调控 Ti 质粒的自我复制。 在遗传转化过程中除了 Ti 质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因 包 chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及 chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细 菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。 1.2.2 用根癌农杆菌进行基因转化的植物 自 1983 年第一株转基因烟草问世以来，植物的遗传转化已取得了令人瞩目的成就。 农杆菌介导法，因其具有易操作、低费用、高效率、插入片段确定性好和转基因拷贝 数低等独特优点， 已经成为转基因策略中的首选方法。在已获得的近 200 种转基因植 物中约 80是由根癌农杆菌介导完成的11。 已有多种双子叶植物，如烟草、马铃薯、番茄、大豆、甜菜、拟南芥和十字花科 植物等被成功转化。农杆菌介导的单子叶植物转化直到 20 世纪 90 年代后才取得一系 列进展至目前为止，利用农杆菌介导法已经将一些功能基因导入了水稻、玉米、小 麦等重要的单子叶植物中，并提供了详细的分子生物学和遗传学证据12。 4 1.3 RNA 干扰 1.3.1 RNA 干扰的定义 RNAi（RNA interference，即 RNA 干扰）是由外源或内源性的双链 RNA（double strand RNA）所引起的序列特异性基因沉默，是真核生物中一种非常保守的机制。 RNAi 可以抑制诸多真核基因的表达13。siRNA（small interference RNA，siRNA）即 小干扰性 RNA，是 RNA 干扰的引发物，不同的 siRNA 可以引导不同水平的 RNAi14。 1.3.2 siRNA 基因沉默原理 siRNA 是病毒感染细胞或发生转座子活动时产生的，最早是在植物中发现，能降 解其同源 mRNA 的 RNA 小分子，长度一般约为 22nt。RNA 干扰中，内源或外源双链 RNA 进入细胞后，经细胞内类似于 RNase的 Dicer 酶切割成长度为 21-25nt 的小分子 双链 RNA 即 siRNA，其中包括 5 个磷酸盐，2 个核苷和 3 个悬臂。siRNA 在 RNA 干 扰过程中起中心作用。 Dicer 酶与 dsRNA 结合，并将之切割为 2-25nt 的小片段（small dsRNAs） ，后者与酶复合物结合形成 RNA 诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex RISC)。双链 siRNA 在 ATP 存在的情况下，解成单链，复合物以反义链为模 板，特异识别 mRNA，若 mRNA 与靶序列不互补，则复合物很快从 mRNA 上脱落； 若互补，则复合物上的 RNA 酶在 mRNA 和 siRNA 结合区域的中间，将 mRNA 切断， 经多次反复，就可将一条完整的 mRNA 降解成多个 21-25nt 的小片段，这个过程也称 为转录后基因沉默（PTGS） 。RNAi 技术已成为研究生物发育和基因功能的一种工具。 通过制备特定的 siRNA 导入生物体内可以有目的地抑制靶基因的表达，同时也逐渐应 用于医疗、预防等领域。例如利用 siRNA 抑制 SARS 冠状病毒和 HIV 病毒等。 1.3.3 RNA 干扰在植物中的应用 RNAi 作为一种反向遗传学的研究方法，为后基因组时代的基因功能分析提供了一 种可靠而快速的应用技术平台。随着双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻测 序工作的完成，植物基因组学的重心已由结构基因组学转向功能基因组学，功能基因 的分析迫使人们需要一种高效、高通量的鉴定基因功能的技术，而 RNAi 技术适应了 5 这种时代需求，以其高度专一性和有效的干扰特性，可特异地使特定基因沉默，获得 功能丧失或降低的突变体，已成为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi 在植 物中的应用研究有以下几个方面15： （1）基因的功能分析。 Chuang 等16在花发育研究中采用 RNAi 技术进一步验证 AG、CLV3、APl、PAN 等已知功能基因，并开创了 RNAi 在植物功能基因组学中的应用。Gong 等17克隆了拟 南芥 SOS 家族样的蛋白激酶基因 PKSes 的一个成员 PKS18，构建了 PKS18 的 RNAi 载体，研究其转基因植株，发现由于 PKSI8 表达在转录水平上受抑制，并表现对 ABA 不敏感，证实 PKS18 与 ABA 信号转导有关。由于拟南芥是目前植物基因组资源研究 最深入的植物种类，所以 RNAi 技术在植物功能基因组中的研究主要体现在拟南芥功 能基因组的研究上。 （2）植物抗病毒研究中的应用 利用 RNA 干扰技术的原理可设计合成与病毒同源的 dsRNA，并将其导人植物体， 基于植物体的 RNA 干扰机制对病毒基因组进行特异性切割降解，阻止病毒的复制扩张， 从而保护植物体不受病毒危害。许多研究者正通过各种方式利用此技术进行植物病毒 方面的研究18，而其中应用最多的是利用农杆菌介导的转化将 dsRNA 整合到植物基因 组，然后检测转化体对病毒的抗性，或利用农杆菌瞬时转化系统，在 dsRNA 瞬时表达 期间对植物体进行病毒感染检测，以确定 dsRNA 介导的病毒抗性的有效性。Kalantids 等19在黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)反向重复序列的再生烟草植株中检 测到一个完全抗性的株系，并且发现烟草病毒抗性直接与 siRNA 的产生相关。 （3）基因表达与调控 在植物生长发育过程的某一时期，向植物基因组导入一定的 dsRNA，应用 RNAi 技术可介导抑制植物基因的表达，从而达到调控基因的目的。如 Fukusaki E20及同事 通过利用 RNAi 技术成功地诱导查尔酮合成酶-花青素和类黄酮生物合成中的一种关键 酶基因沉默，使花的颜色由原来的兰色变为白色或苍白色。 （4）作物品种改良 一些影响作物性状的基因可以通过 RNA 干扰技术和其它育种技术相结合，鉴定其 功能、位置等，有望用于数量性状的定位、克隆以及作图等。也可以对一些影响重要 经济性状的缺陷基因或不良基因进行 RNA 干扰，抑制其表达等，达到品种改良的目的。 如 Kusaba 等21采用 RNAi 技术生产出能降低麦谷蛋白表达水平的稻谷品种 LGC- 6 1（1ow glutenin content） ，给不能消化麦谷蛋白的肾病患者带来了福音；同时，此研究 还发现，RNAi 技术生产的 LGC-1 遗传性稳定，并能应用于单基因及多基因农艺性状 的研究。澳大利亚的 CSIRO 公司的 Wesley 等构建了多种适用于禾本科植物的 RNAi 载体-pHannibal 和 DKannibal 质粒载体系列，并利用此技术开发出抗大麦黄色侏儒病毒 的大麦品种。目前，虽然 RNAi 技术用于作物品种改良还处于初步研究阶段，但以其 高效性显示出巨大的应用前景。 1.3.4 CUC3（Cup-Shaped Cotyledon3）基因 高等植物的芽从种子中萌发后，其顶端具有分裂能力的细胞群趋于活跃，成长分 化为茎和叶。接着，茎和叶相连接的部位发生细胞分裂，分出新的侧枝。 最近鉴定的一个基因 CUC3（Cup-Shaped Cotyledon3） ，编码一个假定的 NAC 域转 录因子， 与 CUC1、CUC2 同源。最初发现 CUC 基因是在拟南芥中，CUC 基因突变 体中有子叶杯形融合的表型（图 1.1） 。在一系列茎端分生组织突变体和转基因个体中 CUC3 的表达暗示其在胚芽分生组织周围区域建立中充当一个主要角色22。CUC2 基因 与矮牵牛的 No Apical Meristem（NAM）基因同源性较高，而且功能也相似。 CUC1、CUC2 和 NAM 的表达模式说明，它们的功能是阻止间质细胞形成原基，从而 影响胚芽分生组织的维持和器官发生之间的平衡23。Casper 等24研究发现 CUC3 对侧 枝的发育、器官原基边界的界定和顶端分生组织的形成发挥主要作用。 最近Hibara等25的研究发现，在拟南芥中， CUC1、CUC2和CUC3基因在调控胚 芽分生组织形成方面有重要功能。使用不同组合的等位突变体，他们发现，CUC2和 CUC3基因功能与Lateral Supperssor（LS）基因重叠，是腋芽分生组织形成所必须的。 CUC基因负责胚芽分生器官的分界及分生组织的形成。 图 1.1 7 1.4 常用分子生物学实验方法 1.4.1 GUS 基因检测组织化学染色法 GUS 基因是目前转基因植物中应用最为广泛的报告基因。GUS 基因在转基因植物 中的活性检测方法有组织化学定位法、分光光度法、聚丙烯酰胺凝胶原位分析法等。 组织化学定位法是使底物进入被测得植物组织、细胞或原生质体中，通过显色反 应可直接或在光学显微镜下观察组织器官甚至单个细胞内 GUS 的活性，而不必从组织 中提取酶。目前常用于 GUS 组织化学定位的酶作用底物是 5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷 酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide，简称 X-Gluc） 。这一底物能在酶活性位点 形成蓝色沉淀物 26。GUS 作用于 X-Gluc 的初始产物为无色的吲哚衍生物，经过氧化二 聚化作用形成不溶的 5,5-二溴-4,4-二氯深色的靛蓝色物质，使得具有 GUS 活性的部 位呈现蓝色。这一二聚化作用能够在大气中的氧气作用下形成，植物体内的过氧化物 酶也能够促进氧化二聚化作用。 1.4.2 基因组 DNA 提取（CTAB 法） 1.4.2.1 CTAB 法提 DNA 原理 植物组织中绝大部分是核 DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白 （即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵， hexadecyltrimethylammonium bromide，简称 CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细 胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶 液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将 CTAB 与 核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀 CTAB 能溶解于乙醇中。 1.4.2.2 CTAB 法提取 DNA 应注意的几个问题 1）DNA 的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有 机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变 性条件。 2）抑制内外源 DNase 的活力。DNase 就像一把刀，它能把大分子 DNA 切成碎片， 所以要加以杜绝，现在可以通过多种途径来做到这一点：（1）低温操作；（2）调节 pH，使偏碱（pH=8.0） ；（3）抽提液中加表面活性剂；（4）加螯合剂（EDTA）除去 8 酶的辅助因子（Mg2+） ，使酶活丧失。 3）防止化学、物理等因素降解。不要过酸、过碱，也不要剧烈摇动。 4）为防止植物的次生代谢物（只要是细胞质内的多酚或色素类化合物）对核酸提 取有干扰作用，因此尽可能的选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取 DNA 的材料。 1.4.4 PCR 技术 PCR 中文全称是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） ，它是美国 Mullis 等 人在 1985 年发明的一种体外选择性扩增特定的 DNA 片段的核酸合成技术。PCR 方法 简便快捷，已成为检测转基因植物的有效技术之一。自发明以来，PCR 技术已在分子 生物学的各个领域，如在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面获得 广泛应用。 1.4.3.1 PCR 的基本工作原理 PCR 的基本工作原理是以拟扩增的 DNA 分子为模板，以一对分别与模板互补的寡 核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸 直至完成新的 DNA 合成。不断重复这一过程，可使目的 DNA 片段得到扩增27。 1.4.3.2 PCR 的基本操作 PCR 反应包括 3 个基本步骤，即变性、退火、延伸。 (1)变性：通过加热使模板 DNA 完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在 的局部双链也得以消除； (2)退火：将温度下降至适宜温度，引物与单链 DNA 模板上的目的序列通过碱基氢 链配对在局部形成杂交链。退火的温度及时间取决于引物的长度； (3)延伸：在中温下（72-78此温度 TaqDNA 聚合酶活性最高及热稳定性较强，能 达到 2000bp/min） ，通过 TaqDNA 聚合酶使引物从 5端向 3端延伸，随着 4 种 dDNA 的掺入合成新的 DNA 互补链，这样原来的一条双链 DNA，经过一轮反应循环后，就 形成两条双链 DNA。每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板。因此，理 论上每轮循环可使目的基因以指数形式（2n，n 为扩增循环数）扩增。经过 2535 轮 循环，目的 DNA 数量扩增达 2106-7拷贝。 1.4.4 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。 9 1.4.4.1 琼脂糖凝胶电泳的实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物的方法，这种电 泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达 到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移 动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大 小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型 的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：共价 闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。 这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA。 核酸分子是两性解离分子，pH3.5 是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一 个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3 时，碱基几乎不解 离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子 的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链 DNA 与等长 的双链 DNA 的泳动率大致相同。 1.4.4.2 影响核酸分子泳动率的主要因素 1)样品的物理性状:即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电 荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的 影响不明显。对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电 泳并测定其泳动率，然后进行 DNA 分子长度（bp）的负对数泳动距离作标准曲线 图，可以用于测定未知分子的长度大小。DNA 分子的空间构型对泳动率的影响很大， 比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNAIDNAocDNA 但是由于琼脂糖浓度、 电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。 2)支持物介质:核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖 是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同， 是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N-四 甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂 N,N-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成，其网孔的大小由 Acr 与 Bis 的相对比例决 定。琼脂糖凝胶适合分离长度 100 至 60 的分子，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp- 10 500bp）的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的 DNA 分子。 3)电场强度：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着 电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过 4V/cm。而对于大片段电泳， 甚至用 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 4)缓冲液离子强度:核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统，但它们各有 利弊。TAE 价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 TBE 缓冲液。在缓冲液 中加入 EDTA，可以鳌合二价离子，抑制 DNase，保护 DNA。缓冲液 pH 常偏碱性或 中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 1.4.4.3 琼脂糖凝胶电泳的显色反应 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁 平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时，出现 不同的效应。254nm 的紫外线照射时，灵敏度最高，但对 DNA 损伤严重；360nm 紫外 线照射时，虽然灵敏度较低，但对 DNA 损伤小，所以适合对 DNA 样品的观察和回收 等操作。300nm 紫外线照射的灵敏度较高，且对 DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 使用溴化乙锭对 DNA 样品进行染色，可以在凝胶中加入终浓度为 0.5g/ml 的 EB。EB 掺入 DNA 分子中，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，但是如果要 测定核酸分子大小时，不宜使用以上方法，而是应该在电泳结束后，把凝胶浸泡在含 0.5g/mlEB 的溶液中 1030min 进行染色。BE 见光分解，应在避光条件下 4保存。 1.5 立题的依据及目的 转基因是一种可以快速和定向改良作物品种的技术，由于烟草易于转化，目前已 成为转基因研究的受体模式生物，在过去的十几年里，烟草转抗除草剂，抗病毒、真 菌、细菌，以及用于基因标签研究的转座成分转化等都有很多报道。 RNAi（RNA interference）即 RNA 干涉, 是由外源或内源性的双链 RNA（double 11 strand RNA） ，dsRNA 导入细胞而引起的与 dsRNA 同源的 mRNA 降解, 进而抑制相应 基因表达, 可以抑制诸多真核基因的表达。RNAi 作为一种反向遗传学的研究方法，为 后基因组时代的基因功能分析提供了一种可靠而快速的应用技术平台。RNAi 技术以其 高度专一性和有效的干扰特性，可特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突 变体，已成为功能基因组学的一种强有力的研究工具。 最近的研究发现，CUC3 基因属于 NAC 转录因子家族，它对器官原基边界的界定 和胚芽分生组织的形成发挥主要作用。本研究将 RNA 干扰技术应用于烟草，沉默烟草 的 CUC3 基因，研究其在烟草里面的对器官分离的调控。由于目前烟草转基因技术及 基因沉默技术得到广泛研究和应用，为本实验的进行提供了理论和技术支持。 1.6 本研究的目的及实验内容 1）目的：利用已经导入目的基因的根癌农杆菌 AGL0（已经导入烟草 CUC3 基因 沉默表达载体） ，采用叶盘法转化烟草叶片，得到再生植株后，通过 GUS 组织化学染 色和 PCR 鉴定(以植株选择标记基因潮霉素基因片段设计引物)，证明是否导入目的基 因。初步观察阳性植株的表型。 2）意义：通过将已经构建好的 CUC3 基因沉默表达载体，利用根癌农杆菌途径对 烟草进行转化和实现转基因植株的再生。通过在烟草中沉默 CUC3 基因，可以进一步 了解烟草内 CUC3 基因功能，比如，CUC3 基因对器官分离发育的影响，是否影响其 他性状等。作为茄科重要代表作物，该研究将为同属该科的番茄、茄子、马铃薯及辣 椒等重要作物的 CUC3 基因功能的研究提供利用和借鉴。 12 第二章 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 植物材料 所用的材料为烟草（N. tabacum） 。 2.1.2 菌株 根癌农杆菌（A. tumefaciens）AGL0 菌株 (已经导入了 RNAi 表达载体 pCAMBIA1301-RNAi)。 2.1.3 培养基 MS 固体培养基：MS 液体培养基28（0.6%琼脂），pH5.8。（配方见表 2.1-2.3） YEB 培养基： pH 7.0。 （配方见表 2.4） 表表 2.1 MS 培养基配方培养基配方 试剂浓度生产厂家 MS 大量各种成分及浓度见下表 MS 微量各种成分及浓度见下表 甘氨酸2mg/L北京奥博星生物技术有限公司 VB10.5mg/L北京奥博星生物技术有限公司 VB60.5mg/L北京奥博星生物技术有限公司 烟酸 0.5mg/L北京奥博星生物技术有限公司 肌醇100mg/L北京奥博星生物技术有限公司 蔗糖30g/L北京糖业烟酒公司 FeSO4.7H2O27.85mg/L北京化工厂 琼脂6.8g/L(液体不加)北京奥博星生物技术有限公司 13 表表 2.2 MS 培养基大量元素配方培养基大量元素配方 试剂浓度生产厂家 CaCl2.H2O （或 CaCl2)440（或 330） mg/L北京化工厂 KNO31900 mg/L北京化工厂 KH2PO4170 mg/L北京化工厂 MgSO4.7H2O370 mg/L北京化工厂 NH4NO31650 mg/L北京化工厂 表表 2.3 MS 培养基微量元素配方培养基微量元素配方 试剂浓度生产厂家 MnSO4.4H2O （或 MnSO4.H2O） 22.3 (或 15.6) mg/L北京化工厂 ZnSO4.7H2O8.6 mg/L北京化工厂 H3BO36.2 mg/L北京化工厂 KI0.83 mg/L北京化工厂 NaMoO4.2H2O0.25 mg/L北京化工厂 CuSO4.5H2O0.025 mg/L北京化工厂 CoCl2.6H2O0.025 mg/L北京化工厂 表表 2.4 YEB 培养基配方培养基配方 试剂浓度生产厂家 酵母提取物1g/L北京双旋微生物培养基制品厂 胰蛋白胨5g/L北京双旋微生物培养基制品厂 牛肉浸膏5g/L北京双旋微生物培养基制品厂 MgSO4H2O 0.5 g/L北京化工厂 2.1.4 试剂 Taq DNA 聚合酶、4dNTPs、10PCR 缓冲液 RNase A、溶菌酶等购自 TaKaRa 公 14 司（大连） ； PCR 引物合成由上海英俊公司进行。PVP、-巯基乙醇、EDTA、CTAB 购自 Sigma；潮霉素、羧苄青霉素、各种植物激素、X-Gluc 均购自北京欣经科公司。 其他常规化学药品为分析纯或以上级别试剂（见表 2.5） 。 表表 2.5 实验药品规格及生产厂家实验药品规格及生产厂家 药品名称规格生产厂家 NaClAR北京化工厂 异丙醇AR北京化工厂 乙醇AR北京化工厂 氯仿AR北京化学试剂公司 异戊醇AR天津市福晨化学试剂厂 EBAR北京欣经科生物制剂公司 琼脂糖AR北京欣经科生物制剂有限公司 TBE 缓冲液-实验室自配 上样缓冲液AR实验室自配 DNA Marker 2000 plusAR北京天为时代科技有限公司 待测 DNA-实验室自制 常用溶液配置 2CTAB 配法： 100mmol/LTrisHCl(pH0.8),20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaCl,2%(m/v)CTAB 和 40mmol/L-巯基乙醇。 电泳上样缓冲液配法： 6缓冲液, 0.25%溴酚兰, 40%蔗糖 TE 缓冲液配法 Tris10mmol/L, EDTA1mmol/L, pH=8.0 2.1.5 实验仪器 实验仪器见表 2.6。 15 表表 2.6 实验仪器实验仪器 仪器名称规格生产厂家 离心管10mL国产 水浴锅HHS112北京京卫科学仪器厂 eppendorf 管1.5mL北京欣经科生物制剂有限公司 离心机3k30美国 Sigma 冰箱BCD-257sl海尔 试剂瓶1.5mL，2.0mL北京玻璃仪器厂 容量瓶25mL、50mL、100mL、200mL北京玻璃仪器厂 烧杯200mL、500mL北京玻璃仪器厂 移液枪10L、50L、1000L、5000L芬兰大龙 液氮罐10L四川金凤液氮罐 微波炉-LG 水平电泳槽DYCP-31D 型北京六一 2500 凝胶图像处理系统-上海天能 超净台-北京鑫宏程洁净工程技术有限 公司 电子天平0200g上海天平仪器厂 灭菌锅-江阴滨江医疗设备厂 紫外分光光度计-上海 MG96G 型梯度 PCR 仪-LongGen DYY-2 型稳压稳流电泳 仪 -北京六一仪器厂 DYCP-31D 型水平式电泳槽-北京六一仪器厂 WD-9403E 型手提式紫外分 析仪 -北京六一仪器厂 TGL-16 台式高速离心机-上海医用分析仪器 16 2.2 方法 2.2.1 烟草无菌苗的培养 选择成熟饱满的烟草种子，用 75%酒精浸泡少于 30s，再用无菌水冲洗 4 遍。然后 用 1%NaClO 消毒 20min 左右，用无菌水冲洗 5 次。经过表面消毒的种子种植在含有 50mL 不含激素的 MS 培养基中三角瓶中。暗培养 3 天后，光照周期为 16h/d，培养温 度为 251。 2.2.2 菌株及培养 挑取冻存的根癌农杆菌 AGL0（已经导入了 RNAi 表达载体 pCAMBIA1301- RNAi）在固体 YEB 培养基（含卡那霉素 50mg/L）划线，28培养 2 天后进行活化， 选取单克隆菌斑于液体 YEB 培养基（含卡那霉素 50 mg/L）中，28,200r/min 振荡培 养过夜，按 1：20 比例接种在 YEB 培养基中扩大培养 2-3h，至 OD600nm=0.5-1.0。然 后，将菌液 4000r/min 离心收集 10min，去上清，加入同体积的 1/2 MS 液体培养基混 匀, 28, 200r/min 振荡培养 20min。用于感染烟草外植体。 所用到的表达载体 pCAMBIA1301 的结构示意图（图 2.1） 。已经将目的基因插入 了多克隆位点。载体上的选择标记基因是：GUS 基因和 HPT 基因，用于筛选和鉴定转 化体。GUS 基因编码 -葡萄糖甘酸酶，可以通过组织化学染色法来鉴定；HPT 基因编 码潮霉素磷酸转移酶，可以用于转化后植物组织的潮霉素抗性筛选和 PCR 鉴定。 17 图图 2.1 植物表达载体植物表达载体 pCAMBIA1301 结构示意图结构示意图 2.2.3 叶盘法浸泡转化及植株再生 取在 28培养的 30 天的野生型烟草种子无菌苗，取其叶片切成 1cm2大小的小块。 放入上述活化的农杆菌菌液，在其中浸泡 20min 后，取出用无菌滤纸吸干，接入共培 养培养基（MS+0.1mg/L NAA + 1.0mg/L 6-BA） ，暗培养 3 天后，以无菌水冲洗后转入 筛选和分化培养基（MS +0.1mg/L NAA + 1.0mg/L 6-BA+ 50mg/L Hyg+500mg/L Cb） 。 2 周后有黄绿色的有潮霉素抗性的愈伤产生。再过 2 周有再生芽出现，当再生芽长至 2cm 高时，切下转至生根培养基（MS +0.2 mg/L IBA +250mg/L Cb） ，1 周后再生芽可 以形成根。当根生成后，转化苗进入正常生长阶段。 2.2.4 烟草转基因植株鉴定 2.2.4.1 GUS 基因检测组织化学染色法 GUS 基因（-葡萄糖甘酸酶基因）是我们所用的表达载体 pCAMBIA1301 上的报 告基因，用于筛选和鉴定转化体。通过组织化学染色法，使 GUS（-葡萄糖甘酸酶） 的底物进入被检测的植物组织，通过显色反应在光学显微镜下观察组织器官内的 GUS 活性。常用于 GUS 组织化学定位的酶作用底物是 5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷酸（5- bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide，简称 X-Gluc） 。这一底物能在酶活性位点形成蓝 色沉淀物。 组织化学染色的具体操作过程：将 X-Gluc 缓冲液（GUS 检测液）加入 96 微孔板 18 中，每孔加入 60L X-Gluc 液。将植物叶片取 0.5cm2小块，放入含有 X-Gluc 液的微孔 中。用粘性盖密封微孔板，在 37条件下温育过夜，然后在 26条件下温育 2 天。用 70%乙醇取代 X-Gluc 缓冲液去除叶绿素颜色。根据细胞中出现的蓝色对细胞进行记录， 然后在体视显微镜下观察拍照。 2.2.4.2 转化植株的 PCR 分析 1）烟草基因组 DNA 的提取（CTAB 法） 烟草 DNA 的提取采用 Rogers 等22的 CTAB 提取方法并加以改进。CTAB 法提取 DNA 步骤如下：取野生型烟草种子苗和烟草转基因植株作为样品。在 EP 管内加液氮 将样品研磨成粉末。分别将粉末转入 1.5mL 的 EP 管中，加入 0.6mL 经预热的 2CTAB 提取介质，在 65水浴保温 1h，其间缓慢摇动。4 13000rpm 离心 5min。吸 上清液到新的 EP 管中，并加入 0.5mL 氯仿/异戊醇（24:1）反复抽提，震荡 3min，4 13000rpm 离心 5min。重复抽提至中间层无白色沉淀。吸上清液于新的 EP 管中，加入 0.7 倍体积的异丙醇，振摇几次，混匀后置于-20冰箱中 20min。经 13000rpm 离心 15min 后所得 DNA 沉淀用 70%乙醇洗两次，置于超净工作台上吹干至管壁无肉眼可见 液珠为止。每管加入 20L 0.1TE 缓冲液（可先在 65水浴中预热）+1L RNA 酶 （10mg/mL） 。 2）转化植株的 PCR 分析 （1）引物设计 由于转入的基因是烟草自身也具有的，因此我们选择了表达载体上的选择标记基 因抗潮霉素基因 HPT gene（Hygromycin phosphotransferase gene，潮霉素磷酸转移酶基 因）进行 PCR 鉴定，根据 HPT 序列设计引物： HPTf: 5-ACTCACCGCGACGTCTG-3 HPTr: 5- TTCCTTTGCCCTCGGACG -3 使用此对引物，PCR 扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得约 1100bp 大小 DNA 片段的为阳性转基因植株。 （2）PCR 反应体系 25L 反应体系中，加入 Taq DNA 聚合酶 0.3L（5U/L） 、4dNTPs 0.6L(10 mmol/L)、10PCR 缓冲液 2.5L，正向引物和反向引物各 0.5L（10 mol/L） ，50ng DNA 模板（发根及再生植株的 DNA） ，加无菌水定容至终体积 25L 混匀。阴性对照 19 为烟草无菌种子苗。 （3）PCR 的反应条件 95预变性 10min，94 变性 40s，55.5退火 30s，72延伸 30s，共 34 个循环。 （4）琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物采用 1.0 %琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）进行电泳检测分析。 20 第三章 结果与讨论 3.1 实验结果 3.1.1 转化植株的获得 本实验利用野生型烟草的叶片，通过农杆菌 AGL0 浸泡法进行基因（即 CUC3 基 因的反义片段和 RNA 干扰片段）的转化。烟草叶片和农杆菌在共培养培养基上共培养 （暗培养）3 天后，转入筛选和分化培养基培养 2 周左右，可以看到黄绿色的有潮霉素 抗性的愈伤产生（图 3.1） ；再过 2 周后就可以分化出小苗（图 3.2） 。 图 3.1 烟草的抗性愈伤组织 图 3.2 烟草愈伤组织分化出芽 21 再将小苗转移到生根培养基，有利于小苗根系的发育。再过 1-2 周后即可生根 （图 3.3） 。 图 3.3 烟草再生出芽生根 3.1.2 GUS 组织化学染色法鉴定 我们用表达载体 pCAMBIA1301 上的报告基因 GUS（-葡萄糖甘酸酶基因） ，筛选 和鉴定转化体。在实验中通过组织化学染色法来检测 GUS 基因的表达，从而作为筛选 目的基因转化株的依据。 取培养 15d 的转化后再生的小苗的小片叶片，放入含有 X-Gluc 液的微孔中。用粘 性盖密封微孔板，在 37条件下温育过夜，然后在 26条件下温育 2d。用 70%乙醇取 代 X-Gluc 缓冲液去除叶绿素颜色。脱色后，根据细胞中出现的蓝色对细胞进行记录， 共检测 18 个株系，得到 GUS 染色阳性株系 14 株，阳性率为 75%。然后在可摄像的光 学显微镜下观察拍照（图 3.4）