中药分析-贡济宇.ppt

“中药资源化学研究与资源有效利用的新思路新方法 暨中药资源与开发专业系列规划教材培训学习班” 中药分析新思路、新方法中药分析新思路、新方法 长春中医药大学药学院长春中医药大学药学院 贡济宇贡济宇 20132013年年1111月月 中药分析学内涵与外延 1 中药分析研究特点2 中药分析学的发展与研究思路 3 中药分析学（analysis science of Chinese medicines） ：是以中 医药理论为指导，综合运用化学、物理学、生物学和信息学等 技术和方法，研究中药质量及其控制方法的一门学科。 是中药学一级科学的重要组成部分，是中药学类专业的一门 主要专业课程，是中药学一级学科的一个重要组成部分。它不 仅是一门研究中药质量控制的“方法学科”，且为相关学科的 研究提供必要的基础支撑，共同致力于中药学科的发展和提高 。是现代中药发展的“耳目”。 中药分析学内涵 中药分析 学内涵与 外延 中药分析学是一门伴随着现代科学技术成长、发展的学科， 并积极与其他学科交叉融合，向更宽阔的领域延伸。包括应用 信息学、统计学等技术解决中药复杂体系分析问题的中药信息 学；体内中药成分分析；中药生产过程分析与在线质量控制； 中药生物活性分析；中药形态、微观、无损分析；多方法的联 合、联用分析等。 中药分析学外延 中药分析 学内涵与 外延 中药（Chinese medicines）是指依据中医学的理论和临床经验应 用于医疗或保健的药物。 中药的物质表现形式包括中药材（Chinese medicinal materials） 、饮片（decoction pieces）和中药制剂（prescription of Chinese medicines）。近年来，随着国际范围内对天然药物、传统药物认 知度的不断提高，中药提取物（Chinese medicinal extracts）已成 为一种新的物质表现形式。 中药的质量是指中药所固有的一组用以达到中药临床用药需求 的整体特征或特性，包括真实性、有效性、安全性、整体性和均 一性。 规范了相关术语 中药分析 学内涵与 外延 研究中药质量变化规律 中药质量控制与评价 新药物研究与开发 为中药现代化提供方法与技术 中药分析的任务 中药分析 学内涵与 外延 研究中药质量变化规律 中药分析不是一项简单的、被动的质量检验与监督工作。要对中药质量 进行有效控制，需要从药材的种植（养殖）、采收、加工、贮存到饮片 炮制、制剂生产制备等一系列过程进行质量分析，系统考察质量的影响 因素及其变化规律，探索提高中药质量的有效途径。 中药分析 学内涵与 外延 中药质量控制与评价 经过定性、定量、药理、毒理等方面的严格分析和检验，从 本质上阐明药物的性质、药效、利用变化程度，毒副作用， 进而科学地评价、控制其质量。 中药分析 学内涵与 外延 中药分析 学内涵与 外延 中药分析 研究特点 中药及其制剂成分的多样性与复杂性 中药材质量的差异性 中药制药工艺及辅料的特殊性 中药药理作用的多方面性 中医药理论与现代医学的不一致性 以中医药理论为指导，评价中药质量的整体性和科学 性 中药分析特点 中药化学成分的复杂性，决定了中药及其制剂分析的艰巨性 中药成分含量的不稳定性，影响了中药及其制剂质量的可控性 中药分析过程中干扰因素多，影响结果的准确性 中药有效物质基础不甚明确，影响了中药质量评价的客观性 中药分析与“西药” 分析的异同 中药分析 研究特点 中药分析 研究特点 中药应用与中医药理论 体系特征 l中医重辨“证”论治 l中药特性表述-四气五味、归 经、升降浮沉等 l中药功效按中医药理论描述 l中药应用原则-配伍，君臣佐 使、七情等 西药应用与现代医学 理论体系特征 l现代医学侧重对“症”处理 l药物本身性能以其理化性 质来表征 l药物功效以相应的病理、 生理、生化等指标和术语表 示 l药物以单独使用为主，联 合使用时，需考虑药物间的 理化作用及时间等 中药分析 研究特点 中药分析特点 l中药多为单味或复方成分尚未清 楚的的混合物，所测成分多为微 量或痕量 l通常应采用仪器分析法 l真实性分析-首先要弄清确切基 原（物种），以达到正本清源 ； 真实性的控制方法，主要包括基 于形态学的性状和显微鉴定方法 、基于化学成分的理化鉴定方法 以及基于遗传物质的DNA分子标 记鉴定等 西药分析特点 l药物多为已知结构明确的 物质，纯度高 l可采用化学分析法或仪器 分析法 l真实性分析-主要是对已 知物质的鉴别，可采用官 能团特征反应、IR光谱法 等 中药分析 研究特点 中药分析特点 l中药有效性分析-目前，多数中药的 有效成分并不明确，在此前提下，分 析中药所含活性成分、特征性成分或 指标性成分还较普遍，且含量多以限 度表示；但建立完善有效活性成分测 定、多成分同步定量，特征图谱（或 指纹图谱）检测技术建立完善有效活 性成分测定、多成分同步定量，特征 图谱（或指纹图谱）检测技术，中药 的有效性也可通过表征中药的生物学 属性来完成，这些将是发展趋势。 l所测成分多为微量或痕量 西药分析特点 l药物有效性分析-常为主 成分的含量或效价测定。 原料药主要考察纯度，一 般以百分质量分数表示； 制剂主要考察单位制剂含 量与标示量的符合的，一 般以相对表示百分含量表 示。 l所测成分多为常量组分分 析 中药分析 研究特点 中药分析特点 l中药安全性分析-主要考 察杂质或有害物质的量是 否在安全使用的范围内 。 杂质影响原料的纯度，有 害物质包括内源性有毒成 分和外源性有害物质 西药分析特点 l药物安全性分析-主要 考察药物的纯杂程度， 如一般性和特殊性杂质 ，特殊性杂质又包括有 关物质。 中药分析 研究特点 中药分析特点 l中药生产过程质量分析-要考虑 从源头包括种植、养殖、药材加 工、炮制到前处理、再到制剂的 全过程在线质量控制。 西药分析特点 l药物生产过程质量分 析-主要从原料合成、 提取分离等生产及制剂 生产进行在线质量控制 。 中药分析学是伴随着人们对中药在生产、流通、临床应用的 质量控制需求而逐渐形成的，并随着相关科学技术的发展而发展 。依据所采用的主要分析方法与手段，中药分析学的形成大体可 分为以下三个阶段： 基于中药外形特征的“性状分析”阶段 基于中药内部组织构造的“显微分析”阶段 基于中药所含化学成分的“理化分析”阶段 中药分析学的产生与发展 中药分析学 的发展与研 究思路 以化学成分为核心的中药质量分析将不断完善 中药指纹图谱技术应用将越来越广泛 联用技术应用将会更加普及 中药生物活性测定方法的应用不断增多 中药自动化、智能化分析方法的应用将会越来越广泛 更加注重安全性将是中药质量分析的趋势 更加注重中药质量管理体系的建立与发展 中药分析学的发展趋势 中药分析学 的发展与研 究思路 如中国药典2015年版将继续完善中药质量控制模式 建立健全符合中医药“君臣佐使”之理论，必须优先解决对“ 君、臣”药的有效控制，体现现代科技成果应用、能够从整 体上有效反映中药安全性、有效性、质量均一稳定等特征的 中药质量控制模式。 强化中药材和饮片的基础作用，逐步做到每个品种有科学 规范的安全性数据，要有与活性直接相关的有效性控制方法 和专属的能反映整体特征的质量指标。 中药分析学 的发展与研 究思路 针对药味成分复杂、标准物质难求、指标成分缺乏专 属性的品种，建立专属性强、多成分同时控制的质量指 标，建立完善有效活性成分测定、多成分同步定量，特 征图谱（或指纹图谱）检测技术。 探索并推行以中药标准对照提取物为对照的质量评价 体系，形成新的更为科学、能真实反应中药内在要素的 、能被国际普遍认可的质量标准控制体系和模式。 中药分析学 的发展与研 究思路 继续提高中药安全性控制水平 u对中国药典中标有“大毒、有毒、小毒”的中药材及饮 片，进行系统的毒理学研究，从本版药典开始，计划分阶段 、系统规范地对常用中药材、饮片安全性研究并建立数据库 。 u以现代科学实验数据诠释古代本草的经验，通过系统的毒 理学研究，提出和制定安全的药物配伍、用药剂量和合理的 限度范围，这是中医药走向现代科学的奠基性工作，是中药 面向国际社会、引领国际标准首要解决的问题。 u建立完善内源性有毒成分和外源性有害物质限度控制技术 方法，建立100个常用中药材和饮片的安全性数据库 。 中药分析学 的发展与研 究思路 u大幅度增加和完善安全性检查项目，制定内源性有毒成分 和外源性重金属及有害残留物（农残、二氧化硫、真菌毒素 、钴-60辐照残留、溶剂残留等）控制的方法、限度。 u进一步加强高风险中药注射剂的安全性控制，研究建立中 药注射剂异常毒性、过敏反应、高分子聚合物、蛋白、树脂 等有关物质检查的新方法。 u探索中成药品种灭菌方法正式纳入药典标准正文的可行性 以保障安全和推进产业进步。 中药分析学 的发展与研 究思路 继续加强中药有效性质量控制 u遵循中医临床用药经验，传承和提高相结合，对性状、成 分差别较大，或中医临床使用不同的多来源中药材继续深入 研究，按一药一名一标准的原则，科学、客观地逐步解决中 药材长期存在的同品名多来源问题。 中药分析学 的发展与研 究思路 u对于存在明显的产地依存性和对生长年限要求严格的中药 材，要在标准项目中增加产地和采收年限的相关规定，并要 加强野生与栽培品的质量标准比较研究和质控方法，从源头 上确保中药质量。 u坚持科研为标准服务，标准为监管服务，监管为公众服务 的理念，积极采用现代科研成果，加大科研成果向标准转化 的力度，增加和完善专属的与疗效相关的鉴别、检查、含量 测定项目。重点引入、广泛推广一测多评、特征图谱和图谱 指纹、DNA分子鉴定、生物测定等新的分析方法和检测技术 ，杜绝“合格的假劣药”现象和问题发生 中药分析学 的发展与研 究思路 u建立中药质量标准系统工程，同一品种或同一类成分在不 同的类别或剂型中采用统一规范的检测方法，以保证同系列 品种质量控制、检测方法、指标与限度的相对一致性，维护 系列药品的质量与疗效均衡。 u研究完善中药标准物质的替代方法，建立中药材饮片供鉴 别和含量测定用的对照提取物。 中药分析学 的发展与研 究思路 不断完善分析方法与指导原则 不断完善中药分析方法，提高中药质量控制水平 树脂残留物检查法 中药溶出度测定法 辐照中药放射性物质残留检查法 真菌毒素残留检查法 重金属、二氧化硫、农药残留现代分析技术。 中药分析学 的发展与研 究思路 修订和制定中药相关指导原则 修订： 中药质量分析方法验证指导原则； 制定： 中药安全性控制指导原则； 中药指纹和特征图谱技术指导原则； 中药分析技术指导原则； 中药标准物质研究、生产、标定和使用指导原则 中药分析学 的发展与研 究思路 进一步加强中药标准的规范 u规范中药材的名称（中文、拉丁文）、来源（学名、药用部 位）、采收期和产地加工。 u规范中药饮片、提取物及中成药处方中药味的名称。 u规范中药饮片、提取物及中成药制法的表述，厘清标准中规 定的“制法”与企业实际生产“工艺”的定位和区别，统一规范专 用术语。 中药分析学 的发展与研 究思路 规范和完善检测方法、过程、限度、结果判断与 制剂规格等表述方式及用语；规范和统一计量单位 ，准确使用有效数字。 进一步推进中药材拉丁学名的修订工作。对濒危 和国际性保护资源品种，明确标明规范的警示语。 中药分析学 的发展与研 究思路 规范和统一中医医学术语，突出辨证用药的特色 ，规范功能与主治的表述、主症与次症的排列，彻 底解决描述不确切，前后矛盾，主治病症宽泛等问 题。 中药材道地性研究与质量评价 -生物指纹谱与化学指纹谱相结合 示例一 中药分析方法研究思路与体会 中药分析学 的发展与研 究思路 采用微卫星分子标记的方法对中国林蛙长白山亚种与桓仁林蛙、黑龙江林 蛙、东北林蛙进行研究。建立了中国林蛙长白山亚种的快速PCR鉴别方法 ，并在同种引物的扩增下，四种林蛙青蛙在PCR琼脂糖电泳图谱上显示的 DNA条带大小结果完全不同，根据5对引物的PCR扩增结果，从琼脂糖电泳 图中可以初步判定每种引物均可以将四种不同地区的林蛙鉴别开。为了验 证其结果的准确，采用荧光标记的进行等位基因的扩增，得中国林蛙长白 山亚种的微卫星的特征性电泳图谱，其可以准确的鉴别中国林蛙长白山亚 种，进而可以通过林蛙物种个体来控制道地动物药材哈蟆油的质量。这种 分子遗传标记的方法从基源上道地动物药材哈蟆油的鉴别困难问题。 如引物1的PCR电泳图谱分析 分别取已经提取好的四种林蛙的DNA模板，选择引物1： RCMS035 F: AATGGCGAGGAGGTTGACTA EU377559 R: GCAGTGTTTTATCGCTCGGT 对四种林蛙及对照组青蛙模板进行扩增，其退火温度为52.8，模板浓度为0.5ul,循环次数 为35个循环，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压为120v，电泳时间为35min，上 样量为0.5ul，在全自动凝胶成像分析系统上观察和分析。其电泳结果如下： 图1 C1-C10：长白山大兴安岭林 蛙的PCR产物电泳结果（引物 RCMS035 F/ EU377559 R）M： DL500DNA Marker从上至下为 500bp、400bp、300bp、200bp 、150bp 、100 bp 、50bp 图2 H1-H10：黑龙江伊春林蛙的PCR产物电泳结 果（引物RCMS035 F/ EU377559 R）M： DL500DNA Marker从上至下为 500bp、400bp 、300bp、200bp、150bp 、100 bp 、50bp 图3 L1-L10：辽宁桓仁林蛙的PCR产物电 泳结果（引物RCMS035 F/ EU377559 R ）M：DL500DNA Marker从上至下为 500bp、400bp、300bp、200bp、 150bp 、100 bp 、50bp 图4 J1-J10： 吉林四海林场林蛙的PCR产 物电泳结果（引物RCMS035 F/ EU377559 R）M：DL500DNA Marker 从上至下为 500bp、400bp、300bp、 200bp、150bp 、100 bp 、50bp 图5 Q1-Q10： 长春净月潭青蛙的PCR产 物电泳结果（引物RCMS035 F/ EU377559 R）M：DL500DNA Marker 从上至下为 500bp、400bp、300bp、 200bp、150bp 、100 bp 、50bp 以上结果表明，长白山林蛙在280bp 左右有明显的扩增条带，黑龙江伊春 的林蛙在180bp处有明显的扩增条带 ，辽宁桓仁林蛙在200bp处有明显的 扩增条带，吉林四海林场林蛙在 300bp处有明显的扩增条带，对比组 长春净月潭青蛙在相同条件下没有扩 增条带出现，与林蛙组形成鲜明对比 。 再对每对引物每个地点的等位基因做个频数分布图可进一步 得到中国林蛙长白山亚种与其他种属林蛙的区分情况 图6 引物1的基因频数分布图 示例二 东北红豆杉的质量评价 u运用ITS2条形码序列能准确区分红豆杉的来源及其种属 v 图1 PCR产物电泳图 M: 100bp DNA Marker ck: 空白对照 1和2为东北红豆杉TS样品两个平行试验PCR产物； 3和4为南方红豆杉TC样品两个平行试验PCR产物； 5和6为曼地亚红豆杉TM样品两个平行试验PCR产物 图2 系统聚类树 系统聚类树分析通过邻接法（NJ）利用实验序列和Genbank序列所构建 的系统聚类树可以看出，东北红豆杉、南方红豆杉与曼地亚红豆杉为同属植物 ，基于ITS2序列的NJ树能够明显地看出，红豆杉与其同科能够很好地区分开， 见图2 红外光谱指纹图谱的研究 采用了红外光谱法建立中药红豆杉的 指纹图谱，通过对15批不同来源的红 豆杉药材进行了光谱测定，并聚类分 析。将所得的图谱进行平均处理，得 到平均谱图，将不同来源的红豆杉与 平均谱图比较进行相似度分析，进而 能评价不同来源的红豆杉药材质量。 编号来源 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 黑龙江佳木斯 辽宁本溪 吉林通化 辽宁辽阳 黑龙江苇河 辽宁丹东 黑龙江尚志市 曼地红豆杉 黑龙江亚布力 沈阳沈河区 南方红豆杉 辽宁东港市 黑龙江桦南县 黑龙江牡丹江市 辽宁开源市 表1 红豆杉药材来源 图2批不同来源红豆杉样品红外光谱合图 由相似度比较结果可以看出，15批不同来源红豆杉药材图谱与平均图谱 的相似度均大于0.90. 图3不同来源红豆杉红外谱图聚类分析结果 聚类分析 结果显示，15批不同产地红豆杉的红外图谱被明显聚为两类，说明不同产 地的红豆杉药材的红外光谱图有相似之处，红豆杉样品的红外光谱图可能 由于地理位置和气候环境的影响存在一定的差异。 示例三 两头尖药用资源的质量评价 12批吉林省不同产地两头尖样品红外光谱合图 12批不同产地两头尖红外谱图聚类分析结果 编号与平均谱图相似 度（%） S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 99.27 98.85 99