抗体技术研究及产业化.ppt

抗体技术研究及产业化抗体技术研究及产业化 细胞表 面抗原 血型抗原 组织相容性 抗原 白细胞分化抗原 CD2 CD3 CD25 CD10 CD20 CD38 CD45 CD71 CD41 CD42 CD8 . 肿瘤相关 抗原 胃癌肺癌 肝癌 鼻咽癌 大肠癌 宫颈癌 乳腺癌 结肠癌卵巢癌 胰腺癌 喉癌脑胶质瘤 骨肉瘤 病毒 HFRSV 新城疫 甲肝 轮状 登革 乙肝 RSV 乙脑 流感马雅罗 Mayaro 基孔贡亚 Chikungunya Ross River 罗斯河 盖塔 Getah 柯萨奇 狂犬 新培斯 Sindbis 细菌 大肠杆菌 沙门氏菌 痢疾杆菌 军团杆菌 结核杆菌绿脓杆菌 麻风杆菌 霍乱弧菌 寄生虫 血吸虫 疟原虫 弓形虫 旋毛虫 丝虫 毛滴虫 绦虫 利什曼原虫 可溶性 抗原 酶 血浆 蛋白 毒素 细胞 因子 补体 激素 小分子 化合物 抗体技术的研究和抗体的研发，是生抗体技术的研究和抗体的研发，是生 物技术发展的永恒主题物技术发展的永恒主题 抗体广泛用于临床疾病的诊断和研究抗体广泛用于临床疾病的诊断和研究 目前在美国单克隆抗体类药物已占目前在美国单克隆抗体类药物已占 FDAFDA所批生物药的所批生物药的3/4 3/4 第一章 抗体类型和抗体技术发展 第一代 多克隆抗体 第二代 单克隆抗体 第三代 基因工程抗体 第四代 全人抗体 ？ 鼠源单抗临床应用的障碍 血清半衰期短，20h 抗原抗体结合力、亲和力不够 募集效应细胞产生副作用 HAMA反应：810天出现，2030天 高峰，anti-id封闭与抗原结合位点，抗鼠 抗体加速单抗清除 过敏性休克 影响单抗与靶细胞或抗原结合 引起变态反应和器官损害 HAMA反应示意图 第一代 多克隆抗体 第二代 单克隆抗体 第三代 基因工程抗体 第四代 全人抗体 ？ 小鼠抗体 嵌合抗体重构抗体人源抗体 鼠 100% 33% 10% 0 人 0 67% 90% 100% 第一代 多克隆抗体 第二代 单克隆抗体 第三代 基因工程抗体 第四代 全人抗体 ？ 小鼠抗体 嵌合抗体重构抗体人源抗体 鼠 100% 33% 10% 0 人 0 67% 90% 100% 人鼠嵌合抗体 改型抗体（又称人源化抗体） 小分子抗体 双特异抗体 抗体融合蛋白 基因工程抗体的类型 1、嵌合抗体 将人Ig C区与鼠Ig V区相连接，从 而在同一抗体分子中含有不同属来源的抗 体。 构建嵌合抗体的基本原 理，从杂交瘤细胞基因组中 分离和鉴别出功能性可变区 基因，与人Ig恒定区基因相 连接，插入适当的载体中， 构建成人鼠嵌合的重链和 轻链基因，然后共转染骨髓 瘤细胞，使之表达嵌合抗体 。 表1 FDA批准上市的单单克隆抗体药药物 产品研究者适应症目标 抗原 批准 年份 抗体 类型 ReoproCentoco r 心血管疾病IIIII I 1994嵌合抗体 RituxanIDEC非霍奇金氏 淋巴癌 CD201997嵌合抗体 Remicad e Centoco r 类风 湿关节 炎 TNF-1999嵌合抗体 Simulec t Novarti s 肾脏 移植CD251998嵌合抗体 2、改型抗体 应用CDR移植技术，即 将鼠单抗V区中互补决定区（ CDR）序列取代人源抗体相应 CDR序列，重构成既具有鼠源 性单抗特异性，又保持人抗体 亲和力的CDR移植抗体（ CDR-grafted Ab），也称为改 型抗体或人源化抗体。 表1 FDA批准上市的单单克隆抗体药药物 产品研究者适应症目标 抗原 批准 年份 抗体 类型 SynagisMedimmune呼吸道感染 F protein1998人源化抗体 ZenapaxPDL肾脏 移植 CD251997人源化抗体 HerceptinGenentech乳腺癌 HER2/ne u 1998人源化抗体 MylotargCelltech白血病 CD332000人源化抗体 CampathMillennium淋巴瘤 CD522001人源化抗体 XolairGenentech中度至严重的 因敏感引起的 哮喘 IgE2003人源化抗体 Herceptin Genentech 乳腺癌HER2 2006人源化抗体 3、小分子抗体 利用细菌表达决定抗体特异性的结构域 ，所获抗体片段大小仅为IgG分子的1/3-1/12 ，因此称之为小分子抗体。 小分子抗体包括： Fab 1/3 Fv 1/6 ScFv 1/6 单域抗体 1/12 MRU Fab片段 Fab片段由重链VH加CH1及完整的轻链 构成，在细菌的启动子控制下，在大肠杆菌 中表达而合成Fab，大小为完整抗体的1/3， 其结构与木瓜蛋白酶消化完整抗体后所产生 的Fab片段一致。用DNA重组技术制备的嵌 合Fab片段，其V区为鼠源性，而CH1、C 为人源性的。 FV片段 FV片段由VH和VL组成，是抗体的抗原结合 部位，分子量只有完整分子的1/6。采用共价 结合的FV片段，在不改变其分子大小的情况下 ，可避免VH或VL的解离。 单域抗体和最小识别单位 单域抗体是指VH或VL，其分子大小仅 为完整抗体的1/12。由单个CDR构成的小分 子抗体称为最小识别单位（MRU）。 单链抗体 单链抗体分子是由一条单一肽链按VH-Linker-VL 或 VL-Linker-VH 的顺序组成。分子大小是完整抗体分子的 1/6，ScFv是抗体与抗原结合的最小单位。 ScFv具有以下特点： 具有与原亲本抗体相同的特异性和亲和 力，但由于分子很小，免疫原性弱，克服了完整 抗体不易到达靶细胞、清除慢和易引起超敏反应 及组织损伤等缺点； 制备流程较其他基因工程抗体简单，可 由大肠杆菌发酵产生； 无Fc段，所以减少了与非靶细胞上Fc受 体结合，使其更特异性集中于靶细胞部位，有 利于作为载体用于药物的导向治疗； 易进行分子改造，ScFv基因片段还可以 与适当的酶基因或毒素蛋白基因重组，转入适 当的表达系统，可产生出酶联抗体或具有与抗 原结合特异性和细胞毒性的重组免疫毒素。 4. 双特异抗体(bispecific antibody,BsAb) 一个抗体分子中的两个抗原结合部 位可分别结合两种不同的抗原决定簇。 制备： 化学偶联技术 基因工程技术 二次杂交瘤技术 在导向治疗中的应用在导向治疗中的应用 药物导向药物导向 肿瘤细胞抗原肿瘤细胞抗原 BsAb 效应物（细胞毒素等）效应物（细胞毒素等） 细胞导向细胞导向 肿瘤细胞抗原肿瘤细胞抗原 BsAb 效应细胞（效应细胞（CTLCTL、LAKLAK等）等） 双特异性抗体 抗人肝癌单抗 /抗人 CD3单抗 抗Her2/neu单抗/抗人CD16单抗 抗人CD20单抗/抗人CD3单抗 抗人卵巢癌单抗/抗人CD3单抗 5.5. 抗体融合蛋白和免疫毒素抗体融合蛋白和免疫毒素 将编码抗原结合部位的基因片段将编码抗原结合部位的基因片段 （FabFab或或FvFv段）与毒素或酶的基因融合段）与毒素或酶的基因融合 在一起，可将特定的生物活性物质导在一起，可将特定的生物活性物质导 向特定部位。向特定部位。 抗体融合蛋白 抗人卵巢癌单抗-IL-12 血吸虫病抗独特型抗体-IL-12 表1 FDA批准上市的单单克隆抗体药药物 产品 研究者适应症目标 抗原 批准 年份 抗体 类型 EnbrelImmunex类风 湿关节 炎 TNF-1998抗体融合 蛋白 Alefacept Biogen银屑病CD22003抗体融合 蛋白 重组免疫毒素 借助借助DNADNA重组技术，将编码抗体和毒素的基因重组技术，将编码抗体和毒素的基因 连接在一起，产生的免疫毒素为重组免疫毒素连接在一起，产生的免疫毒素为重组免疫毒素 。 白喉毒素白喉毒素 相思豆毒素相思豆毒素 假单胞菌外毒素假单胞菌外毒素 优点：高效、非特异性毒性较低、体内稳定性优点：高效、非特异性毒性较低、体内稳定性 较好、易穿透肿瘤、安全较好、易穿透肿瘤、安全 全人抗体的研究 鼠鼠- -人杂交瘤人杂交瘤 人人- -人杂交瘤人杂交瘤 转人转人IgIg基因组小鼠基因组小鼠 抗体库技术抗体库技术 非杂交瘤技术制备单抗非杂交瘤技术制备单抗 通过基因转染方法改良鼠骨髓瘤通过基因转染方法改良鼠骨髓瘤 细胞，筛选稳定的鼠细胞，筛选稳定的鼠- -人嵌合细胞，使人嵌合细胞，使 融合的杂交瘤细胞遗传性稳定，不易融合的杂交瘤细胞遗传性稳定，不易 丢失染色体，可长期、稳定地分泌全丢失染色体，可长期、稳定地分泌全 人单克隆抗体。人单克隆抗体。 鼠鼠- -人杂交瘤技术人杂交瘤技术 鼠鼠- -人杂交瘤技术人杂交瘤技术 问题： 鼠源成分残留 稳定性差 染色体丢失 人-人杂交瘤技术 问题： 能稳定分泌抗体的亲本细胞很难获得 稳定性差 染色体易丢失 人-人杂交瘤技术 英国剑桥大学Karpas A(2001)报 道建立了人-人杂交瘤技术，获得 Karpas 707H人骨髓瘤细胞株，可制备 全人抗体。 转入人的Ig基因组 免疫动物 全人抗体 基因敲除小鼠 转人转人IgIg基因组小鼠基因组小鼠 抗体库技术 基础：基础： PCRPCR技术的建立技术的建立 抗体分子在大肠杆菌的功能性表达抗体分子在大肠杆菌的功能性表达 噬菌体展示技术的发展噬菌体展示技术的发展 抗体库的种类： 初期的抗体库 噬菌体抗体库 大容量抗体库 人淋巴细胞 抗原筛选产生特异克隆 RT-PCR 轻链重链基因 转印至NC DNA重组 组合抗体库 E.coli随机表达 1.1.初期抗体库初期抗体库 噬菌体抗体（phage antibody）是将克隆的 人Ab V区基因与一种丝状噬菌体DNA上的基因- 或基因精确连接，转染细菌后在其膜表面表 达Fab段（或单链抗体）-噬菌体外壳蛋白 （基因-或基因产物） 的融合蛋白。 2. 2. 噬菌体抗体库噬菌体抗体库 这种噬菌体在一定意义上讲相当于 一个人B细胞克隆，将B细胞全套可变区 基因克隆出来与噬菌体DNA相连，导入 细菌体内使之表达，可制备人全套抗体 ，称为噬菌体抗体库。 问题： 1、从未经免疫动物的抗体库获得 的抗体其亲和力不高 抗体体内生成的理论 抗原刺激前，机体具有抗体初级库 抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被 选择，并发生克隆性增殖。 在抗原的反复刺激下，抗体的V区发生 高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞 被选择，抗体进行类别转换，最终抗体 成熟。 抗体亲和力改造 链替换(Chain Shuffling) 计算机辅助设计下的定点突变 高亲和力克隆的选择 2、抗体库的库容不足以涵盖某种动物的 抗体多样性 3.3.大容量抗体库大容量抗体库 ? 天然抗体库天然抗体库 半合成抗体库半合成抗体库 全合成抗体库全合成抗体库 抗体库的优点：抗体库的优点： 1.1.多数外源抗原对人体有害，不能随意对人体进行多数外源抗原对人体有害，不能随意对人体进行 免疫。噬菌体抗体无须免疫，可直接从非免疫动物抗体免疫。噬菌体抗体无须免疫，可直接从非免疫动物抗体 库中筛选出特异性抗体，并能筛选针对该物种自身抗原库中筛选出特异性抗体，并能筛选针对该物种自身抗原 的抗体；的抗体； 2.2.轻、重链随机组合的多样性多于供体轻、重链随机组合的多样性多于供体B B细胞产生抗细胞产生抗 体的多样性，构建一种噬菌体抗体文库，可供产生针对体的多样性，构建一种噬菌体抗体文库，可供产生针对 多种特异性抗原的人源抗体，从而克服了难以建立人多种特异性抗原的人源抗体，从而克服了难以建立人- -人人 杂交瘤的困难；杂交瘤的困难； 3.3.细菌增殖快，培养成本低廉，适合工业化大规模细菌增殖快，培养成本低廉，适合工业化大规模 生产，为临床大量应用抗体提供了可能。生产，为临床大量应用抗体提供了可能。 总抗体库（总抗体库（master librarymaster library） 人们将有望在原核系统模拟体内免疫过人们将有望在原核系统模拟体内免疫过 程，并任意克隆针对任何抗原的抗体。程，并任意克隆针对任何抗原的抗体。 非杂交瘤技术制备单抗非杂交瘤技术制备单抗 人人B B淋巴细胞淋巴细胞 转染转染EBEB病毒及生长因子病毒及生长因子 B B细胞永生化细胞永生化 Humira是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿 关节炎的抗体药物， 2002年上市，是完全人源化单 抗，这是抗体药物发展具有里程碑意义大事，预示 着抗体药物一个迅猛发展的新时代的来临。2003年 有4亿美元的销售额，2005年达到11亿美元。 Avastin 2003年上市的治疗结肠癌的抗体药物， 也是第一个从抗体库中筛选出的 Fab 段抗体药物。 Avastin的上市使公司的股价上升了90亿美元。 第二部分第二部分 抗体的应用及产业化研究抗体的应用及产业化研究 单克隆抗体的应用 基础研究 预 防 治 疗 诊 断 抗体是生化、免疫学、生物芯片等多种诊 断试剂中的核心生物原料，在各种疾病的诊断领 域具有广泛的用途。我国目前用于临床诊断方面 的抗体80% 依靠进口。国外已批准的诊断性单抗 有600多种，我国仅60余种。 单克隆抗体用于诊断 单克隆抗体用于疾病诊断 传染病诊断 肿瘤诊断 免疫性疾病诊断 内分泌疾病诊断 血液病诊断 心脑血管疾病、肿瘤、神经退行性疾病、传 染病、自身免疫性疾病和内分泌性疾病等日益威 胁着人类的健康。针对这些重要疾病，要不断研 究和开发新的治疗药物。虽然化学药物一直占据 主流地位，但抗体药物导向性强、 副作用小、半衰期长等优势吸引了 越来越多的投资。 单克隆抗体用于治疗 单克隆抗体用于疾病治疗 肿瘤 自身免疫性疾病 器官移植 心血管疾病 感染性疾病 表1 FDA批准上市的单克隆抗体药物 产品 研究者适应症目标抗原批准年份抗体类型 PanorexCentocor肿瘤17-1A1995鼠源抗体 OthocloneOrtho Biotech 异体移植CD31986鼠源抗体 ReoproCentocor心血管疾病IIIIII1994嵌合抗体 RituxanIDEC非何杰奇金斯淋巴癌CD201997嵌合抗体 RemicadeCentocor类风 湿关节炎TNF-1999嵌合抗体 SimulectNovartis肾脏 移植CD251998嵌合抗体 EnbrelImmunex类风 湿关节炎TNF-1998抗体融合蛋白 SynagisMedimmune呼吸道感染F protein1998人源化抗体 ZenapaxPDL肾脏 移植CD251997人源化抗体 HerceptinGenentech乳腺癌HER2/neu1998人源化抗体 MylotargCelltech白血病CD332000人源化抗体 CampathMillennium淋巴癌CD522001人源化抗体 ZevalinIDEC淋巴癌CD20- Y902002鼠源抗体 HumiraAbbott Laboratories 类风 湿关节炎TNF-2002人抗体 XolairGenentech中度至严重的因敏感 引起的哮喘 IgE2003人源化抗体 AlefaceptBiogen银屑病CD22003抗体融合蛋白 美国已上市18种单克隆抗体药物 2002年销售额 29亿美元 20032003年年 40 40亿美元亿美元 2005年 90亿美元 2008年 150亿美元 20102010年年 300 300亿亿美元 2002年完全人源化单抗humira获得批准 上市，这是单克隆抗体药物发展具有里程碑 意义大事。Humira是Abbott/CAT公司开发的 一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物， 2003年有4亿美元的销售额，2005年达到11亿 美元。 Avastin 是美国FDA批准的治疗结肠癌的 抗体药物，也是第一个从抗体库中筛选出的 Fab 段抗体药物。 Avastin的上市使公司的 股价上升了90亿美元。 赫赛汀（英文名 Trastuzumab ），抗人表皮 生长因子受体-2(HER-2)的人源化单克隆抗体，用 于治疗转移性乳腺癌。 有25%-30%原发性乳腺癌患 者HER2过度表达。 抗体药物临床应用广泛，市场需求抗体药物临床应用广泛，市场需求 巨大。抗体药物已占巨大。抗体药物已占FDAFDA批准生物技术药批准生物技术药 的的3/43/4，所有新研发药物的，所有新研发药物的1/31/3。