WATERS公司的UPLC-TQD培训资料 MS1LCMS 基础.ppt

2008 Waters Corporation 12008 Waters Corporation 液质联用基础知识 2008 Waters Corporation 2 什么是质谱什么是质谱( (Mass Spectrum)Mass Spectrum) 不同质荷比的离子经质量分析器分离,而后被检测并记录下来的谱 图叫作质谱图.简称质谱 质谱图的横坐标是质荷比(m/z)，纵坐标是离子强度 质谱法(Mass Spectrometry)即质谱分析法,一般亦简称为质谱 2008 Waters Corporation 3 氯霉素的质谱图氯霉素的质谱图 2008 Waters Corporation 4 MS 检测的是离子质量 2008 Waters Corporation 5 质谱基础知识 质谱中采用的质量单位 Da=Dalton (道尔顿 ) 质量单位,等于一个碳原子(12C)质量的十二分之一，约为1.6610 - 24克;一克约为610 23道尔顿 amu=atomic mass unit ,原子质量单位 1amu=1Da 2008 Waters Corporation 6 质谱基础知识 同位素: 具有相同的原子序数而又具有不同的质量数 的原子叫作同位素 同位素丰度: 自然界中某同位素原子所占的百分数叫做该同 位素的天然丰度 2008 Waters Corporation 7 同位素表示法 C 12 6C 13 6 质量数 = 质子 + 中子 原子序数 = 质子数 具有相同的元素符号,在元素符号的左上角表明其质量数 2008 Waters Corporation 8 天然同位素丰度 氮 14N 14.0031 99.64 15N 15.0001 0.36 硫 32S 31.972195.0 33S 32.97150.76 34S 33.96794.22 氯 35Cl 34.968975.77 37Cl 36.9659 24.23 溴 79Br 78.918350.69 81Br 80.916349.31 原子符号 质量, amu% 天然丰度 2008 Waters Corporation 9 怎样计算质量数 名义质量数 采用元素质量数的整数进行计算,例如:C=12,H=1,O=16 单同位素质量数或准确质量数 用丰度最大的同位素准确质量数计算 例如：C=12，1H=1.0078，16O=15.9948 平均质量数或化学质量数 考虑到所有天然同位素丰度的该元素原子量来计算 例如：C=12.001，H=1.00794，O=15.9994 质谱获得的单电荷离子的m/z值，是单同位素质量数 2008 Waters Corporation 10 MS分子量的计算 利血平, C33H40N2O9,的MW的计算 使用原子量: 使用单一同位素质量: C: 33 x 12.011 = 396.363 C: 33 x 12.0000 = 396.000 H: 40 x 1.0079 = 40.316 H: 40 x 1.0078 = 40.312 N: 2 x 14.0067 = 28.013 N: 2 x 14.0031 = 28.006 O: 9 x 15.9994 = 143.995 O: 9 x 15.9949 = 143.954 608.687 608.272 2008 Waters Corporation 11 质谱名词与术语 质荷比(mass charge ratio): 离子的质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的 比值,叫作质荷比,简写为m/z 质荷比是质谱图的横坐标 质荷比是质谱定性分析的基础 2008 Waters Corporation 12 离子丰度 (Abundance of ions): 检测器检测到的离子信号强度 离子相对丰度 (Relative abundance of ions): 以质谱图中指定质荷比范围内最强峰(基峰)的强度为100, 其它离子峰对其归一化所得的强度 标准质谱图均以离子相对丰度值为纵坐标 谱峰的离子丰度与物质的含量相关,因此是质谱定量的基础 质谱名词与术语质谱名词与术语 2008 Waters Corporation 13 MS是高真空技术 质谱仪之所以在高真空下工作是为了 . 尽量减少离子-分子之间的碰撞 (即,得到最大平均自由程) o 碰撞可能导致离子偏离所期望的由离子源到检测器的通道 o 碰撞可能导致产生意外的离子或反应 o 平均自由程:1 atm10 -6 m ; 10-4 torr 0.5 m 防止在高电压 (用于某些离子聚焦)下生成电弧 减少污染/化学噪音 2008 Waters Corporation 14 MS的历史 1910年 世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥 Cavendish实验室出现 1917年 电喷雾(Electrospray) 物理现象被发现 (并非 为了 MS) 1918年 世界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥 大学实验室出现(扇型磁场MS) 1943年 世界上第一台商业质谱仪 1953年 四极杆质量分析器质谱仪 1955年 飞行时间质量分析器质谱仪 1960s 开发GC/MS 2008 Waters Corporation 15 MS的历史 60s-70s 大气压电离(APcI)源被发现(但并未被广泛 应用) 70s-80s 开始广泛研究 LC/MS 1979年 传送带式 LC/MS 接口成为商业产品 1982年 离子束LC/MS接口出现 1984年 第一台电喷雾 MS仪宣告诞生 1988年 电喷雾离子源 MS 首次应用于蛋白质的分析 . 2008 Waters Corporation 16 质谱的分类 按离子源的种类分 EI (电子轰击源)质谱(常用于GC-MS系统) API (大气压电离源)质谱(常用于LC-MS系统) MALDI(基质辅助激光解吸电离源)质谱(常用于生物大分子分析) 按质量分析器的种类分 四极杆(Quadrupole)质谱 离子阱(Ion Trap)质谱 飞行时间(Time of Flight,TOF)质谱 扇形磁场(Magnetic Sector)质谱 2008 Waters Corporation 17 什么是液质联用(LC/MS) LC/MS=LC+MS 2008 Waters Corporation 18 LC/MS中的液相色谱 High Performance Liquid Chromatography(HPLC) -高效液相色谱 Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC) -超高效液相色谱 液质联用的前提和基础=进样+分离 根据化合物的化学特性分离样品(比如极性化合物，非极性化合物， 酸性化合物，碱性化合物等等) LC的特点:分离技术 分离效率高 流动相参与分离 连续流出,峰宽有限 有时需要使用缓冲盐提高分离度 高压环境工作( 1000 psi) 2008 Waters Corporation 19 LC/MS中的质谱 Mass Spectrometry-质谱 质量是物质固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱 分析物被转化为气相离子而被分析 这些离子按其质荷比 (m/z)被分离而被检测 质谱图即是相关的离子流对m/z的图 MS的特点 灵敏度高 定性/定量本领高 脉冲扫描采集数据 高真空环境工作 溶剂参与反应(API电离源) 2008 Waters Corporation 20 LC/MS 数据形式 TIC色谱 m/z 100150200250300350 91 107 123145 175 191 323 79 201 341 402 384 366 M -18 M+ M -36 M -79 M -162 241 保留时间 TIC 2008 Waters Corporation 21 为什么使用 LC/MS? 丰富的结构信息(1) Min 12141618202224262830 1 2 4 3 5 7 500600700800 695 100 200 300 400 500 600 700 800 219.0 696.7 EI HO CH CH O 22 2 C O CH CH 22 NHC O Naugard API 2008 Waters Corporation 22 为什么使用 LC/MS? 极高的灵敏度 (2) 2008 Waters Corporation 23 5 个数量级的动态线性范围 (0.1pg - 1000pg) 实验系数= 0.9975,样品:磺胺二甲氧哒嗪上柱分析 为什么使用 LC/MS? 极佳的定量结果极佳的定量结果( (3)3) 2008 Waters Corporation 24 为什么使用 LC/MS? 进一步增加HPLC的分离能力(4) 如果让您来选择 ，您满意那一种 分离度? 2008 Waters Corporation 25 为什么使用 LC/MS? 解决无UV吸收样品分析问题(5) LC_MS_OK 5.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.00 Time0 100 % 0 100 % TaiyuanLC_MS52: Diode Array 254 1.00Da 1.71e6 x36 TaiyuanLC_MS51: Scan AP+ BPI 8.29e4 5.844.81 2.91 2.27 2.04 4.00 7.22 9.12 11.59 9.98 14.87 13.15 19.12 17.40 25.16 21.42 22.52 33.78 33.3228.84 26.82 35.04 38.2639.52 2008 Waters Corporation 26 两种 LC/MS 系统示意图 液质联用接口 至真空 离子源质量分析器 检测器 离子源 液质联用接口 至真空 质量分析器检测器 高真空部分 高真空部分 样品引入 样品引入 EI电离源 API电离源 2008 Waters Corporation 27 LC/MS联用的难点 进样方式比较 对真空泵的要求 * (liters/sec) 毛细管 GC, 1mL/min (气体) 400 微柱 LC, 10 L/min 5,000 填充柱 LC, 1 mL/min 50,000 *为了保持 3 x 10-6 torr (4 x 10-6 mbar)的真空 LC/MS 接口必须使LC流出的液流达到 MS 可接受的压力(10-5 - 10-6 torr) 同时以极小的谱带展宽尽可能多地输送样品离子到MS 2008 Waters Corporation 28 LC/MS联用关键技术接口 液相色谱的出口情况: 从液相色谱流出的组分存在于大气压条件下的溶液之中 质谱的入口情况: 在高真空工作条件下的质谱仅接受气相离子 因此液质联用的接口必须完成三个转变: 物态转变: 液态 - 气态 带电状态: “中性” - 离子 真空变化: 760 torr - 10-5-10-8 torr(乇) 要求:雾化,去溶剂和电离同时完成 2008 Waters Corporation 29 API LC/MS 的 Z-Spray接口 2008 Waters Corporation 30 Z-Spray 接口技术 第 1 次进样 第 509次进样 25小时 苯海拉明, 10mM 磷酸盐缓冲液 2008 Waters Corporation 31 MS的电离技术 质量过滤器 样品引入 2008 Waters Corporation 32 质谱的种类及相关联用技术 GC LC CE Flow Inj Probe PB/EI ESI APCI TSP FAB MALDI Quadrupole Magnetic Sector Time of Flight Ion Trap FT-MS Electron Multiplier Photomultiplier Microchannel Plate Turbo Mechanical 离子分离模式 质量分析器 离子检测 数据的采集及处理 样品的引入模式 溶剂的去除或抽 真空方式 质子化模式 2008 Waters Corporation 33 同一个样品的质谱图可能不一样 2008 Waters Corporation 34 传统的样品电离方式：EI源 EI源：电子轰击电离源 可得经典的质谱谱图 可查询质谱库，质谱结果可用工 业标准谱库检索，是绝对的化合 物鉴定 相对易得，耐受性好 谱图可解析,阐明结构信息 但是,电离效率较差，测定的分子 量范围、流速范围有限；可测的 化合物类型有限 M 样品进入 灯丝 集电极 离子聚 焦透镜 离子去 分析器 - - 挡板 + 2008 Waters Corporation 35 EI 谱库:几十年积累的宝贵财富 High Res Mass Spec, Brown, Kamano, Pettit, Org. Mass Spec., 1972 Waters Integrity LC/MS System, Pfizer, 1996 2008 Waters Corporation 36 大气压电离 (API) 技术 电喷雾电离 Electrospray Ionization ESI 大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization - APCI 2008 Waters Corporation 37 电喷雾(ESI) 离子化过程 电喷雾离子化可分为三个过程: 形成带电小液滴 溶剂蒸发和小液滴碎裂 最终形成气相离子 2008 Waters Corporation 38 ESI的特点 低分子量化合物一般产生单电荷离子(失去或得到一个质子) 高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子 几乎没有碎片离子 可能生成加合物和/或多聚体 常见的是溶剂加合物和NH4+(M+18), Na+(M+23),和K+(M+39) 加合 物 灵敏度取决于化合物本身和基质 2008 Waters Corporation 39 ESI+ 电离模式 灭多虫 MW 162 产生 M+H+ 准分子离子峰 2008 Waters Corporation 40 大气压化学电离 (APCI)过程 大气压化学电离可分为以下两个步骤: 快速蒸发 气相化学电离(电晕放电) 2008 Waters Corporation 41 APCI的特点 一般而言, 只生成单电荷离子 几乎没有碎片离子 可能生成加合物和/或多聚体; 一般是溶剂加合物及NH4+ (M+18), Na+ (M+23), 和 K+(M+39)加合物 基质影响较小 (相对于ESI), 质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的影 响 2008 Waters Corporation 42 API与传统电离技术的区别 液质联用接口 至 真空 离子源质量分析器 检测器 离子源 液质联用接口 至 真空 质量分析器检测器 高真空部分 高真空部分 样品引入 样品引入 EI电离源 API电离源 2008 Waters Corporation 43 不同电离技术的适用范围 分子量 化合物极性 API (APcI-ESI) Particle Beam (EI-CI) GC/MS (EI-CI) 非极性极性(离子) 102 103 104 105 APPI 2008 Waters Corporation 44 液质联用系统的质量分析器 质量过滤器 样品引入 2008 Waters Corporation 45 A. 磁质谱 通过磁场和电场来传输和选择离子 + + + 离子源 电场 磁场 2008 Waters Corporation 46 B. 飞行时间质谱 所有离子一同起跑 质量小的跑得快 时间分辨 + 离 子 源 2008 Waters Corporation 47 Source Detector Nonresonant Ion Resonant Ion dc and Rf voltages C. 四极杆质量分析器 被分析离子由DC和RF电压控制 2008 Waters Corporation 48 D. 离子阱 原理与四极杆类似 离子被 RF & DC 电场所储 存 扫描电场可以释放特定的 m/z离子 2008 Waters Corporation 49 分析器 m/z范围 分辨率 质量精度 动态范围 真空 四极杆 103 103 0.1%105 10-5 离子阱 103 103-104 0.1% 104 10-3 飞行时间 1