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疟疾快速诊断技术的 研究与应用 湖北CDC传染病所 袁方玉 主要内容 前言 显微镜镜检用于疟疾诊断 荧光显微镜用于疟疾诊断 PCR方法用于疟疾诊断 免疫学用于疟疾诊断 1、疟疾诊断试剂基于的靶抗原 2、诊断试剂基于的免疫学原理 3、疟疾诊断的快速诊断试剂 前言 疟疾是广泛分布于热带、亚热带及温带边缘地区的一 种重要蚊媒传染病，弓l起世界范围内的较高的发病率和死 亡率， 简便、快速和可靠的检测手段对提高临床疗效和控 制流行具有重要意义。传统的厚、薄血膜姬氏染色镜检浩 仍是当前疟疾诊断的主要方法，但费时费力，需专业培训 人员，且对低原虫血症者易漏诊 这些不足促进了更敏感、 简便，更快速的新技术的发展，如荧光染色镜检 组氨酸富 集蛋白和疟原虫乳酸脱氢酶抗原检测及PCR技术等。 世界卫生组织召开的专家研讨会上认为疟疾的 诊断方法应准确、敏感、低廉快速方法应能检出 每微升100个原虫，检测时间应在1小时内完成检 测。 一、显微镜镜检用于疟疾诊断 显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾诊断 技术(金标准） 主要优点 - 特异高 - 能区分虫种 - 能分期 - 能计数 - 1小时内能完成诊断程序 缺点 - 要求有较高的技术素质 - 容易漏检（恶性疟） - 大规模镜检费时、费力 - 敏感性低（原虫感染率为0.01%，厚片的 敏感性是薄片的10倍） 二、 荧光显微镜用于疟疾诊断 研究发现，一些荧光素对核酸有好的亲 和力，经一定波长的紫外线激活，原虫核 酸可通过荧光显微镜观察到。 目前常用的荧光染色剂: - 有吖啶橙（AO） - 苯并硫羟基嘌呤（bcp） - 若丹明-123一种红色的荧光染料，主要作 用于细胞膜，也常用于原虫染色 FIG. 1. Trophozoites of P. falciparum stained with AO in the QBC UV fluorescence method 吖啶橙（AO）优缺点： 染色需要较高的技术，辨认非特异性着 色因子，特别注意区分豪厄尔斯氏体同原 虫的区别，这种豪厄尔斯氏体来自溶血性 贫血的病人。一般来说，吖啶橙染色法检 测原虫的敏感性为41-93%,为 100原虫/1 微升血液,相当于0.002%感染率。检测恶性 疟的特异性为93%。检测间日疟和其他非 恶性疟原虫的后期原虫的特异性只有52% 。 染色优缺点： 染色后疟原虫厚血膜在倍 荧光显微镜下见，疟原虫各发育期及滋养 体、裂殖体和配子体呈特异性苹果绿色荧 光；胞桨疟色素呈黄色；白细胞胞桨染成 亮绿色。血膜中的异物不呈荧光色，易区 别。 FIG. 2. Trophozoites of P. falciparum stained with BCP in the fluorescence method. 染色恶性疟与间日疟血片，敏感 性为、，特异性为 、，阳性预测值 、阴性预测值与 。认为染色法是一种有使用价 值的疟疾诊断新方法。 若丹明-123： 一种红色的荧光染料，主要作用于细胞 膜，也常用于原虫染色 ，目前用得不多。 三、PCR方法用于疟疾诊断 PCR方法严格来说不能算是疟疾的快速 诊断方法，他的主要特点是敏感性高，能 检出每微升少于5个原虫的血液样本。复式 、多层和荧光定量PCR方法可用于疟疾的 定性和定量诊断，这对哪些形态学难以鉴 别的样本来说非常有价值。 （一）疟原虫检测的常用的分子标志 有环子孢子 (CS)、18SrRNA片段、裂 殖子表面蛋白一1(Msp一1)、裂殖子表面 蛋白一2(Msp一2)及富组氨酸蛋白(m )基因 等 CS是疟原虫子孢子表达的一种期特异性表面抗原的 基因。已发现通过测定CS基因序列的重复结构可进行疟 原虫分类了解其遗传特征和地理来源。自1984对CSP 基因序列进行测定以来，已积累了大量CSP基因资料， 至今为止有中美洲、南美洲、东亚、东南亚、南太平洋 岛屿开展间日疟原虫CSP基因序列分析问日疟原虫 CSP中央重复区由1521个9肽重复单位组成，每单位由 27个核苷酸编码9个氨基酸，目前已发现两类明显不同的 9肽重复单位，分为PvI型和PV一型I型按9肽单位 氨基酸序列变化分为温带族和热带族，两族序列差异明 显分布有一定局限性。 （二）优缺点： - PCR方法也可用于研究原虫的种群差异、 突变和对药物的抗性 - 敏感性高。能够检测到感染率为0.00001% 的恶性疟原虫血样，以及感染率为 0.0000126%的间日疟血样。 - 利用套式和逆转录PCR方法能鉴定4种疟原 虫， 一般PCR方法也存在着产物的污染易致假 阳性，不能在一次检测中鉴别虫种，也不 能诊断混合感染。 需特殊设备，不能用于现场 费时，成本高 四、免疫色谱方法 （一）原理 免疫色谱技术其原理为利用硝酸纤维素膜(NC)制备免疫层析测试 条，在NC上包被被检抗原的一株单抗作为捕获带，同时，将另一株 单抗偶联在胶体金或乳胶上作为检测试剂。当样本溶液和检测试剂 通过捕获带时，二者形成的复合物即被包被在膜上的抗体捕捉，如 果样品中含有被检抗原，则捕获带可发生颜色反应，颜色反应的强 弱与样本中的抗原浓度成正比。这些产品从取血、反应、结果判断 ，只需510分钟，而且多个样本可同时进行检测不需特殊仪器，非 常适合于边远山区基层医院、卫生所防保医生和村医应用。 FIG. 3. Principle of immunochromatographic RDT for malaria （二）疟疾诊断试剂基于的靶抗原 1、水溶性蛋白HEP（histidine-rich proteins）。研究表 明恶性疟原虫感染红细胞后，由感染的红细胞分泌三种 含有大量组氨酸组成的水溶性抗原，它们是HRP-1/HRP- 2和HRP-3。HRP-2由感染疟原虫的红细胞大量分泌，其 含量在整个红细胞内期随裂殖子的分裂逐渐升高。这一 抗原只由无性体中和早期配子体产生，量大，且较稳定 ，是用于恶性疟诊断的首选。同HRP-1和HRP-2比较， HRP-3在血液中的量很少，目前还没有针对它的试剂盒 2、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase ，LDH) 乳酸脱氢酶是糖酵解途径的终止酶，由疟原 虫的无性期和有性期产生。先前的研究揭示了 pLDH同宿主动物LDH在理化、免疫学特性和酶 学方面有很大的差异。另外四种疟原虫产生的 pLDH有不同的异构体，具有种、属特异性，因 而目前将它作为快速检测试剂第二选择的靶抗原 。 3、醛缩酶（aldolase） 醛缩酶是一种果糖二磷酸醛缩酶，可催化1，6-二磷 酸果糖，生成磷酸二羟丙酮及磷酸甘油醛，由疟原虫的 无性期和有性期产生。四种疟原虫都能检测到。一些研 究建议将此酶作为快速诊断的靶抗原，目前仅限于研究 。 （三）快速诊断试剂 1、ParaSight-F。ParaSight-F法为世界卫生组织推荐的应用产品，检测 原虫的靶抗原为HRP-2。和厚血膜镜检比较，现场评估结果显示在原虫 密度大于100个微升，原虫感染率0.002%时，检测恶性疟的敏感性平 均为7798%，特异性8398%。当患者HRP-2分泌少，血液中HRP-2 水平低时，ParaSight-F法可能出现阴性结果，同PCR法比较， ParaSight-F的检测低感染率患者的敏感性低于PCR法。 2、ICT pf和 PATH Falciparum Malaria IC。ICT pf。 ICT pf （ICT1）诊断卡用于检测恶性疟，也是基于检测HRP-2 抗原。该诊断试剂由于操作简单，所需仪器少，结果易于判断，赢 得了越来越多的使用者。缺点是只能检测恶性疟，如果用于检测其 他疟疾可能造成漏检或误诊；其次不能用于诊断混合感染；第三有 报道于内风湿因子起交叉反应，导致假阳性。 FIG. 4. Amrad ICT Pf immunochromatographic test device for detection of P. falciparum HRP-2. 3、OptiMAL。 OptiMAL诊断试剂是基于检测原虫代谢产物乳酸脱氢酶，目前 OptiMAL乳酸脱氢酶检测试剂盒是在层析条上包被两株LDHpf单抗 ，一株为恶性疟种特异性单抗，另一株为能与四种人疟原虫都反应 的属特异性单抗。此诊断方法在实验室和现场条件下都已进行了评 估，同镜检法相比，恶性疟原虫的敏感性和特异性在分别为88和 99 ，问日疟分别为94 和100。在评估中也发现，感染率小于 0.002%的血样OptiMAL检测有3%的阴性 FIG. 5. OptiMAL immunochromatographic test device for the detection of pLDH. TABLE 1. Results of routine blood samples examined for malaria by microscopy compared to OptiMAL rapid dipstick testa No. of samples and species present by microscopyNo. OptiMAL positive Sensitivity (%) Plasmodium falciparum 54 with parasitemia of 1% (50,000 parasites/l)54 100 103 with parasitemia of 0.11% (5,000 parasites/l)103 100 72 with parasitemia of 0.010.09% (500 parasites/l)72 100 32 with parasitemia of 0.0010.009% (50 parasites/l)23 72 11 with parasitemia of 0.00010.0009% (5 parasites/l)8 73 5 with gametocytes only 4 80 Plasmodium vivax 110 (all asexual stages) 105 96 Plasmodium malariae 17 (late trophozoites) 8 47 Negative 214 (no malaria parasites found)0 100 TABLE 2. Results obtained by microscopy and OptiMAL from sequential blood samples from 60 patients receiving therapy for P. falciparum malariaa Sample collection time No. of patients with positive microscopic parasitemia Mean parasitemia (%)No (%) OptiMAL positive Sensitivity (%) of OptiMAL at this parasitemia from initial samples Day of diagnosis (Pretreatment)602.4358 (98)100 Day 1 posttreatment511.9639 (76)100 Day 2 posttreatment440.52527 (61)100 Day 3 posttreatment290.1118 (62)100 Day 4 posttreatment160.03111 (68)100 Day 5 posttreatment80.00223 (38) 72 TABLE 3. Comparison of methods for diagnosing Plasmodium infection in blood Parameter Microscop yPCRFluorescenceDipstick HRP-2Dipstick pLDH, ICT Pf/Pv Sensitivity parasites/l) 505 50100100 SpecificityAll speciesAll specie s P. falciparum good, others difficultP. falciparum only P. falciparum and P. vivax good, and P. ovale and P. malariae only with pLDH Parasite density or parasitemia YesNo NoCrude estimation Crude estimation Time for result 3060 min24 h3060 min20 min20 min Skill levelHighHighModerateLowLow EquipmentMicroscopePCR appar atus QBC apparatus or direct fluorescence microscope Kit onlyKit only Cost/testLowHighMod