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免疫学实验技术 抗体 l定义：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细 胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免 疫球蛋白。 医学应用： 科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色 质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等 1.诊断：各类血清学检测 ，抗人球蛋白测试，早孕 检测 等 2.治疗：单克隆抗体疗法 （类风湿性关节炎多发性 硬化症等），肿瘤治疗。 多抗来源 l动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具 有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体 。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决 定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被 激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞 ）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分 泌大量的抗体分子分布到血液、体液中，即为 多克隆抗体。 多克隆抗体制备 动物选择： 兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大 耳白） 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C, 昆明鼠） 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar 大鼠） 羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。 马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。 豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。 基本步骤 延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈 促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化” 佐剂的作用机理： 抗原制备： 商品化或自行表达 基础免疫：首次，抗 原用量大，用佛式完 全佐剂（Complate Freund adjuvand ,含矿物油,卡介苗等 )。 加强免疫：第2次以后，抗 原量减半，多次，间隔2-4 周，用佛式不完全佐剂 (Incomplate Freund adjuvand ,不含卡介苗). 取血测效价： 加强免疫两次或 三次以后的第7天取 血。 放血制备血清： 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉) 实验方法 l新西兰大耳白，2000g(雌雄均可),健康,无病原 l基础免疫 0.5ml抗原(含0.250.5mg蛋白或108颗粒抗原) 0.5ml佛式完全佐剂(CFA) 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射 l加强免疫 间隔2-4周,可进行多次 0.5ml抗原(蛋白量减半) 0.5ml佛式不完全佐剂(IFA) 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射 实验方法 l免疫34次以后从耳静脉取血检测效价 酶联法：1:104以上，能达到1:106。 免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64 l效价达到要求的可放血制备血清 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉) 多抗的特点 l多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综 合的性质。 l比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体 ，多种抗体都可与抗原结合。 l特异性相对较差：因为由不同性质的抗体组成，只要 其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多 抗更容易有交叉反应。 l 抗体的纯化、标记比单抗难：因为含有各种不同类型 、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血 清中含有的杂蛋白比较多。 什么情况下需要制备单克隆抗体 l目的蛋白有结构类似物 l抗原不纯，无法分开 l多抗效果不好（已排除非特异性反应） l希望将抗体用于治疗，研制成药品 l希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂 单抗制备原理 l如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到 由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合 成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 l1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的 基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的 小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂 交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗 体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单 个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。 l利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、 非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的， 而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能 保持同样的结构与机能。 单抗制备原理 HGRPT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 TK：胸腺嘧啶核苷激酶 HAT：次黄嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A) 基本步骤 实验方法 l免疫小鼠 l选择体重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制备抗原免疫。50 100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹 部皮下多点注射0.5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体 积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每 只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进 行融合。 l细胞融合 l取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的 比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min ，去除培养基，用50% PEG（Sigma）作为融合剂，在37下水 浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养 基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装 到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37，5%CO2的细胞培养器 皿中培养。 阳性细胞筛选 l细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细 胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。 l阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法，用包被液稀释成110ug/mL的抗原100ul/孔包被 ELISA板，4过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用110的脱脂奶粉或 13 BSA或36牛血清封闭30-60min;加入阳性孔培养上清100ul/孔，37 12 小时 ；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（ Sigma公司）100ul/孔，37 12小时，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色， 2mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD492的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。 获分别对上述抗原有特异性反应的阳性孔。 l筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获对上述抗原有特异性反应的杂交瘤细胞 株。细胞株进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。 杂交瘤细胞的冻存 l杂交瘤细胞通常用含有8-10%的二甲亚砜和20小 牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保 存多年，在-80中可以作3-6个月短期保存。冻存细 胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速升温，这样可以 确保细胞有较高的存活率。 单克隆抗体腹水制备及纯化 l取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma ），7-10天后腹腔注入5-10105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可 见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000rpm离心3min，收集上 清液，即为单克隆抗体腹水。 l辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体：取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边 搅拌，4澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用 50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4放置2小时，3000rpm离心 20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4流动透析24小时 后即获纯化的腹水抗体，-70保存。 其他抗体纯化方法 q盐析法（硫酸铵沉淀) q离子交换法 q亲和层析法 q凝胶过滤法 盐析法（硫酸铵沉淀) l原理 在高浓度中性盐存在下,蛋白质在水中的溶解度降低而产生沉淀 硫酸铵是最常用的中性盐 不同蛋白质的盐析常数不同 硫酸铵的加入量通常以饱和度表示 (100%饱和度:767g/L) 特点 成本低，步骤简单。 抗体的回收率比较高。 抗体纯度比较低，电泳后可见到明显的杂带,不适合于做各种标 记。 需要高速离心机。 正辛酸-硫酸铵沉淀法 l原理 两步沉淀： 先加正辛酸去杂蛋白. 正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下(pH4.5)可使大分子的杂蛋白 沉淀. 后加硫酸铵使抗体沉淀. n特点 成本较低，步骤较复杂。 抗体回收率很低。 抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种标记。 需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。 离子交换法 l原理 利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离 . DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基) 将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷. 采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分 . 特点 成本较低，步骤较简单。 抗体回收率较高。 抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适合于各种标记。 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 需要冷柜，自动收集器。 亲和层析法 l原理 利用蛋白质之间的特异性结合 （抗体-抗原，受体-配体） 将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配的物质。 洗脱一般采用改变pH值的方法 特点 成本较低，步骤较简单。 抗体回收率较高。 抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适合于各种标记。 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 需要冷柜，自动收集器。 凝胶过滤法(分子筛) l原理 将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经路径的差异,使 不同分子质量的组分分离. 大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小 分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。 适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD) n特点 成本高，步骤较简单。 抗体回收率较高，分离条件缓和，抗体活性不受影响。 抗体纯度较高。 需要自动收集器。 纯化方法选择原则 l不需要纯化则不纯化；（具体应用） l依据后续实验需求及实验室条件。 腹水效价测定 l用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效 价，腹水效价在10-5-10-7之间的可用于实 际应用。 单抗与多抗比较 单抗 多抗 抗体组成 单一 复杂 抗体性质 个体的属性 群体综合的性质 纯化标记 容易，效果好 难度高一些 种属来源 绝大多数是小鼠 兔、羊、豚鼠等 制备周期 长 (最短4个月） 短（2个月） 制备技术 复杂 简单 经费 多 少 l酶联免疫吸附试验（ELISA） l蛋白免疫印迹（Western blot） l免疫荧光技术（IF） l免疫共沉淀（Co-IP) l染色质免疫共沉淀（Ch-IP) ELISA基本原理 l酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记 的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 l在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面 的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗 体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体 ，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中 受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催 化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故 可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 lELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中 有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂“（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）； （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。 常用ELISA方法 l1）直接ELISA：待测抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特异性的酶-特异性抗体 偶联物。因为所用的酶已经标记在特定的抗体上，可检测的病毒种类只能局限于某一种。 l2）间接ELISA：先用抗原包被微量滴定板，然后加入待测抗体，再加入酶标抗体。与直接 ELISA相比，间接ELISA适用的范围更为广泛，并且特异性也较好。 l3）夹心ELISA：使用俘获抗体（包括单抗和多抗）包被微量滴定板，其余步骤同间接 ELISA。根据包被抗体种类的不同，又可以分为同种单抗夹心ELISA，异种单抗夹心ELISA ，多种单抗混合夹心ELISA和多抗夹心ELISA等几种方法。与间接ELISA相比，夹心ELISA 多了一步以抗体俘获富集抗原的过程，因而其灵敏度和特异性也相应提高。但是对有些病毒 的株系，夹心ELISA并不是很好的选择。这可能与单克隆抗体识别的是蛋白亚基的抗原表位 还是病毒粒子表面的抗原表位有关 基本步骤 l包被 l封闭 l孵育 l洗涤 l显色 l结果测定 基本步骤 l包被： l将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。 l 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是 蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作 用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、 浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏 水基团，故更易吸附到固相载体表面。 不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的 抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。 亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固， 已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。 脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中 ，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包 被的1/10乃至于/100。 l包被条件： 包被液：pH9.6碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液、 pH7-8的Tris- HCL缓冲液。 l加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2小时。包被浓度 随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合 物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。 l包被缓冲液的选择要依靠你所包被的物质而定，没有绝对的选择，但有 一个原则就是要尽可能的保持包被物的活性不被损失。目前常用的包被 缓冲液有PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液等，一般来说，缓冲 液的pH要大于蛋白质的pI，以保持其活性。 l碱性包被液如碳酸缓冲液用的较多，尤其是在小分子和载体蛋白的偶联 物的包被，其主要的优势在于碱性环境可以使蛋白更容易与板子结合。 也有用PBS和柠檬酸缓的，但是比较少见。 l洗涤： lELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。常用的 洗涤液为含0.05% 吐温20的磷酸盐缓冲液，洗涤3次，5 min/次 。 l清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质 。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应 把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 l可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。 l封闭： l封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程 。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而避免ELISA后续 步骤中抗原或抗体与固相载体的直接吸附。 l常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比 较价廉，可以高浓度使用（5%）。 l 所有的ELISA固相均需封闭。 l孵育： l抗原抗体完成反应的保温过程称为孵育，通常37孵育0.5-1 h。 l应注意孵育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操 作时，一次不宜多于两块板同时测定。 l显色： l于各反应孔加入临时配制的TMB底物溶液0.1 ml，37反应10-30 min。 l显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度 和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色 ，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加 速显色进行。 l结果测定： l于各反应孔加入2M硫酸0.05 ml，终止反应；拭干板底附着的液 体，然后将板正确放入酶标比色仪中。于450 nm处，以空白孔调 零后测定各孔OD值。 l结果判定： l目测定性法：加入底物经酶解和终止反应后，肉眼观察阳性孔颜 色明显深于(竞争法则浅于)阴性对照；与阴性对照的颜色接近者 ，判定为阴性。 l以P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性；P/N 值小于2.1，但大于1.5为可疑；P/N小于1.5为阴性。 对照设定 l阳性对照和阴性对照是检验试验有效性的控制品，同时也是作为 判断结果的对照。 l阳性对照的基本组成应尽量与检测标本的组成一致，多以含蛋白 保护剂的缓冲液为基质。 l阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。 l参考标准品：定量测定应含有制作标准曲线用的参考标准品，应 包括覆盖可检测范围的4-5个浓度。 ELISA的应用 lELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检 测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。 l检查抗原和半抗原方面：在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜 促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，其敏感 性与RIA相当，在血液学方面可用于检查凝固因子（如第凝固因子） 、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等，在肿瘤方面已试用检 查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）。 l检查抗体方面：用ELISA间接法检查抗体，已获得对多种传染病和寄生 虫病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方 面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓 浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断；在免疫性疾 病方面有试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过 敏原的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等；在 卫生学方面，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。 免疫印迹（western blot） 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝 酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNADNA 杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印 迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分 析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern印迹法。 埃德温迈勒萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern） 基本原理 应用范围 l检测组织、细胞中蛋白的表达情况（定性、半 定量） 6.最后加上相应的 底物溶液，当二抗 上的酶催化底物产 生化学发光时,用X 光片曝光，洗片后 就会产生可见的区 带，指示目的蛋白 质的位置和强弱。 3.通过电泳将蛋白样 品分开。 5.印迹首先用封闭液（如5 的脱脂奶粉）处理以封 闭固相载体上剩余的疏水 结合位点，而后用目的蛋 白的抗血清（一抗）孵育 ，印迹中只有目的蛋白质 与一抗特异性结合。洗去 游离的一抗后，用再与酶 标记的二抗孵育 4.将电泳分离的蛋 白从凝胶转移至一 种固相支持体.转 移后的硝酸纤维素 膜就称为一个印迹 （blot），用于对 蛋白质的进一步检 测。 1.提取细胞 或组织蛋白 ，测定总蛋 白浓度 2.测定总蛋白浓 度，并处理样品 基本步骤 细胞总蛋白的提取 l提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取 蛋白质的方法很多， 鉴于后续实验对蛋白性质的要求不同，因此很难 找到一种万能的裂解方法。 n 不论采用那种方法，都应遵循以下原则： 1尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 2细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可 以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂的种类很多，要根据具体情况具体选择。本实验 中选用PMSF(苯甲基磺酰氟)作为蛋白酶抑制剂。 3样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80。切勿反复冻融已制备好 的样品。 BRIPA buffer： Tris-HCl 50 mM, pH 7.4 NP-40 1% 去氧胆酸钠 0.25% NaCl 150 mM EDTA 1 mM 目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续实验的需求 A细胞总蛋白裂解缓冲液(100 ml)： 1 PBS 80ml Tritonx-100 1ml 去氧胆酸钠 0.5g SDS 0.1g 补1PBS缓冲液至100ml. 注意事项： 1.注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进有 致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗。 2.所用离心机需提前预冷。 3.为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。 4.吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。 n Western Blot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须尽量使各组 之间总蛋白量基本一致; n 蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定; 蛋白质含量太高则会 使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力 基于以上两方面原因，在进行蛋白电泳之前，先要对提取的总蛋白进行含量测定 蛋白定量 l目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩尿法（Biuret法） 、Folin酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法（ Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸 收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较 复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准 蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于 任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可 能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优 缺点。 蛋白定量方法 SDS-PAGE电泳 lSDS 是一种离子性的表面活性剂,它有强离子性的硫酸根离 子也带有疏水性的长碳链。 l当 SDS 与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质的疏水性 氨基酸结合将蛋白质包起来,而以磺酸根离子外露与水分子 作用。大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重 量为单位),而蛋白质结合固定比例的SDS 后 ，由于 SDS 带强负电荷，使蛋白质原先所带电荷显得微不足道,且每单 位重量的蛋白质所带电荷一致 ，所以不同蛋白质的迁移率 大小就主要由蛋白分子大小这一主要因素决定。 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于灌胶 的聚丙烯酰胺的浓度和交联度 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度(%) 线性分离范围 KDa 15 10-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212 l1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容易 吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴手套及口罩 l2.过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制 l3.溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃夹槽中 l4.为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的4蛋白质电 泳上样缓冲液 l5.正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由上向下 方向电泳 l6.电泳尽量在4冰箱中进行 注意事项： 转膜 l凝胶电泳结束后，将凝胶上分离的蛋白条带通过转移电泳方式转 印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC （硝酸纤维素）膜、 尼龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。 l选择膜的主要根据有： 1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的 载量） 2.膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小） 3.不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显色方法，信噪比好 ） 4.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要 根据不同目的来挑选不同的转移膜 - 滤纸 凝胶 膜 滤纸 + l1.转膜液最好现配现用 l2.检查样品凝胶是否与转移槽的 “-”侧保持一致 ，以确保样 品蛋白由凝胶转移至膜上 。 l3.NC膜应小心操作，防止破裂 注意事项： l转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增强化学发光）发光 或DAB（3,3二氨基联苯胺）显色技术检测目的蛋白。 n ECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗上标记 的辣根过 氧化物酶(HRP)，使底物发生氧化还原反应，从而产生化学。 固相免疫检测 lDAB显色原理：DAB在HRP作用下形成红褐色不溶产物 ，从而指示 目的蛋白位置及强弱。 lECL发光相对于DAB显色而言，具有发光持久，灵敏度高(一般可 达到pg级以上 )等优点，且DAB具有致癌性。 l应用化学发光，膜可以再生检测其他蛋白。 l1.处理膜的过程中，切勿使膜干掉 （否则导致背景增高） l2.选择合适的一抗及二抗浓度（浓度高不一定效果好，过高会导致 背景变黑） l3.选择合适的封闭液 （如果膜需要再生，最好选用脱脂奶粉，而 非BSA） l4.应考虑试剂的发光强度及其衰灭时间，来选择合适的曝光 时间 注意事项： 一、膜上没有信号 答：原因有很多：1 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；2 细胞中的蛋白质被降解掉了，必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制剂 ，抑制蛋白酶活性，并且提取过程冰上操作；3 转膜过程出现失 误；4 抗体或酶失活，选择在有效期内的试剂；5 抗体不能识别 目的蛋白，多看看说明，看该抗体是否适用于western。 结果分析 二、目的带很弱 答：1 标本中靶蛋白含量低，可以加大样品的上样量。2 转 膜不充分，可以通过提高转膜电流或延长转膜时间来解决。3 抗体效价低，可以减少抗体的稀释倍数，增加抗体浓度。 三、胶片背景很脏，有什么解决方法？ 答：1 膜没有均匀浸湿，PVDF膜转膜前应该用100%甲醇将 膜完全浸湿10秒，快速激活；2 膜或者缓冲液污染，拿取膜 与吸水纸时要戴手套，及时更换新鲜转膜缓冲液；3 封闭不 充分，延长封闭时间；4抗体与封闭剂出现交叉反应，检测一 抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应，如果有，考虑更换封闭 液；5抗体浓度过高，增加抗体稀释倍数 四、条带中出现单个或多个白点？ 答：膜和胶块存在气泡，转膜时赶尽膜和胶块之间的气泡 五、制备的凝胶不平？ 答：胶板洗刷干净，加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部 分胶块聚合不均匀，温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀， 室温较高时，操作应迅速。 六、用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？ 答：一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性； 而用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定 。 七、检测到的抗原分子量是资料上的两倍，是怎么回事？ 答：抗原形成了二聚体。增多-巯基乙醇的量，煮沸变性时间 延长，可以打开二聚体。 八、做western必须要内参吗？ 答：内参起着校正总蛋白上样量的重要作用，只有在内参条带 基本均匀一致的情况下，目的蛋白条带出现的差异才有意义,表 明的确是实验设计的干预因素造成目的蛋白量的变化，而不是加 样误差造成目的条带含量的变化.所以内参是必须做的。 MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, May 2005, p.35633574MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, May 2005, p.35633574 内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基 因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，一般 要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白 作内参。 内参名称分子量大小适用范围 Tubulin55kD胞浆和全细胞 VCDA1/Porin31kD线粒体 COXIV16kD线粒体 Lamin B166kD细胞核 TBP38kD细胞核 八、非特异条带多 答：1 抗体特异性不够，考虑使用单抗，保证抗体的特异性；2 蛋 白降解，应尽量使用新鲜制备的样品，提取后一定要分装，避免 反复冻融。 九、曝光后出现反像 答：HRP含量过高导致，建议降低二抗的使用浓度 免疫荧光技术（ immunofluorescence ，IF） l定义：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起 来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。 l原理：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上 荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子 探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中 形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本 ，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见荧光所在 的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定 量技术测定含量。 3T3 LinePtK1 LineNBL-6 LineRK13 Line Longitudinal FissureBlood VesselsCerebellum 定位 直接法：荧光素标记的特异性抗体 直接与相应抗原反应。 间接法：特异性抗体与相应抗 原反应，荧光素标记的抗抗体 再与第一抗体结合。 分类 实验方法 l将培养好的贴壁细胞用PBS轻轻漂洗2次(PBS提前置室温)，避免细胞 脱落； l4%多聚甲醛室温固定30min (静置)； lPBS涮洗3次，然后摇床缓慢摇洗5min3次； l0.5% Triton-100室温缓慢摇30min，涮洗3次； l用与二抗同源的血清（10%），室温缓慢摇晃封闭1h ，置湿盒内； l用烧杯装PBS，涮洗玻片一次； l用纸将PBS吸干后，滴加一抗（约100 ul），4度过夜，置湿盒中。鼠 抗LRP16（1：100），兔抗p65（1：150）； lPBS涮洗次，摇床摇洗10min次； l用纸将PBS洗干后，滴加二抗（羊抗鼠FITC1：200，羊抗兔5941 ：600）,湿盒，避光！室温h，加二抗以后所有操作均应避光； lDAPI染核min（用PBS按1：2500稀释）； lPBS涮洗次，摇床慢速摇洗10min次； l封片：甘油PBS（1：1），每张片子约需13ul； l共聚焦显微镜观察结果或